色譜分析法和氣相色譜法學(xué)習(xí)培訓(xùn)模板課件

1、色譜分析法色譜法導(dǎo)論氣相色譜法本章重點(diǎn)： 1. 理解色譜分離的基本原理； 2. 掌握色譜法的基本概念和術(shù)語(yǔ)； 3. 掌握色譜法的定性和定量方法; 4. 了解氣相液相色譜的分析原理、儀器結(jié)構(gòu) 和在食品分析中的應(yīng)用.描述: 色譜法是一種分離技術(shù). 混合物最有效的分離、分析方法. 色譜法分離發(fā)生在色譜柱上. 可用于檢測(cè)大多數(shù)有機(jī)物質(zhì).1. 色譜法導(dǎo)論 1906年,俄國(guó)植物學(xué)家茨維特 對(duì)植物葉的色素成分進(jìn)行研究 時(shí),使用右圖裝置: 將植物葉子的萃取物倒入填有碳酸鈣的直立玻璃管內(nèi),然后加入石油醚使其自由流下,結(jié)果色素中各組分互相分離形成各種顏色的譜帶.這種分離物質(zhì)的方 法因此得名為色譜法.1.1 概述1

2、.2 色譜法分類(lèi) (1)氣相色譜：流動(dòng)相為氣體（稱(chēng)為載氣）。 按固定相的不同又分為：氣固色譜和氣液色譜 按色譜柱可分為：填充柱色譜和毛細(xì)管柱色譜；(2)液相色譜：流動(dòng)相為液體（稱(chēng)為淋洗液）。 按固定相的不同分為：液固色譜和液液色譜。 1.3 色譜法的特點(diǎn)（1）分離效率高 復(fù)雜混合物，有機(jī)同系物、異構(gòu)體、手性異構(gòu)體。高效液相色譜分離復(fù)雜單糖（2） 靈敏度高 可以檢測(cè)出g.g-1(10-6)級(jí)甚至ng.g-1(10-9)級(jí)的物質(zhì)量。（3） 分析速度快 一般在幾分鐘或幾十分鐘內(nèi)可以完成一個(gè)試樣的分析。（4） 應(yīng)用范圍廣 氣相色譜：沸點(diǎn)低于400、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的各種有機(jī)或無(wú)機(jī) 試樣的分析。 液相色譜：高沸

3、點(diǎn)、熱不穩(wěn)定、生物試樣的分離分析。 （一）組分分離 當(dāng)流動(dòng)相中樣品混合物經(jīng)過(guò)固定相時(shí)，就會(huì)與固定相發(fā)生作用，由于各組分在性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上的差異，與固定相相互作用的類(lèi)型、強(qiáng)弱也有差異，因此在同一推動(dòng)力的作用下，不同組分在固定相滯留時(shí)間長(zhǎng)短不同，從而按先后不同的次序從固定相中流出。1.4 色譜曲線圖及有關(guān)術(shù)語(yǔ)（二）色譜峰 由檢測(cè)器輸出的信號(hào)強(qiáng)度對(duì)時(shí)間作圖，所得曲線稱(chēng)為色譜流出曲線。曲線上突起部分就是色譜峰。 基線：在實(shí)驗(yàn)操作條件下，色譜柱后沒(méi)有樣品組分流出時(shí)的流 出曲線稱(chēng)為基線，穩(wěn)定的基線應(yīng)該是一條水平直線。峰高：色譜峰頂點(diǎn)與基線之間的垂直距離，以（h）表示。（三） 保留時(shí)間tR 試樣從進(jìn)樣到柱后出現(xiàn)

4、峰極大點(diǎn)時(shí)所經(jīng)過(guò)的時(shí)間，稱(chēng)為保留時(shí)間，如下圖。 組分在色譜柱中的保留時(shí)間tR包含組分通過(guò)柱子的時(shí)間和組分在固定相中滯留的時(shí)間，所以tR實(shí)際上是組分在固定相中保留的總時(shí)間。進(jìn)樣tR（四） 分離度 分離度是描述難分離物質(zhì)對(duì)的實(shí)際分離程度。 柱效較高，K(分配系數(shù))較大,完全分離； K不是很大，柱效較高，峰較窄，基本上完全分離；柱效較低，K較大,但分離的不好； K小，柱效低，分離效果更差。1.5 定性和定量分析1 定性分析 在色譜條件一定時(shí)，任何一種物質(zhì)都有確定的保留時(shí) 間。 通過(guò)比較已知物和未知物的保留參數(shù)或在固定相 上的位置，即可確定未知物是何種物質(zhì)。未知樣品圖已知標(biāo)樣圖利用純物質(zhì)定性的方法 利

5、用保留值定性：通過(guò)對(duì)比試樣中具有與純物質(zhì)相同保留值的色譜峰，來(lái)確定試樣中是否含有該物質(zhì)及在色譜圖中的位置。不適用于不同儀器上獲得的數(shù)據(jù)之間的對(duì)比。 利用加入法定性：將純物質(zhì)加入到試樣中，觀察各組分色譜峰的相對(duì)變化。2 定量分析 在一定色譜條件下，組分i的質(zhì)量（mi）與檢測(cè)器響應(yīng)訊號(hào)（峰面積Ai）成正比。 色譜定量分析的依據(jù)iAiiAfm=3 定量分析方法 (1)外標(biāo)法(標(biāo)準(zhǔn)曲線法)：將欲測(cè)組分的純物質(zhì)配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行色譜分析，以峰面積對(duì)濃度作圖。測(cè)得樣品的信號(hào)后從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出對(duì)應(yīng)濃度。1 2 3 4 5 6 SampleAmmiAi（2） 歸一化法 將試樣中所有組分的含量之和按1

6、00%計(jì)算，以它們相應(yīng)的色譜峰面積或峰高為定量參數(shù)，通過(guò)下式計(jì)算各組分的含量：%100%1=niAisiAisiifAfAm前提：樣品中所有組分都有響應(yīng)（出峰）1mg樣品溶解后，經(jīng)過(guò)高效液相色譜分析后得到4個(gè)峰，經(jīng)驗(yàn)證樣品中只有4種物質(zhì)，那么每種物質(zhì)所占比例與對(duì)應(yīng)峰面積所占比例一致。即 M1=1mg A1/(A1+A2+A3+A4)驗(yàn)證方法：薄層色譜法最常用。二極管陣列檢測(cè)器3124練習(xí)題：1.色譜分離主要發(fā)生在 （ ）上。 1.按照固定相的物態(tài)不同，可將液相色譜法分為（ ）和（ ），前者的固定相為固體，后者的固定相為液體。3. 是色譜分析中用于描述難分離物質(zhì)對(duì)的實(shí)際分離程度。4.色譜分析法的

7、定量方法有 、和 ， 其中 需要所有物質(zhì)都出峰。5.色譜分析法的定性依據(jù)和定量依據(jù)分別是什么？液固色譜液液色譜分離度標(biāo)準(zhǔn)曲線法歸一化法歸一化法色譜柱保留時(shí)間（或出峰時(shí)間）；峰面積。2 氣相色譜法 氣相色譜儀氣相色譜儀主要包括五部分：1、載氣系統(tǒng)2、進(jìn)樣系統(tǒng)3、分離系統(tǒng) 4、溫控系統(tǒng)5、檢測(cè)系統(tǒng)2.1 氣相色譜儀的組成壓縮氣體鋼瓶減壓閥、穩(wěn)壓閥凈化器檢測(cè)器色譜柱汽化室尾氣1、載氣系統(tǒng)氣相色譜對(duì)載氣的基本要求：（1）純凈通過(guò)活性炭或分子篩凈化器，除去載氣中的水分、氧等有害雜質(zhì)。（2）穩(wěn)定采用穩(wěn)壓閥或雙氣路方式：載氣（3）常用的載氣：氮?dú)鈿錃夂?氬氣2、進(jìn)樣系統(tǒng) 進(jìn)樣裝置和汽化室 進(jìn)樣通常用微量注

8、射器和進(jìn)樣閥將樣品引入。液體樣品引入后需要瞬間汽化。汽化在汽化室進(jìn)行。 進(jìn)樣量不能太小（大于檢測(cè)限），也不能太大（會(huì)使峰型拖尾）。 進(jìn)樣速度要快。 液體進(jìn)樣裝置和汽化室 液體進(jìn)樣器：注射器載氣入口加熱塊接色譜柱汽化室：使樣品瞬間汽化而又不分解。 接色譜柱對(duì)汽化室的要求：（1）體積小；（2）熱容量大；（3）對(duì)樣品無(wú)催化作用3.分離系統(tǒng)色譜柱:色譜儀的核心部件,其作用是分離樣品。 主要有兩類(lèi)：填充柱和毛細(xì)管柱。1）填充柱 填充柱由不銹鋼制成，內(nèi)裝固定相，一 般內(nèi)徑為24 mm，長(zhǎng)13m。填充柱的形狀有U 型和螺旋型二種. 當(dāng)流動(dòng)相中攜帶的混合物流經(jīng)固定相時(shí)，其與固定相發(fā)生相互作用。由于混合物中各組

9、分在性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上的差異，與固定相之間產(chǎn)生的作用力的大小、強(qiáng)弱不同，隨著流動(dòng)相的移動(dòng)，混合物在兩相間經(jīng)過(guò)反復(fù)多次的分配平衡，使得各組分被固定相保留的時(shí)間不同，從而按一定次序由固定相中流出。2）毛細(xì)管柱 毛細(xì)管柱又叫空心柱，分為涂壁，多孔層和涂載體空心柱。涂壁空心柱是將固定液均勻地涂在內(nèi)徑0.l0.5 mm的毛細(xì)管內(nèi)壁而成，毛細(xì)管材料可以是不銹鋼，玻璃或石英。 與填充往相比，其分離效率高、分析速度塊、樣品用量小，但柱容量低、要求檢測(cè)器的靈敏度高，并且制備較難。4.溫控系統(tǒng) 溫度是色譜分離條件的重要選擇參數(shù)； 氣化室、分離室、檢測(cè)器三部分在色譜儀操作時(shí)均需控制 溫度. 氣化室：保證液體試樣瞬間氣化，

10、一般比分離室溫度高50 - 100度； 分離室：準(zhǔn)確控制分離需要的溫度。當(dāng)試樣復(fù)雜時(shí)，分離 室溫度需要按一定程序控制溫度變化，各組分在 最佳溫度下分離； 檢測(cè)器：保證被分離后的組分通過(guò)時(shí)不在此冷凝； 分離室的溫度控制方式有恒溫和程序升溫二種。 對(duì)于沸點(diǎn)范圍很寬的混合物，往往采用程序升溫法進(jìn)行分析。程序升溫指在一個(gè)分析周期內(nèi)柱溫隨時(shí)間由低溫向高溫作線性或非線性變化，以達(dá)到用最短時(shí)間獲得最佳分離的目的。程序升溫:恒溫和程序升溫分析烴類(lèi)化合物5.檢測(cè)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) 這個(gè)系統(tǒng)是指樣品經(jīng)色譜柱分離后，各成分按保留時(shí)間不同，順序地隨載氣進(jìn)入檢測(cè)器，檢測(cè)器把進(jìn)入的組分按時(shí)間及其濃度或質(zhì)量的變化，轉(zhuǎn)化成易于測(cè)

11、量的電信號(hào)，經(jīng)過(guò)必要的放大傳遞給記錄儀或計(jì)算機(jī)，最后得到該混合樣品的色譜流出曲線及定性和定量信息。1 熱導(dǎo)檢測(cè)器（TCD）(1)熱導(dǎo)檢測(cè)器的結(jié)構(gòu)池體: 一般用不銹鋼制成.熱敏元件：電阻率高、電阻溫度系數(shù)大、且價(jià)廉易加工的鎢 絲制成。參考臂：僅允許純載氣通過(guò)，通常連接在進(jìn)樣裝置之前。測(cè)量臂：需要攜帶被分離組分 的載氣流過(guò)，則連接在 緊靠近分離柱出口處。2.2 常用檢測(cè)器(2) 檢測(cè)原理平衡電橋鎢絲通電，加熱與散熱達(dá)到平衡后，兩臂電阻值： R參=R測(cè) ; R1=R2 則： R參R2=R測(cè)R1 無(wú)電壓信號(hào)輸出,記錄儀走直線（基線）。 進(jìn)樣后: 載氣攜帶試樣組分流過(guò)測(cè)量臂而這時(shí)參考臂流過(guò)的仍是純載氣，

12、使測(cè)量臂的溫度改變，引起電阻的變化，測(cè)量臂和參考臂的電阻值不等，產(chǎn)生電阻差，R參R測(cè) 則： R參R2R測(cè)R1 這時(shí)電橋失去平衡，a、b兩端存在著電位差，有電壓信號(hào)輸出。信號(hào)與組分濃度相關(guān)。記錄儀記錄下組分濃度隨時(shí)間變化的峰狀圖形。不同氣體有不同的熱導(dǎo)系數(shù) 某些氣體與蒸氣的熱導(dǎo)系數(shù)（），單位：J / cms 2. 氫火焰離子化檢測(cè)器（FID） 氫火焰離子化檢測(cè)器是以氫氣和空氣燃燒的火焰作為能源，利用含碳有機(jī)物在火焰中燃燒產(chǎn)生離子，在外加的電場(chǎng)作用下，使離子形成離子流，根據(jù)離子流產(chǎn)生的電信號(hào)強(qiáng)度，檢測(cè)被色譜柱分離出的組分。特點(diǎn): 1, 能檢測(cè)大多數(shù)含碳有機(jī)化合物； 2, 靈敏度很高，比熱導(dǎo)檢測(cè)器的

13、靈敏度高約103倍； 檢出限 低，可達(dá)10-12gS-1； 3, 是目前應(yīng)用最廣泛的色譜檢測(cè)器 之一。缺點(diǎn)： 不能檢測(cè)永久性氣體、水、一氧化碳、二氧化碳、氮的氧化物、硫化氫等物質(zhì)。3.電子捕獲檢測(cè)器(ECD) 特點(diǎn):電子捕獲檢測(cè)器是一種選擇性很強(qiáng)的檢測(cè)器, 目前分析 痕 量電負(fù)性有機(jī)物最有效 的檢測(cè)器，對(duì)具有電負(fù)性物質(zhì)（如含鹵素、硫、磷、氰等的物質(zhì)）的檢測(cè)有很高靈敏度（檢出限約1O-14g/ml）。缺點(diǎn): 線性范圍窄，只有103左右，且響應(yīng)易受操作條件的影響，重現(xiàn)性較差。應(yīng)用:電子捕獲檢測(cè)器已廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥殘留量、大氣及水質(zhì)污染分析，以及生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥物學(xué)和環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域中。4.火焰光度檢

14、測(cè)器(FPD) 火焰光度檢測(cè)器，又稱(chēng)硫、磷檢測(cè)器，它是一種對(duì)含磷、硫有機(jī)化合物具有高選擇性和高靈敏度的質(zhì)量型檢測(cè)器，檢出限可達(dá)10-12gS-1（對(duì)P）或10-11gS-1（對(duì)S）。 這種檢測(cè)器可用于大氣中痕量硫化物以及農(nóng)副產(chǎn)品，水中的毫微克級(jí)有機(jī)磷和有機(jī)硫農(nóng)藥殘留量的測(cè)定。2.3 檢測(cè)器性能評(píng)價(jià)指標(biāo)靈敏度（S） ： S 表示單位質(zhì)量的物質(zhì)通過(guò)檢測(cè)器時(shí)，產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào)的大小。S值越大，檢測(cè)器（也即色譜儀）的靈敏度也就越高。檢測(cè)信號(hào)通常顯示為色譜峰，則響應(yīng)值也可以由色譜峰面積（A）除以試樣質(zhì)量求得： S = A / m檢測(cè)限（D）： 恰能產(chǎn)生相當(dāng)于3倍噪音（3RN）的信號(hào)時(shí)，單位時(shí)間內(nèi) 進(jìn)入檢測(cè)

15、器的量。 D= 3RN / S 無(wú)論哪種檢測(cè)器，檢出限都與靈敏度成反比，與噪音成正比。檢出限不僅決定于靈敏度，而且受限于噪聲，所以它是衡量檢測(cè)器性能好壞的綜合指標(biāo)。2.4 氣相色譜法在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用 食品中呈香呈味物質(zhì)的檢測(cè)。 香精香料的檢測(cè)。 食品中農(nóng)藥殘留量檢測(cè)。 其他小分子油脂等易揮發(fā)成分的檢測(cè)。檢測(cè)器: FPD（火焰光度檢測(cè)器）檢測(cè)器: FID（氫火焰離子化檢測(cè)器）1. 樣品前處理 查閱資料 拿到一個(gè)檢測(cè)任務(wù)，首先要分析檢測(cè)對(duì)象的理化特性，使用合適的方法提取分離出來(lái)，制備成檢測(cè)樣品。 2. 色譜條件選擇 需要考慮的地方：a. 成分是否復(fù)雜；b. 極性的大小。 色譜柱：填充柱，毛細(xì)管柱

16、。樣品成分組成簡(jiǎn)單使用填充柱； 成分復(fù)雜，結(jié)構(gòu)接近，沸程范圍寬，選擇毛細(xì)管柱。 固定相（色譜柱，相似相溶原理）：非極性，弱極性，極性 流動(dòng)相（與固定相匹配）：能溶解樣品成分，但是不能溶解 固定相。 檢測(cè)器：TCD，F(xiàn)ID，F(xiàn)PD，ECD，MS等。 2.5 氣相色譜分析方法與條件的選擇 3. 確定儀器初始操作條件 儀器配置確定以后，可開(kāi)始確定儀器初始操作條件，進(jìn)行常試性分離。條件主要包括進(jìn)樣量、進(jìn)樣口溫度、色譜柱溫度、檢測(cè)器溫度和載氣流速。 先以標(biāo)準(zhǔn)物溶液來(lái)確定初始條件。 4. 確定最佳條件 再以待測(cè)溶液來(lái)調(diào)試最佳條件。 要求：a.保證待測(cè)物質(zhì)完全分離; b.保證所有組分完全流出色譜柱； c.分析時(shí)間越短越好。5. 色譜柱的維護(hù) a. 新裝的色譜柱在使用前都必須老化。用載氣在高溫條 件下沖洗至少 1h 以上。 b. 色譜柱暫時(shí)不用時(shí)，應(yīng)該卸載下來(lái)，兩端封閉保存。 c. 檢測(cè)完后應(yīng)將色譜柱溫度降到50度以下，再關(guān)電源和 載氣。 d.