SARS病原與檢測講座

1、SARS病原與檢測講座引起肺炎的病原體細菌 肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、甲型溶血性鏈球菌、肺炎克雷白桿菌、 流感嗜血桿菌、變形桿菌、銅綠假單胞菌、腸桿菌屬一些細菌、變形桿 菌、軍團菌、棒狀桿菌、梭狀桿菌等病毒 腺病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒、副流感病毒、麻疹病毒、巨細胞 病毒、單純皰疹病毒、漢坦病毒、禽流感病毒、尼巴病毒、冠狀病毒等支原體 肺炎支原體衣原體 肺炎衣原體、鸚鵡熱衣原體真菌 白色念珠菌、曲菌、放線菌等其它 立克次體（Q熱立克次體等）、弓形蟲（鼠弓形蟲等)、原蟲（卡氏肺孢 子蟲等）、寄生蟲類（肺包蟲、肺吸蟲、肺血吸蟲等）冠狀病毒冠狀病毒科（Coronaviridae）單鏈RNA，包

2、括冠狀病毒屬和環(huán)曲病毒屬1937年從小雞體內(nèi)分離到傳染性支氣管炎病毒（IBV)1951年，鼠肝炎病毒（MHV)1965年，從人上呼吸道感染患者分離到B814病毒1966年，分離到229E病毒（人冠狀病毒HCoV-229E）1968年，電鏡觀察病毒形態(tài)，命名冠狀病毒1975年，ICTV命名冠狀病毒科冠狀病毒屬血清分學(xué)分組及所致疾病血清分組 病毒種和株 宿主 呼吸道疾病 腸道疾病 肝炎 神經(jīng)系統(tǒng)感染 其它 HCoV -229E （人冠狀病毒229E株） 人 ？ TGEV（豬傳染性胃腸炎病毒） 豬 I CCoV（犬冠狀病毒） 狗 FECoV（貓冠狀病毒） 貓 FIPV （貓傳染性腹膜炎病毒） 貓 R

3、bCoV（兔冠狀病毒） 兔 HCoV-OC43 （人冠狀病毒OC43株） 人 ？ ？ MHV（鼠肝炎病毒） 小鼠 II BCoV（牛冠狀病毒） 牛 TCoV（火雞冠狀病毒） 火雞 HEV 豬 III TCoV （火雞冠狀病毒） 火雞 IBV 雞 SARS-CoV 引自 賀福初主編. 嚴(yán)重急性呼吸綜合征.科學(xué)出版社，2003.SARS病原體的發(fā)現(xiàn)與確證2002年11月，廣東出現(xiàn)SARS病人2003年3月15日，WHO組織國際研究網(wǎng)絡(luò)實驗室3月18日20日，觀察到副粘病毒顆粒以及獲得相關(guān)序列3月21日，猴腎細胞培養(yǎng)獲得病毒分離物，并排除甲乙型流感病毒病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒1、2、3型、腺

4、病毒、鼻病毒、腸道病毒、人間質(zhì)肺炎病毒等，報告發(fā)現(xiàn)衣原體顆粒3月22日，發(fā)現(xiàn)冠狀病毒樣顆粒3月23日，明確發(fā)現(xiàn)冠狀病毒顆粒和核酸片段，開始靈長類動物實驗3月244月11日，獲得更多的SARS病毒分離物、核酸片段序列，抗體檢測4月12日、14日，SARS冠狀病毒的全基因組序列公布4月16日，WHO宣布確認一種變異冠狀病毒引起SARS4月17日，利用動物實驗按科赫原則確定SARS病原體SARS coronavirus“SARS的研究速度令人驚訝。由于全世界各國實驗室之間非同尋常的合作，我們現(xiàn)在肯定地知道誰是SARS的元兇。” （WHO傳染病規(guī)劃執(zhí)行主任David Heymann 博士）2003,3

5、48:1953-1966SARS CoV基因組2003,348:1967-1976.冠狀病毒顆粒結(jié)構(gòu)From N Engl J Med, 2003,348:1948-1951.2003,348:1953-1966SARS病毒變異變異的意義？變異的方向？追蹤變異的意義病原基本特征結(jié)合流行病學(xué)分析尋找傳播鏈預(yù)測新的流行？疫苗設(shè)計 標(biāo)本采集、保存與運輸種類 最佳采集時間 采樣 用途咽拭子與 發(fā)熱早期 消毒的帶塑料桿滌綸織物或人造纖維拭子簽 鼻咽拭子 含2ml病毒保存液（或等滲鹽溶液、組織 病毒分離、PCR 培養(yǎng)液等）的旋 蓋塑料凍存管，冷藏運輸 鼻咽清洗物 發(fā)熱早期 導(dǎo)管，無菌生理鹽水 病毒分離、P

6、CR漱口液 發(fā)熱早期 5-10ml無菌鹽水，置無菌旋 蓋塑料離心管 病毒分離、PCR痰液 無時間限制 無菌平皿，拭子簽刮取至含5ml運輸液的 病毒分離、PCR 旋 蓋塑料離心管下呼吸道標(biāo)本 無時間限制 支氣管灌洗、氣管吸取液置旋 蓋塑料離心管 病毒分離、PCR糞便 一周后檢出率高 5-10g，旋 蓋塑料離心管 病毒分離、PCR尿液 一周后檢出率高 10-20ml 旋 蓋塑料離心管 病毒分離、PCR血液 急性期和恢復(fù)期 抗凝管和析出血清用的血液采集管 急性期全血可作病毒 分離、PCR，血清作 抗體檢測尸檢標(biāo)本 采集肺、氣管、腎、脾、肝、心臟、腦、 病毒分離、PCR、 淋巴結(jié)等，樣品運輸液為Han

7、k氏液、Eagle液 電鏡觀察 等（加青、鏈霉素和制霉菌素），立即凍存； 福爾馬林固定者室溫保存標(biāo)本運輸與儲存臨床采集的標(biāo)本，宜盡快送至專業(yè)檢測實驗室，在運送抵達前的24-48小時內(nèi)，標(biāo)本可4C冷藏（非福爾馬林固定的尸檢標(biāo)本冷凍保存）。檢測實驗室內(nèi)長期保存，血液標(biāo)本-20 C冷凍保存，其它-70 C保存。標(biāo)本的生物安全操作采集與運輸 標(biāo)本管：螺旋蓋、密封，貼生物危險性提示標(biāo)簽 運輸過程中保證密封處理任何可能產(chǎn)生氣溶膠的操作均應(yīng)在生物安全柜內(nèi)進行。操作者個人防護。 二級生物安全（BSL-2）裝備內(nèi)進行的操作： 血清和血標(biāo)本的各種常規(guī)診斷性檢查。 三級生物安全（BSL-2）室內(nèi)進行的操作： SAR

8、S病原體分離培養(yǎng)、濃縮 標(biāo)本中核酸提取 動物接種醫(yī)務(wù)人員對SARS或疑似病人采樣時的個人防護 口罩（符合N,R,P95/99/100, FFP2/3標(biāo)準(zhǔn)）、護目鏡、手套、隔離衣在沒有把握控制病毒泄漏（包括產(chǎn)生氣溶膠）的情況下，不能進行標(biāo)本的操作SARS檢測及結(jié)果解釋檢測方法抗體（IgG/IgM)： ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbant Assay) 酶聯(lián)免疫吸附實驗 IFA (Indirect ImmunoFluorescence Assay ) 間接免疫熒光實驗核酸（RNA）： RT-PCR（Reversed transcription - Ploymeras

9、e Chain Reaction） Nested PCR real - time PCR gene chip病毒分離 細胞培養(yǎng)SARS檢測及結(jié)果解釋解釋（Interpretation of test results）陽性結(jié)果- 對于PCR和細胞培養(yǎng)：SARS病人正在或近期被SARS病毒感染。- 對于ELISA和IFA ：正在或近期被SARS病毒感染，或既往感染（需注意不同檢測方法的特異性）陰性結(jié)果 - 病人沒有被SARS病毒感染，而是由其它傳染性（病毒、細菌、真菌）或非傳染性因素。 - 實驗結(jié)果不正確（“假陰性”）。目前的方法需要提高靈敏度。 - 對于PCR和細胞培養(yǎng)：病人標(biāo)本并沒有在病毒或其

10、遺傳物質(zhì)出現(xiàn)的時段內(nèi)采集。病毒及其遺傳物質(zhì)僅存在一段較短的時期（依賴于不同標(biāo)本種類）。 - 對于ELISA和IFA：標(biāo)本收集過早，抗體還沒有產(chǎn)生。(檢測SARS病毒結(jié)果為陰性并不就表示病人沒有感染SARS病毒)Laboratory case definition of SARS A person with symptoms and signs that are clinically suggestive of SARS AND with positive laboratory findings for SARS-CoV based on one or more of the following

11、 diagnostic criteria:a) PCR positive for SARS-CoV PCR positive using a validated method from: At least two different clinical specimens (eg nasopharyngeal and stool) OR The same clinical specimen collected on two or more occasions during the course of the illness (eg sequential nasopharyngeal aspira

12、tes) OR Two different assays or repeat PCR using a new RNA extract from the original clinical sle on each occasion of testing. b) Seroconversion by ELISA or IFA Negative antibody test on acute serum followed by positive antibody test on convalescent phase serum tested in parallel OR Fourfold or grea

13、ter rise in antibody titre between acute and convalescent phase sera tested in parallel. c) Virus isolationIsolation in cell culture of SARS-CoV from any specimen AND PCR confirmation using a validated method. Testing should only be undertaken in a national or regional reference laboratory as per WH

14、O recommendations (Use of laboratory methods for SARS diagnosis ). WHO will assist resource poor countries to confirm their first cases of SARS through laboratory collaboration.Alert, verification and public health management of SARS in the post-outbreak period -WHORecommendations on interpretation

15、of laboratory results Positive SARS diagnostic test findings a) Confirmed positive PCR for SARS virus: -at least 2 different clinical specimens (eg nasopharyngeal and stool) OR - the same clinical specimen collected on 2 or more days during the course of the illness (eg 2 or more nasopharyngeal aspi

16、rates) OR-2 different assays or repeat PCR using the original clinical sle on each occasion of testing b) Seroconversion by ELISA or IFA:-negative antibody test on acute serum followed by positive antibody test on convalescent serum OR- four-fold or greater rise in antibody titre between acute and c

17、onvalescent phase sera tested in parallel c) Virus isolation:-Isolation in cell culture of SARS-CoV from any specimen; plus PCR confirmation using a validated method. Confirmation of positive PCR -The PCR procedure should include appropriate negative and positive controls in each run, which should y

18、ield the expected results: 1 negative control for the extraction procedure and 1 water control for the PCR run 1 positive control for extraction and PCR run the patient sle spiked with a weak positive control to detect PCR inhibitory substances (inhibition control) -If a positive PCR result has been

19、 obtained, it should be confirmed by:repeating the PCR using the original sle ORhaving the same sle tested in a second laboratory. Amplifying a second genome region could further increase test specificityUse of laboratory methods for SARS diagnosis -WHORecommendations on interpretation of laboratory

20、 results Recommendations for laboratories testing for SARSRecommendations for laboratories testing for SARS Reference laboratories should be identified at national level.PCR testing Laboratories testing for SARS by PCR should already have experience with PCR testing. They should adopt quality contro

21、l procedures and identify a partner laboratory in their country or among the WHO collaborating research laboratories listed in Multi-centre Collaborative Network: Laboratories testing for SARS to cross-check their positive findings.Laboratories performing SARS specific PCR tests should adopt strict

22、criteria for confirmation of positive results , especially in low prevalence areas, where the positive predictive value might be lower.A PCR-kit for SARS is commercially available, including internal controls. PCR primers and procedures have been published and can be adapted by laboratories. Positive control RNA is available from the Bernhard-Nocht Institute in Hamburg, Germany.The sensitivity of PCR tests for SARS depends on the specimen and the time of testing during the course