石蠟切片的制作程序

1、石蠟切片的制作程序1、病料的采集：采集病料要及時，以防組織變質(zhì)發(fā)生自溶。病理組織材料要采取病變典型突出的部分，最好選病變與健康組織的交界處，以識別和探討病變的發(fā)生和發(fā)展。組織塊一般不宜過大，以35mm35mm1015mm為宜。過大過厚的組織塊容易影響固定和浸蠟的質(zhì)量，不易切出較好的切片。采取病料時應(yīng)保持器官組織的原來形狀，用鋒利的刀剪切取，切勿擠壓，損傷或扭折，以免造成人為的損傷。2、固定：固定的目的是使組織和細胞的較粗大的結(jié)構(gòu)盡量保持正常狀態(tài)，避免發(fā)生形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)變化，使細胞保持一定的硬度，以利于切片。采取的病料組織塊應(yīng)及時投入固定液內(nèi)進行固定，以防腐敗。并做好標(biāo)記，便于識別。固定液用量一般為

2、組織塊體積的1020倍。固定劑的種類很多，一般能凝固或沉淀蛋白質(zhì)及脂肪等成分的藥品都可以做固定劑。如：酒精、甲醛、冰醋酸、苦味酸、升汞等等?？梢园凑詹煌哪康膩磉x擇使用固定劑，常用的固定劑主要是福爾馬林(formalin 3740%的甲醛)，最適合固定的濃度為10%福爾馬林(3.7%4%甲醛)，固定和保存時所用的溶液是指福爾馬林的百分比，而不是甲醛，例10%福爾馬林溶液是10毫升的福爾馬林加上90毫升的水配成。所以10%的福爾馬林，實際上僅含3.74%的甲醛。福爾馬林易被氧化為甲酸，故常帶酸性，為得到中性福爾馬林可加吡啶、碳酸鈣或碳酸鎂的方法使之中和。例如在100毫升的25%福爾林中加5毫升的

3、吡啶；可使它的pH上升到7.0；10%的福爾馬林可被過量的碳酸鈣中和為pH6.4；如果用碳酸鎂則為pH7.6。沖淡的福爾馬林(10%)更易氧化，為了保持它的中性，可于其中放入幾小塊大理石。福爾馬林必須為無色透明，若貯藏時間較長或存放在溫度太低會變混濁，呈絮狀物。為防止該現(xiàn)象的發(fā)生可提前加少許甘油以阻滯其聚合，沉淀物則可加熱溶解，如加熱仍不能溶解，則可加等量熱的0.8%碳酸鈉或0.4%氫氧化鈉(約6070)溶液，在室溫放置23天，沉淀物就會消失。此時福爾馬林淡了一倍，稀釋時要相對地減少一半,含有雜質(zhì)的福爾馬林，通常加熱至98.7蒸餾，可得30%的純凈福爾馬林,稀釋再用。福爾馬林作為單純固定液，以

4、貝克氏(Bakers)改良為好。其配方如下：蒸餾水 90毫升福爾馬林(3740%)甲醛 10毫升無水氯化鈣 1 克加氯化鈣可改變固定液的滲透效應(yīng)，更好地保存細胞原形。3、沖洗：材料自固定液中取出后，須立即沖洗，使其中含有的固定液全部除去，一直到洗凈為止。常用的沖洗方法如福爾馬林固定的組織可用自來水緩緩沖洗，沖洗時間視固定時間和組織塊大小不同而異。一般掛于水籠頭上沖洗624小時。4、脫水：脫水的目的在于使組織中的水分完全除去，并使組織變硬。各種材料經(jīng)固定與沖洗后，組織中就含有大量水分，而材料又逐漸變軟，不能直接投入石臘中包埋，因為水和石蠟是不相溶合的，一定要經(jīng)過脫水劑將水分脫凈，透明劑透明后，才

5、能進行包埋。一般常用脫水劑為酒精、丙酮、二氧六環(huán)等。脫水的方法是在室溫下將脫水劑用水配成不同的梯度濃度，然后將組織塊置入其逐級進行脫水。如50%、70%、80%、90%、95%(各2小時)，100%（）100%（）各1.5小時。脫水時應(yīng)注意每級中停留的時間依材料的大小、性質(zhì)以及固定液的性質(zhì)而定。但不十分嚴(yán)格，柔軟組織每級可停12小時，堅韌組織可停14小時。如需過夜，應(yīng)停留在70%酒精中。5、透明：組織塊脫去水分之后，需經(jīng)透明才能浸蠟。因為酒精等脫水劑與石蠟不能溶合，必須經(jīng)過一種既能與酒精等脫水溶合又能與石蠟溶合的溶劑的處理，才能使石蠟易于浸入組織。常用的這種溶劑有二甲苯、甲苯、苯、氯仿等。一般

6、過程是100%酒精“+”二甲苯（1：1）20分鐘、二甲苯（）15分鐘、二甲苯（）15分鐘。如果組織塊有局部不能透明有呈白色混濁狀態(tài)時，則是因脫水不徹底所致，應(yīng)退回重新脫水，然后再透明。6、浸蠟：組織塊經(jīng)透明之后，即可浸入已溶化之石蠟中使石蠟滲入組織內(nèi)部，這一過程即稱為浸蠟，浸蠟的全過程應(yīng)在恒溫設(shè)備中進行，應(yīng)注意控制溫度。溫度過低則石蠟?zāi)坛晒滔?，不利于滲入組織；溫度過高則組織受損變脆，不利于切片。一般常用以5456溶點的石蠟為宜。如能在石蠟中摻入一些純蜂蠟，更有利于切片。將恒溫箱（或鍋）調(diào)至58。一般是二甲苯“”石蠟（11）的混合液進行預(yù)處理約30分鐘(亦在溶蠟的溫度中進行)，然后浸入純石蠟（

7、）小時、純石蠟（純石蠟）小時。浸蠟必須徹底，否則組織內(nèi)殘留透明劑會造成切片過程的困難和影響切片的質(zhì)量?？刂茣r間和溫度，既要徹底浸蠟，又要時間短。7、包埋：將浸蠟完畢的組織塊凝封在小蠟塊中，這一過程你為包埋。在一定容器內(nèi)(小紙盒、包埋框、小玻璃皿等)注入溶化之石蠟，將已浸的組織塊置入其內(nèi)(應(yīng)使欲切之組織面向下)，使蠟塊迅速冷卻硬固，組織塊在蠟塊中可長期保存。8、石蠟塊的整修：整修蠟塊的目的在于使切成的蠟帶成一直線，不發(fā)生彎曲，以便于鏡檢或作連續(xù)切片，為了達到這一目的，整修時，須將石蠟塊上下兩面修成平等的面，這樣切成的蠟帶就成直線。整修時應(yīng)將上下左右多余的石蠟修掉，但也必須注意不要太靠近組織，把組

8、織裸露在外又會造成切片時易破碎的不良后果，所以組織四周的蠟層不應(yīng)少于2毫米。此外，為了便于在蠟帶上分開每一切片，可將石蠟塊的一角切去。9、切片與展片旋轉(zhuǎn)式切片機的切片方法：先進行用具的準(zhǔn)備：滑行切片機，切片刀，毛筆二枝，培養(yǎng)皿一套。然后將帶有蠟塊的木塊固定在切片機的標(biāo)志夾內(nèi)。將切片刀安裝妥當(dāng),與組織塊成15夾角，調(diào)節(jié)切片機上的微動裝置，使厚度計達到所需切的厚度，一般為68um，調(diào)節(jié)好刀口與組織塊的距離便可開始切片。轉(zhuǎn)動旋轉(zhuǎn)輪柄，搖動一轉(zhuǎn)可切下一片，棄去前幾刀的切片，待切片均勻平展時，用毛筆將切片粘下，置于溫水（4245）中展片，切片完畢后，切片刀和切片機必須注意清理和擦洗干凈。10. 貼片及烤

9、片：待石蠟切片自然伸展平之后，用預(yù)先均勻涂一層貼片液(11蛋白甘油液)的載玻片輕輕地從水中撈取切片，撥正位置，控干水分，然后放入溫箱內(nèi)烘干(3745)約需小時，或在溫室中自然干燥(約需一夜)，亦可將切片置于玻片上，再加少量水，然后持玻片在燈上加溫切片伸展。11、染色：染色的目的在于使組織或細胞的不同成分之間有明顯的對比色，以利于顯微鏡下觀察。石蠟切片常用蘇木精，伊紅對比色法(簡稱HE染色)進行染色。蘇木精本身不是染料，需經(jīng)氧化以后形成氧化蘇木精才有染色作用。蘇木精染料一種配方如下：哈里斯(Harriss)蘇木精：配方：甲液蘇木精 0.5克95%酒精 5毫升乙液：甲礬或銨礬(硫酸鋁銨) 10克蒸

10、鎦水 100毫升氧化汞 0.25克冰酸酸 幾滴配法：(1)將0.5克蘇木精溶解于5毫升95%酒精中。(2)溶解10克鉀礬或銨礬于100毫升的蒸鎦水并加熱煮沸。(3)將上述兩液混合煮沸半分鐘，并加入0.25克氧化汞。(4)很快地在冷水浴鍋中冷卻。(5)冷卻液過夜后用雙層濾紙過濾，并加入冰醋酸幾滴，以加強核的染色。此液配制后可保存一、二個月。伊紅為染胸漿，膠原纖維，肌纖維及嗜酸性顆粒等常用染料，是一種酸性染料，伊紅的種類很多，名稱也不統(tǒng)一。有伊紅Y，乙基伊紅(醇溶伊紅)、伊紅W(水溶性)等。使用濃度一般用0.51%，染色時間30秒至數(shù)分鐘。HE染色操作方法序列如下：脫蠟：將欲染的切片(貼附于載玻片

11、上)浸入二甲苯()以溶去石蠟(分鐘)，再入二甲苯()洗滌(分鐘)、二甲苯“”100%酒精（：）分鐘用無水酒精()分鐘、無水酒精()分鐘以除去二甲苯。依次在95%、85%、70%、50%各級酒精中浸泡各分鐘，再入蒸餾水分鐘，使切片不致從高濃度酒精中驟然進水而脫落。切片以Harris氏蘇木液染10分鐘。用自來水泡洗分鐘，以洗去多余的染液及浮色。用鹽酸酒精分化（約分鐘，需摸索條件），使切片呈磚紅色，然后水洗（約分鐘），以脫去細胞質(zhì)染上的蘇木色素。氨水蘭化（約分鐘）或自來水15min，使組織返回蘭色，鏡下檢查可見細胞核染成蘭色，胞漿無色，用蒸餾水泡洗約分鐘。將玻片置于50%、70%、85%、95%酒精逐級脫水（約分鐘）。浸入95%醇溶伊紅染色分鐘，再經(jīng)兩次無水酒精各2分鐘，以徹底脫水。經(jīng)二甲苯() 、二甲苯()透明，各8分鐘，以除盡組織中的酒精成分，并使切片呈透明狀，以利觀察。樹膠封固：切片在二甲苯()中