高效液相色譜分析方法建立

1、關(guān)于高效液相色譜分析方法的建立第一張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月反相高效液相色譜（RP-HPLC） 分析方法的建立 第二張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月什么是色譜？色譜是一種建立在一定的科學理論基礎(chǔ)上的分離方法（工具、手段）。除色譜之外，經(jīng)典（常見）的分離方法：蒸餾、離心、電泳、過濾、沉淀、萃取等等色譜是一種高效能 的分離方法色譜分析以一定的科學理論為基礎(chǔ)，在高效能的分離基礎(chǔ)上，結(jié)合先進的檢測方法而建立的現(xiàn)代分析方法。第三張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月什么是高效液相色譜法？High Performance Liquid Chromatography高效液相色譜

2、法，簡稱：HPLC是一種區(qū)別于經(jīng)典液相色譜，基于現(xiàn)代儀器方法的高效能分析方法：高性能的色譜柱，高精度、耐高壓的輸液泵以及高靈敏度、高選擇性的檢測器廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域：醫(yī)藥 / 環(huán)保 / 石化 / 生命科學 / 食品及農(nóng)業(yè)在技術(shù)、理論及應(yīng)用上已進入一個較高的水平，并高速發(fā)展。第四張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月HPLC的基本配置及流程溶劑 色譜泵手動/自動 進樣器 HPLC色譜柱檢測器廢液數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) 第五張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第六張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月HPLC的儀器配置泵系統(tǒng)自動進樣器色譜柱及柱溫箱檢測器數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)溶劑第七張，PPT共七十九頁

3、，創(chuàng)作于2022年6月第八張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第九張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第十張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第十一張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月色譜的發(fā)明人茨維特（M. S. Tswett） 俄國科學家茨維特1903年利用物質(zhì)的吸附原理，開創(chuàng)了應(yīng)用吸附原理分離植物色素 的新方法。1906年正式命名 色譜法；Chromatography30年代開始廣泛研究和應(yīng)用 主要是氣相色譜及薄層色譜高效液相色譜法的廣泛應(yīng)用始于70年代第十二張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月色譜的發(fā)明人俄國科學家 M. S. Tswett第十三張，PPT

4、共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月正式命名“色譜”的文獻中的一段話第十四張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月一般情況下HPLC不是分析方法的首選 分析方法選擇的大致程序（以藥典分析方法為例）： 滴定分析（原料藥、制劑定量分析） 紫外可見光度分析（原料藥、制劑定量分析） 薄層色譜（鑒別、有關(guān)物質(zhì)檢查等；半定量分析） HPLC（中藥飲片、中藥制劑的鑒別或有關(guān)物質(zhì)的檢查；復(fù)雜樣品定量分析等）什么情況下使用HPLC？第十五張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月什么情況下使用HPLC？1、對分析結(jié)果、測定速度和效率的要求準確度要求：準確定量（RSD1.5, R增加不大) 。 改變 的方法有：降低

5、柱溫、改變流動相及固定相的性質(zhì)和組成。 (3)分離度R 與容量因子 k 的關(guān)系 k 增加，分離度R增加，但分析時間也將增加。當k10，則R的增加不明顯。通常k控制在110之間。最好15。 改變 k 的方法有：適當增加柱溫、改變流動相性質(zhì)以及固定液膜厚度。第六十四張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 容量因子（k）、柱效（H）及分配系數(shù)比（）對分離度（R）的影響HH第六十五張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月3 分離條件選擇的基本依據(jù) 在分離多組分復(fù)雜混合物時，分子量相近、沸點差小及極性相似的組分，保留值相差小，分離較難。 有必要設(shè)立一個指標，表征這種難分離的物質(zhì)對。 根據(jù)熱力學參數(shù)

6、對分離的影響，設(shè)立Sd值作為難分離物質(zhì)對的量度。在一定的色譜條件下，規(guī)定：k1、k2為容量因子，*為動力學系數(shù)(1) 難分離物質(zhì)對的預(yù)測 k2/k1比值越小，*越大，Sd值就越小，分離越難。k2/k1屬于熱力學參數(shù)，*屬于動力學參數(shù)。如溫度如流速第六十六張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月(2) 分離度的確定 分離度的確定，應(yīng)根據(jù)樣品的復(fù)雜程度、分離的難易程度、誤差要求等作出選擇。對一個分離來說，并不是分離度越高越好，換句話：夠用、且誤差符合要求即可。分離度較低，但可用逢高定量，誤差符合要求。分離度適中，有誤差，但是誤差5%。第六十七張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月(3) 流動

7、相線速度的選擇 根據(jù)Van deemter方程式有一個最佳流速，也就是 H 值最小時的流動相流速。但是由于這個流速一般較小，考慮到分析效率，有時會犧牲柱效而提高流速。(4) 色譜柱溫度的選擇（主要適用于氣相色譜） 在保證最難分離的物質(zhì)對達到預(yù)期的分離前提下，柱溫越高越好，可以縮短組分流出色譜柱的時間，提高工作效率，但是應(yīng)特別注意儀器和固定相所能承受的溫度最高限度。(5) 進樣量選擇 考慮到色譜柱的容量、組分在流動相中的溶解度以及檢測器的靈敏度及線性范圍，所以，在保證達到檢測器靈敏度的前提條件下，采用盡可能小的進樣量。(6) 其他分離的選擇 如柱長、流動相種類和組成、固定相、梯度洗脫、程序升溫等

8、等，參見后續(xù)課具體章節(jié)。 第六十八張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月色譜柱種類的選擇 首選C18柱，可解決約80的分離問題。 其次C8、C2等。色譜柱規(guī)格的選擇 常用150mm 4.6mm、 250mm 4.6mm、 柱長小于100mm、柱內(nèi)徑小于4.6mm的色譜柱常用于MS檢測器（流動相流速1.0mm）。 四、選擇HPLC方法；嘗試性分離；建立分離條件第六十九張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月流動相種類的選擇 反相HPLC常用的流動相種類一般為甲醇、乙腈、四氫呋喃、水或一定濃度的酸性水溶液（pH17，甲酸、乙酸、磷酸、磷酸鹽、檸檬酸、TFA等）。流動相配比的選擇 初步實驗：甲

9、醇水或乙腈水 (80:20)或(90:10) 根據(jù)峰形及分離情況，逐步調(diào)整配比，必要時改變?nèi)軇┑姆N類和溶劑的“元”數(shù)， 并適當改變流動相的酸度以及加入適當?shù)摹胺劳蟿?、“改性劑”等。洗脫方式的選擇 等度洗脫？在滿足分離要求的情況下，首選。 梯度洗脫？第七十張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月梯度洗脫描述方式：以甲醇水二元梯度洗脫為例： 1、文字法（文獻表達方法）： 0-6.5min（30：70），8.5-13min（50：50） 2、表格法： （也可用于正式論文中）第七十一張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月3、圖示法 以時間作為橫坐標，以某一元的溶劑比例作為縱坐標作圖。甲醇min

10、305006.58.513.0甲醇水:0-6.5min（30:70），8.5-13min（50:50）甲醇乙腈水:0-6.5min（20:10:70），8.5-13min（30:20:50）甲醇203006.58.513.010min第七十二張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 圖示法的特點是直觀、明晰，常用于色譜條件選擇實驗中的快速記錄。 一般不用于論文中。 第七十三張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月流動相流速 一般為0.81.5mL（分析型，紫外檢測） 0.999。精密度試驗（日內(nèi)、日間） 對照品混合液，重復(fù)59次進樣，測定目標測定物峰面積并計算RSD。（一般要求2% ）穩(wěn)定性試驗 對照品混合液，每隔一定時間進樣，測定目標測定物的峰面積并計算RSD（一般要求2% ）。（8小時以上）。 注：待測成分不穩(wěn)定的因素應(yīng)排除。 第七十六張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月重復(fù)性試驗 取同一批樣品共59份，按含量測定方法重復(fù)測定，求算待測成分含量的RSD （一般要求2% ） 。加樣回收率試驗 取已知待測成分含量的樣品適量，精密加入對照品儲備液適量（必要時分高、中、低三個量），按照樣品的制備方法制備溶液，按選定的色譜條件測定，求算回收率。檢測限、定量限的確定 對照品溶液逐級稀釋至適當濃度，注入HPLC，測定峰高，當該峰高達到3倍噪聲時，為檢測限，10倍峰