發(fā)酵飼料生產(chǎn)工藝與應(yīng)用

1、Word 文檔發(fā)酵飼料生產(chǎn)工藝與應(yīng)用靈璧縣立騰同創(chuàng)農(nóng)牧科技有限責(zé)任公司二 0 一二年H一月目錄省立騰同創(chuàng)農(nóng)牧科技簡介省立騰同創(chuàng)農(nóng)牧科技企業(yè)文化省立騰同創(chuàng)農(nóng)牧科技的十年發(fā)展戰(zhàn)略 省立騰同創(chuàng)農(nóng)牧科技的第一個發(fā)展五年發(fā)展計劃第一章發(fā)酵飼料生產(chǎn)的菌種及發(fā)酵工藝第二章發(fā)酵飼料生產(chǎn)技術(shù)第一章發(fā)酵飼料生產(chǎn)的菌種及發(fā)酵工藝第一節(jié)概述發(fā)酪飼料的定義發(fā)酪飼料的定義是：在人為可控制的條件下，以植物性農(nóng)副產(chǎn)品為主要原料，通過微生物的代作用，降解部分多糖、蛋白質(zhì)和脂肪等大分子物質(zhì)，生成有機酸、可溶性多肽等小分子物質(zhì)，形成營養(yǎng)豐富、適口性好、活菌含量高的生物飼料或飼料原料。采用發(fā)酪技術(shù)生產(chǎn)的動物飼料或飼料原料，其特性主要

2、是：(1)含有大量的活性微生物；(2)多數(shù)以厭氧發(fā)酪方式進行生產(chǎn)；(3)未經(jīng)干燥的物料含水量通常在 30%H上；(4)物料的酸性物質(zhì)明顯增加，營養(yǎng)組成更合理；(5)生產(chǎn)原料以植物性農(nóng)副產(chǎn)品為主。也有發(fā)酪成品是經(jīng)過干燥處理的，比較典型的有發(fā)酯豆粕和發(fā)酷棉粕。在發(fā)酪過程中有大量的活性乳酸菌和酯母菌發(fā)生的代作 用，經(jīng)過干燥以后，乳酸菌基本都失活了，但是它們也屬于發(fā)酪 飼料。二、發(fā)酪飼料的概述發(fā)酯飼料的生產(chǎn)工藝基本都是以固態(tài)發(fā)酪的方式進行的，生產(chǎn)菌種以乳酸菌、芬胞桿菌和酯母菌為主，絕大多數(shù)采用厭氧或兼性 厭氧發(fā)酯。發(fā)酪物料的含水量為30%50%發(fā)酪時間和溫度受環(huán) 境影響很大，基本不進行人為控制和調(diào)節(jié)。

3、在實際生產(chǎn)中也有采用好氧發(fā)酯方式進行的，生產(chǎn)菌種以霉菌和假絲酪母為主，生產(chǎn)用的蛋白原料主要是一些乳酸菌和酯母菌難 以降解的雜粕和膠質(zhì)蛋白。但是生產(chǎn)設(shè)備復(fù)雜，物料溫度和濕度 Word 文檔Word 文檔變化很大，控制及其困難。成品主要是作為飼料蛋白原料的替代 物，能降低飼料生產(chǎn)成本，但基本不具備生物學(xué)活性和功能。本節(jié)主要論述厭氧固態(tài)發(fā)酯工藝，常規(guī)的發(fā)酯飼料生產(chǎn)流程如： 原料一消毒-冷卻接種-培養(yǎng)-干燥一包裝工業(yè)化規(guī)模的微生物發(fā)酪過程基本上都是純培養(yǎng)過程，原料需要消毒，空氣需要過濾等。這些操作都是為了確保在發(fā)酪產(chǎn)品生產(chǎn) 和儲存過程中不受雜菌的侵襲和干擾，但也正是這些常規(guī)操作使產(chǎn)品的生產(chǎn)成本居高不下

4、，影響了微生物發(fā)酯產(chǎn)品在動物飼養(yǎng)中 的大劑量使用。大量試驗證明，在不考慮動物飼養(yǎng)成本的前提下，大劑量（在配 合飼料中添加5.0蛆上）使用高活菌含量的微生物發(fā)酯飼料可以 明顯改善動物的生產(chǎn)性能， 提高動物的健康水平，甚至可以進行 無抗生素飼養(yǎng)。但是采用傳統(tǒng)的生產(chǎn)工藝獲得的高活菌產(chǎn)品其生 產(chǎn)成本通常都在10元/kg以上，如果以10%勺比例使用在配合飼 料中，每噸配合飼料的成本至少需要增加 800元，這個增加值對 傳統(tǒng)的畜禽養(yǎng)殖業(yè)來說是難以接受的。降低發(fā)酯飼料生產(chǎn)成本最直接的方式就是簡化生產(chǎn)工藝，其中原料的蒸煮、消毒和干燥是 最耗能的操作過程，是導(dǎo)致生產(chǎn)成本增加的主要步驟， 也是導(dǎo)致 生產(chǎn)設(shè)備投資增

5、加的主要原因。 如能簡化生產(chǎn)操作工藝步驟，同時又能保證產(chǎn)品質(zhì)量的安全穩(wěn)定，就能使發(fā)酪飼料的生產(chǎn)和應(yīng)用 具備強大的市場競爭力。第二節(jié) 發(fā)醉飼料的生產(chǎn)菌種 發(fā)酯飼料的生產(chǎn)菌種很多，主要有：乳酸菌、芬抱桿菌、酯母菌 和霉菌。一、乳酸菌目前生產(chǎn)中使用的乳酸菌至少有 30多種。按乳酸菌的代途徑， 大致可歸納為四種類型：同型乳酸發(fā)酯、專性異型乳酸發(fā)酯、兼 性乳酸發(fā)酯和雙歧桿菌異型乳酸發(fā)酯o（一） 同型乳酸發(fā)酯C6H12。62CH3CH（OH）COOH一分子葡萄糖分解成兩分子乳酸，整個過程不產(chǎn)氣，發(fā)酯轉(zhuǎn)化理想，產(chǎn)物最合適，效率最高。典型的生產(chǎn)菌種主要有：德氏乳 酸桿菌、嗜酸乳桿菌、唾液乳桿菌、嗜熱乳桿菌、糞

6、腸球菌、乳 酸乳球菌。（二）專性異型乳酸發(fā)酯C6H12O6CH3CH（OH）COOH+CH 3COOH+CO 2 T一分子葡萄糖轉(zhuǎn)化成一分子乳酸和一分子乙酸，另外還釋放一分子二氧化碳。相比同型乳酸發(fā)酯，這種發(fā)酯的轉(zhuǎn)化效率要 低得多，而且還有產(chǎn)氣損失。典型的生產(chǎn)菌種主要有：發(fā)酪乳桿菌、高加索酸奶桿菌、短乳桿菌、巴氏乳桿菌。（三） 兼性乳酸發(fā)酯兼性乳酸發(fā)酯能同時進行同型乳酸發(fā)酯和異型乳酸發(fā)酪，這兩種代進行的程度和比例取決于菌種的性質(zhì)和外界培養(yǎng)條件。典型的生產(chǎn)菌種有：植物乳桿菌、干酪乳桿菌、鼠糖桿菌、清酒乳 桿菌。（四）雙歧桿菌異型乳酸發(fā)酯2c6H12。6 2CH3CH（OH）COOH+3CH 3C

7、OOH比較典型的生產(chǎn)用菌種是動物雙歧桿菌。雙歧桿菌的培 格要求很嚴(yán)格，對厭氧要求極高，目前還很難在實際生產(chǎn)中 應(yīng)用。乳酸菌分布廣、種類多，有桿狀和球形兩大類。有單個、成 對和鏈狀排列的，基本上都是厭氧菌或微需氧菌。在飼料青 儲、發(fā)酪開始時就繁殖，到飼料因密封缺氧后仍然能繁殖， 只是增殖的速度慢一些，而乳酸的生成速度卻快一些。乳酸菌能分解飼料原料中的糖，形成乳酸。乳酸能提高飼料 的營養(yǎng)價值和適口性，同時還能抑制大腸桿菌和沙門氏菌等 有害微生物的生長代，使飼料產(chǎn)品能長期保存。在飼料青儲 和發(fā)酪的過程中，同型和異型乳酸發(fā)酯同時存在，產(chǎn)物除乳 酸外還有少量乙醇和CO2。二、芬抱菌目前在生產(chǎn)中應(yīng)用的芬胞

8、菌有近十種，以桿菌為主，主要為以下三種：地衣芬抱桿菌、枯草芬抱桿菌和蠟樣芬抱桿菌。芬抱桿菌 能耐受高溫，在有氧和無氧條件下都能存活。在營養(yǎng)缺乏、干旱 等條件下形成芬抱，在條件適應(yīng)時又可以重新萌發(fā)成營養(yǎng)體。利用芬胞桿菌發(fā)酯飼料的目的主要是為了消耗培養(yǎng)體系中殘留的 氧氣，為乳酸菌創(chuàng)造一個厭氧環(huán)境。另外，近年來研究還發(fā)現(xiàn)， 有些芬抱桿菌能產(chǎn)生殺滅大腸桿菌和沙門氏菌等有害微生物的 細菌素（也稱抗菌肽），這些抗菌肽有很強的針對性，只對某些類型的微生物細胞有破壞作用，對酯母菌和乳酸菌沒有影響。三、酯母菌酯母菌是一類單細胞真菌，形態(tài)多種多樣，主要有球形、卵形和 絲狀形（如假絲酷母），以出芬的無性繁殖為主，最

9、適宜生長溫 度為2535 C, pH偏酸性（4.06.0）。酯母菌基本上都是兼性 厭氧菌，在有氧的條件下迅速增殖， 在無氧的情況下進行酒精發(fā) 酪（EMP）。目前在生產(chǎn)中應(yīng)用的有 20多種，主要為以下三種： 釀酒酪母、熱帶假絲酷母、產(chǎn)骯假絲酪母。啤酒酪母和面包酯母 是最常用的釀酒酪母。熱帶假絲酪母和產(chǎn)骯假絲酪母的生長速度 很快，在適宜的溫度和營養(yǎng)條件下， 它們的世代倍增時間不超過 3h,特別適合處理食品加工業(yè)產(chǎn)生的廢水。酯母菌的個體比乳酸菌大得多，直徑通常為26 g,體積幾乎是乳酸菌的1000倍左右。工業(yè)生產(chǎn)中常用的酯母菌主要有釀酒 酪母和假絲酪母，釀酒酪母是生產(chǎn)啤酒、白酒等含乙醇類發(fā)酯物 的重

10、要菌種；假絲酯母主要用于好氧發(fā)酯生產(chǎn)動物飼料或者廢水 處理。四、霉菌目前在生產(chǎn)中應(yīng)用的霉菌有近十種，主要為：米曲霉、黑曲霉、 白地霉。一般來說利用霉菌發(fā)酪，基本上都是有氧發(fā)酪，發(fā)酪過 程會產(chǎn)生大量的代熱，生產(chǎn)過程中料曲的溫度控制往往是生產(chǎn)成 敗的關(guān)鍵。霉菌發(fā)酪目前采用淺盤發(fā)酪，料曲厚度不超過5cm ,如果采用厚層發(fā)隙，需采用強通風(fēng)裝置，生產(chǎn)能耗很大，從這一 點上說，霉菌發(fā)酯不適于生產(chǎn)飼料或者飼料原料。目前，實際生產(chǎn)中利用霉菌主要是利用它能合成纖維素酶、半纖維素酶和蛋白酶的特性，利用廉價的粗蛋白原料作為發(fā)酪底物， 生產(chǎn)高活性的蛋白飼料或者粗酶制劑。五、選用生產(chǎn)菌種的基本原則（一） 安全性（必須同

11、時符合以下兩個要求）（1）菌體本身不產(chǎn)生有毒有害物質(zhì)。（2）不會危害環(huán)境固有的生態(tài)平衡（主要針對某些基因工程菌）。（二）有效性（能滿足一個要求即可）（1）菌種本身具有很好的生長代活力，能有效降解大分子好抗 營養(yǎng)因子，合成小肽和有機酸等小分子物質(zhì)。（2）能保護和加強動物微生物區(qū)系的正平衡。這種功效主要是指能有效維護和提高有益微生物在動物消化道中的數(shù)量優(yōu)勢，其可通過兩種方式達到： 一種方式是利用發(fā)酪飼 料的生產(chǎn)菌種本身就是從飼養(yǎng)的目標(biāo)動物的消化道中分離出來的有益菌，通過飼喂高比例的發(fā)酯飼料直接提高有益微生物的數(shù) 量，形成數(shù)量優(yōu)勢；另一種方式是利用生產(chǎn)菌種或代產(chǎn)物可以選 擇性地抑制或者殺滅有害微生物

12、，形成有益菌的數(shù)量優(yōu)勢。實現(xiàn) 第二種途徑的方式可以多種多樣，比較常用的有：耗盡氧氣，降 低體系的氧化還原電位；降低環(huán)境的 pH值；代物中含有能選擇 性殺滅大腸桿菌和沙門氏菌等有害微生物的抗菌物質(zhì)等。第三節(jié)發(fā)醉飼料生產(chǎn)菌種之間的相互關(guān)系目前人類可利用的這些發(fā)醉技術(shù)基本上都是純培養(yǎng)技術(shù)，而實際上在自然界中很難找由單一微生物存在的生態(tài)環(huán)境。據(jù)已有的微生物研究報道， 地球上存在的微生物超過 100 萬種，而人類所分離的純種累計不超過10萬種，做過比較系統(tǒng)研究的不超過1萬種。根據(jù)目前已有的研究成果，大體 可以把微生物之間的關(guān)系分為以下幾種：中性共生、同住、 互惠共生、共生、競爭、拮抗和寄生。一、中性共生

13、這是指兩種或兩種以上的微生物同時存在于同一個環(huán)境中，但是它們之間沒有直接的生態(tài)關(guān)系，各自生活互不干擾。例如淡水中生長的衣藻和水生細菌。二、同住這是指兩種微生物同處在一個棲所， 其中一個獲益，另一個 不受影響。常見的現(xiàn)象是一種微生物產(chǎn)生一種代物供另一種微生 物作為營養(yǎng)物質(zhì)，或者產(chǎn)生適合于另外一種微生物生長的環(huán)境。發(fā)酯飼料生產(chǎn)中比較常見的例子有以下幾種：酯母菌能在高濃度的糖液（25癖右）中生長。當(dāng)糖被酯母菌消耗以后，糖濃度的 降低就有利于不耐受高滲透壓的微生物（如乳酸菌）的生長。能分泌淀粉酶的微生物（芬抱菌）水解淀粉產(chǎn)生寡糖和單糖，為 另外一些只能利用還原性單糖的微生物生長提供營養(yǎng)。還有一種比較特

14、殊的同住微生物， 好氣性菌可消耗氧氣，降低環(huán) 境的氧化還原電位，使之適合于厭氧微生物的生長。 這種同住關(guān) 系只能產(chǎn)生在開始階段，在后期就不是同住關(guān)系了。 這種現(xiàn)象在 發(fā)酯飼料到生產(chǎn)過程中經(jīng)常遇到，也是利用微生物組合發(fā)酯生產(chǎn)發(fā)酪飼料的重要理論基礎(chǔ)。三、互惠共生這是兩種微生物互惠互利的現(xiàn)象，比較典型的菌種是阿拉伯 糖乳桿菌和糞鏈球菌的組合。阿拉伯糖乳桿菌不能合成苯丙氨 酸，糞鏈球菌不能合成葉酸。阿拉伯糖乳桿菌不能在缺少苯丙氨 酸的培養(yǎng)基上生長，糞鏈球菌也不能在沒有葉酸的培養(yǎng)基上生 長。但是把它們組合在一起， 卻可以共同在沒有苯丙氨酸也沒有 葉酸的培養(yǎng)基上生長，因為它們能相互為對方提供必需的限制性

15、營養(yǎng)物質(zhì)。這種現(xiàn)象在自然界中普遍存在， 發(fā)酯飼料的菌種組合 應(yīng)該多考慮這種組合優(yōu)勢。四、共生共生是指兩種微生物在同一個嚴(yán)酷環(huán)境中彼此相依為命。比較典型的例子是地衣，它是藍細菌（或藍藻）與真菌共同組成的 一個形態(tài)和生理單位。藍藻或藍細菌的細胞僅限于特定的層，地 衣的菌絲交織成菌絲組織， 形成一個稠密的外皮層。 皮層下為藍 藻的細胞層，在下面為菌絲疏松交織的菌髓層。真菌可以從藍藻獲得碳水化合物，真菌菌絲所攝取的水和無機鹽又可以提供給藍 藻，因此地衣能耐干旱、潮濕和抗寒冷。這種現(xiàn)象在發(fā)酪飼料的 生產(chǎn)過程中很難遇到，少有實用的例子。五、競爭當(dāng)兩種微生物對某種環(huán)境因子有相同要求時，就會發(fā)生生存競爭。由于

16、微生物的世代時間比較短，代強度大，所以生存競爭 往往表現(xiàn)的很激烈。在一個生存環(huán)境，不同的時間會出現(xiàn)不同的優(yōu)勢種。 這種優(yōu) 勢微生物在某種環(huán)境下能最有效地適應(yīng)當(dāng)時的環(huán)境，而環(huán)境條件一旦改變，就可能被另一種微生物代替弁發(fā)育成新的優(yōu)勢種。目前工業(yè)化發(fā)酪生產(chǎn)之所以采用純種培養(yǎng)，其主要原因就是消除其他微生物的競爭。目標(biāo)代物合成能力強的微生物其生長速度往往 比較低，至少比同類的野生菌低。野生菌的代活動是很“經(jīng)濟的”。 如果從生長速度分析，它們的物質(zhì)和能量的利用效率要遠高于生 產(chǎn)菌種。但是，由于生產(chǎn)成本的限制，發(fā)酪飼料的生產(chǎn)往往不能 采用純種培養(yǎng)，所以微生物之間的生存競爭不可避免。如何巧妙利用微生物之間的生

17、存競爭是研究微生物發(fā)酯飼料生產(chǎn)的一個非常重要的課題。 從理論上分析，通過控制調(diào)節(jié)微生物生存環(huán)境可以調(diào)整物料中微生物的種類和數(shù)量分布，從而達到利用微生物有益菌群種群優(yōu)勢發(fā)酪飼料的目的，但是到目前為止， 有關(guān)方面的成熟技術(shù)還是很少。六、拮抗一種微生物可以產(chǎn)生不利于另一種微生物生存的代物質(zhì)，或者通過代活動改變生存環(huán)境， 而這種環(huán)境不利于其他周圍微生物 的生長，這種現(xiàn)象就稱為“拮抗”。如：青貯飼料接種的乳酸菌和 醋酸菌在發(fā)酪過程中，不斷降低 pH值，結(jié)果絕大多數(shù)不耐酸的 微生物不能生存，甚至趨向死亡。酯母菌在無氧條件下將糖發(fā)酯 成酒精，當(dāng)酒精濃度達到一定數(shù)值時，其他微生物就不能生存。研究發(fā)現(xiàn)拮抗還具有

18、明顯選擇性， 農(nóng)業(yè)部飼料工業(yè)中心分離 獲得的枯草芬抱桿菌 MA139能分泌殺滅大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的抗菌肽（細菌素），但對自身、酪母菌和乳酸 菌的生長代基本沒有影響，這種拮抗的選擇性是發(fā)酯飼料研究所 希望的。七、寄生一種微生物生活在另一種微生物體或體外，依靠攝取寄生細 胞的營養(yǎng)進行生長繁殖， 弁使后者遭受損害甚至死亡， 這種現(xiàn)象 稱之為寄生。這種現(xiàn)象在飼料發(fā)酪過程中可能存在， 目前在研究 中還沒有遇到。微生物是發(fā)酯飼料的動力來源， 研究發(fā)酯飼料中微生物的相 互關(guān)系是獲得高質(zhì)量發(fā)酪飼料的必要前提，也是飼料發(fā)酯生產(chǎn)的 核心。第四節(jié)發(fā)酯飼料的生產(chǎn)工藝一、固態(tài)厭氧發(fā)酯高活性生物飼料相對于

19、好養(yǎng)發(fā)酯，厭氧發(fā)酯的能耗低，微生物代產(chǎn)生的熱量 也要小得多，生產(chǎn)過程往往不需要翻拌散熱。另外，發(fā)酪產(chǎn)品只 要密封得當(dāng)，即使長期存放也不會腐敗變質(zhì)。目前比較典型的固態(tài)厭氧發(fā)酯生物飼料的成功例子主要有 兩種：一種是適合養(yǎng)殖戶自產(chǎn)自用的袋裝發(fā)酪飼料；另一種是屬于規(guī)模化流水線生產(chǎn)的袋裝發(fā)酪飼料。它們接種的微生物基本一致，主要有酯母菌、乳酸菌和芬胞桿菌。適合養(yǎng)殖戶自產(chǎn)自用的發(fā)酯袋是一種普通的密封包裝袋， 物 料接種以后裝袋，再將袋口用繩扎緊，物料的含水量為30%40% 開始時，酪母菌消耗袋殘留的氧氣進行增殖和呼吸代， 同時也為乳酸菌創(chuàng)造一個厭氧的生活環(huán)境。然后，酪母菌在無氧條件下進行糖酯解，產(chǎn)生酒精和

20、CO2,乳酸菌也同時增殖、代，產(chǎn)生有機 酸。隨著袋氣壓的不斷增加， 不斷有CO2帶著酒精和有機酸排出 袋外，管理飼料的飼養(yǎng)員可以根據(jù)排出的酸香味來判定物料發(fā)酪 的成熟度。有氧發(fā)酪階段：C6H12O6+6O 2 6CO2+6H 2。無氧發(fā)酪階段：C6H12。62CO2+2C2H5OH（乙醇）在夏季，發(fā)酷35d就有明顯的酸香味。在冬季，時間需要延長。如果環(huán)境溫度低于 12 C,發(fā)酪就有可能歸于失敗。酪母在低溫 下長期代低迷，不產(chǎn)生CO2,使得外界的O2長時間與接種的乳 酸菌接觸，會導(dǎo)致乳酸菌活力大減，甚至死亡。事實證明，如果環(huán)境溫度適宜，時間控制得當(dāng)，采用上述袋裝式 土辦法發(fā)酪，也可以獲得質(zhì)量很好

21、的微生物發(fā)酯飼料，活性乳酸菌的含量能達到 108cuf/g以上。將其在生羊配合飼料中添加 15%20%生羊采食量能明顯提高，最多能提高10%Z上，而且增重速度和健康水平也有顯著提高。這種工藝雖然簡單，但是受限制的因素很多，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)也很難把握，實際推廣有一定困難。為了使這種袋裝發(fā)酯技術(shù)進入程序化、 工業(yè)化應(yīng)用，發(fā)酪飼料的 質(zhì)量能得到有效保證，必須完成以下幾個前提：發(fā)酪過程不受環(huán) 境溫度限制；產(chǎn)品質(zhì)量不受存放時間限制， 或者保質(zhì)期能達到三 個月以上；產(chǎn)品在儲存和運輸過程中不受外界空氣干擾。農(nóng)業(yè)部飼料工業(yè)中心的微生物發(fā)酪飼料課題組發(fā)明了呼吸膜可 移動式固態(tài)厭氧發(fā)酯飼料（也稱袋裝發(fā)酯飼料）生產(chǎn)技術(shù)。這

22、種發(fā)酪技術(shù)的具體工藝流程如圖1-1原料接種以后直接進入包裝袋中， 包裝袋上附加一個可以調(diào)節(jié)氣 壓的硅膠膜。在發(fā)酪過程中，微生物會產(chǎn)生CO2等氣體，使得袋的氣壓大于外界常壓。當(dāng)袋氣壓達到某一臨界值時，氣體通過硅 膠膜排到外界。但是外界的氣體始終沒有機會進入發(fā)酪體系，從而也就排除了外界雜菌的干擾。研制的特定微生物菌種組合能使乳酸菌迅速繁殖，占據(jù)數(shù)量優(yōu) 勢，原料不需要消毒就可以直接用于接種培養(yǎng)。這種工藝很簡單，如果以日產(chǎn) 30t計算，設(shè)備投資不超過 40萬 元，特別適合在我國廣大農(nóng)村推廣使用。第三章發(fā)酵飼料生產(chǎn)技術(shù)第一節(jié) 發(fā)酯飼料用乳酸菌的分離篩選乳酸菌是一類最常見的益生菌，生物飼料的發(fā)酪生產(chǎn)一般都

23、 離不開乳酸菌。乳酸菌種類很多，市場上流行的產(chǎn)品也極多，至 少有20多種。大量實驗證明，只有動物消化道國有的微生物才 能在消化道定植，外源微生物只能短時間存活在消化道，不可能長期融合到動物消化道的微生態(tài)系統(tǒng)中。篩選發(fā)酪飼料的生產(chǎn)菌 種，其主體應(yīng)該來源于最終適用的動物消化道，而乳酸菌細菌是動物消化道起主要作用的微生物。一、樣品的采集為了獲得合適的生產(chǎn)用乳酸菌，樣品的采集很重要。適合于實 際生產(chǎn)的乳酸菌必須來源于健康動物的消化道，最好是在發(fā)生 了瘟疫的養(yǎng)殖場而幸存的畜禽。發(fā)生瘟疫的養(yǎng)殖場，動物大比 例死亡，幸存的畜禽雖少，但是生命力很頑強，是極好的生產(chǎn) 菌種采集樣本。以下以篩選符合生羊健康養(yǎng)殖需要

24、的生物飼料用乳酸菌為例，敘述樣品的采集和乳酸菌的分離。在實驗室中對生羊進行攻毒試 驗，在飼料中不斷加大大腸桿菌（實驗用E.ColiK88這是一種常見的攻毒試驗用大腸桿菌）的用量，以檢驗生羊的抵抗力。經(jīng)過 57d的試驗，生羊的健康水平越來越差。我們選擇其中兩頭最 健康的生羊進行屠宰，在無菌環(huán)境中提取它的胃液、 小腸液和大 腸液，迅速保存在無菌生理鹽水（NaCl的濃度為0.9%中。目標(biāo)乳酸菌一般都是厭氧菌，為了確保乳酸菌的活力， 需要盡可能降低生理鹽水的氧化還原電位。 最簡便的方法是在溶液中加入 適量的半胱氨酸，半月氨酸有茄基（一 SH）,有很好的還原力， 可以消除溶液中殘余的氧。二、乳酸菌的分離

25、純化樣品中的目標(biāo)乳酸菌含量一般都不是很高，而且還污染了其他 雜菌。為了提高篩選成功的幾率，在樣品進行分離純化以前， 可以對樣品進行選擇性增殖培養(yǎng)，以增加目標(biāo)乳酸菌的含量。樣品的增殖培養(yǎng)比較簡單，把經(jīng)過適當(dāng)處理的樣品接種到適于 目標(biāo)乳酸菌生長的培養(yǎng)基中。比較常用的是牛奶增殖培養(yǎng)液， 在無抗生素牛奶中補充 6%8%勺蔗糖，高溫消毒、冷卻，然后 用氮氣或者二氧化碳驅(qū)除溶液中殘留的空氣，再接入適量采集 的樣品，在3032 c條件下厭氧培養(yǎng)1024h。如果樣品中的 目標(biāo)乳酸菌含量比較低，可以適當(dāng)延長培養(yǎng)時間。樣品經(jīng)過預(yù)增殖培養(yǎng)以后，目標(biāo)乳酸菌含量明顯提高，可以進 入下一步分離純化操作。乳酸菌分離培養(yǎng)基通

26、常采用MRS瓊脂培養(yǎng)基，其營養(yǎng)組成與pH如下：蛋白陳：5.0g/L;牛肉浸膏：4.0g/L;酯母膏：2.0g/L; 葡萄糖：12.0g/L;玉米漿：10.0mL;司盤80: 1ml;磷酸氫二鉀： 1.0g/L ;三水乙酸鈉：3.0g/L ;檸檬酸三?。?.0g/L ;硫酸鎂： 0.1g/L;硫酸鎰：0.03g/L;瓊脂：18.0g/L。pH6.20.2。加熱溶解上述各組分，配制成均勻的溶液，分裝在厭氧滾管中（每個管中加56mL）。在115 c消毒殺菌30min。冷去口至50 c 左右后，在冰水中滾動滾管，使固體培養(yǎng)基均勻凝固在管壁上。 為了指示培養(yǎng)基的氧化還原電位，可以在培養(yǎng)基中加入極少量 的

27、刃天青（一種顯色劑），濃度0.02姆足夠了。在低電位時培 養(yǎng)基顯藍色，隨氧化還原電位不斷上升，培養(yǎng)基的顏色逐步由 藍轉(zhuǎn)為淺藍、粉紅、紅色。如果培養(yǎng)基的顏色轉(zhuǎn)成粉紅就基本 不合格了。同增殖培養(yǎng)過程一樣，在MRS分離培養(yǎng)基中加入適 量的半胱氨酸可以在一定時間維持環(huán)境的低電位。分離純化培養(yǎng)基準(zhǔn)備好以后，就可以進行目標(biāo)乳酸菌的分離操 作了。在超凈工作臺上（或者其他無菌環(huán)境中），對經(jīng)過增殖培養(yǎng)的樣 品進行梯度稀釋，稀釋液還是用無菌的生理鹽水，把稀釋后的 樣品接種到厭氧滾管中， 密封（滾管有密封蓋）。在3032 c條 件下培養(yǎng)12d。為了提高篩選幾率，可以同時做多個稀釋梯度樣品的培養(yǎng)。如 果兩天以后不出現(xiàn)

28、理想的菌落，可以再延長培養(yǎng)時間。雖然乳酸菌的最適宜生長溫度是3740 C ,但是在分離篩選過程中，培養(yǎng)溫度應(yīng)適當(dāng)調(diào)低，以降低其生長速度，這樣菌落之 間的差異可以更明晰，也更有利于挑選理想的菌種。經(jīng)過上述分離操作，我們獲得了 5株乳酸菌，它們分別是:.來源于羊胃的格氏乳桿菌(Lactobacillus gasseri);.來源于十二指腸的羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri ).來源于小腸的屎腸球菌 ( Enterococcus faecium );.來源于空腸的嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus );.來源于結(jié)腸的發(fā)酹乳桿菌(Lactobacil

29、lus fermentium )。三、發(fā)酯力和耐酸穩(wěn)定性分析為了后續(xù)生產(chǎn)應(yīng)用的需要，我們對分離獲得的乳酸菌進行發(fā)酯 力測定和耐酸穩(wěn)定性試驗。發(fā)隙力測定比較簡單，主要測定其乳酸菌的產(chǎn)量，具體方法如下：接種分離獲得的細菌純種于試管培養(yǎng)液中，3032。恒溫培養(yǎng)12h,然后再擴大接種到牛奶瓶中，3032c恒溫培養(yǎng)6h,測定乳酸含量。在乳酸發(fā)酯的過程中乳酸通常以乳酸鈣的形式存在，通過去除發(fā)酯液中的葡萄糖和蛋白質(zhì)， 弁加入適當(dāng)濃度硫酸酸化， 鈣離子 轉(zhuǎn)化成難溶的硫酸鈣沉淀，使溶解度不高的乳酸鈣全部轉(zhuǎn)變?yōu)槿?酸。乳酸在銅離子的催化下，與濃硫酸作用生成乙醛，乙醛能與對羥基聯(lián)苯作用生成在 565 nm處有特征吸

30、收的紫色物質(zhì)。在一定濃度圍，乳酸含量與 565 nm處波長吸光度呈線性關(guān)系，因此，可以通過測定 565 nm處的吸光度來測定乳酸的含量。實驗室乳酸含量的測定一、原理稀乳酸在 濃硫酸作用下加熱，可以變成乙醛。乙醛與羥基聯(lián)苯作用可以生成紅色的復(fù)合物，在565nm條件下比色測定，可以確定乳酸含量。二、試劑1.4.0喻酸銅溶液將4g無水硫酸銅溶解在水溶液中，定容至 100ml。.羥基聯(lián)苯(C6H5 c6H4OH)溶液將1g羥基聯(lián)苯溶解于100ml濃度為0.08mol/L的NaOH溶液中， 儲存在褐色試劑瓶中。.乳酸標(biāo)準(zhǔn)液將280mg純?nèi)樗徜嚾苡谒校涑?250mL溶液，其乳酸濃度為 1mg/mL,存

31、放于4c冰箱中。在做標(biāo)準(zhǔn)曲線時將溶液稀釋 10倍, 使乳酸含量為100閨/mL。在分別取1, 2, 3, 4, 5, 6mL稀釋 液，稀釋配制成1, 2, 3, 4, 5, 6閨/mL乳酸標(biāo)準(zhǔn)液。.濃硫酸溶液在比色管中分別加入1mL乳酸標(biāo)準(zhǔn)液和0.05mL硫酸銅溶液，然 后加入6mL濃硫酸，放置5min ,冷卻至20 c以下。三、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備和乳酸含量的測定在上述比色管中加入 0.05mL羥基聯(lián)苯溶液，混合均勻，在室溫 下放置68h ,過夜。在565nm波長下進行比色測定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。(1)最大吸收波長的確定乳酸發(fā)酯液樣品顯色后，表明，最大吸收波長為565 nm圖2-1最大吸收波長的確定(

32、2)最佳顯色條件的選擇結(jié)果表明，氫氧化鈣和濃硫酸的加入量對顯色反應(yīng)影響顯著，其余因素的作用不顯著，最佳顯色條件為 A2B3c2D1E1F3,即氫氧 化鈣0.05g , 20麻酸銅0.8 ml,濃硫酸6 ml,對羥基聯(lián)苯 0.125 ml,靜置時間15 min,加熱顯色時間 5 min。(3)乳酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備乳酸標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液濃度在1080由/ml圍與吸光度值基本呈線性關(guān)系，當(dāng)濃度大于等于 60聞/ml時吸光度值大于1,考慮到儀 器誤差的因素，故制備標(biāo)準(zhǔn)曲線時濃度圍取在15、20、25、30、35、40、45、50由/ml ,得到如圖的乳酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得標(biāo)準(zhǔn) 曲線回歸方程為 A=0.0189C0.

33、0808(A為吸光度值，C為乳酸濃度，n=8）, r=0.9989,在1550/ml圍呈良好線性關(guān)系0.40.23010 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110乳液可林液濃度（微克/富升）（圖2-2 :乳酸標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液濃度與吸光度值之間的關(guān)系）LngLnd,O.CSSSSO.SO.102030105060乳酸標(biāo)準(zhǔn)液濃度（微克/塞升）（圖2-3 :乳酸標(biāo)準(zhǔn)曲線）本實驗對發(fā)肝液進行預(yù)處理， 排除蛋白質(zhì)和葡萄糖的干擾， 使測定結(jié)果更接近真實值；優(yōu)化了顯色條件，使測定時操作簡便，精確度高，顯色穩(wěn)定，準(zhǔn)確度高，適合于發(fā)酯液中乳酸含量的測定。耐酸穩(wěn)定性分析主要是考慮乳酸菌在實際使用過

34、程中過動物胃酸的成活問題。生長育肥羊的胃酸 pH比較低，一般的微生物很難在其中存活，這種功能實際上也利于生羊的健康， 使它可以在衛(wèi)生條件比較差的環(huán)境中生存。 但是這種特性不利于外源有益 微生物的存活，外源有益菌必須先通過胃液的考驗才能達到其發(fā)揮作用的場所（腸道）。所以耐胃酸穩(wěn)定性也是決定乳酸菌實際 使用效果的一個重要指標(biāo)， 具體檢驗方法如下：取1.0mL活菌數(shù) 量已知的培養(yǎng)液，在無菌條件下，接種到生長羊、牛的胃液中，在37。恒溫培養(yǎng)。同時做6個平行，每隔1h取樣1次，分析乳 酸菌數(shù)量的變化。在生長羊胃液中，上述5株菌都體現(xiàn)了很好的穩(wěn)定性， 具存活 率都在50減上（見表2-4）表3-4各種乳酸細

35、菌在生長羊胃液中的穩(wěn)定性時間/h123456格氏乳桿菌存活率/%羅伊氏乳桿菌存活率/%屎腸球菌存活率/%嗜酸乳桿菌存活率/%發(fā)酵乳桿菌存活率/%88.282.691.488.481.371.486.562.176.391.288.684.294.692.891.495.811213666.957.246.871.264.855.676.871.364.288.586.384.6本組試驗均是在羊消化道中分離獲得的乳酸菌都是天然菌， 沒有經(jīng)過基因工程改造，屬于安全菌株。遺傳性能穩(wěn)定，不會隨著傳代而發(fā)生 變異，安全無毒?？梢源罅繎?yīng)用在牛、羊等飼料中。另有研究提出在模擬的胃酸中（pH值與真實胃液胃酸相

36、同）進行穩(wěn)定性試驗，其結(jié)果不能代表乳酸菌在真正胃液胃酸中的穩(wěn)定性， 其原 因是真實胃液中蛋白酶對外來生物活性物質(zhì)具有極強的分解作用，破壞了相當(dāng)部分外來多酶蛋白和一些細菌素的活性。 這是自然界一種自 我保護的功能。第二節(jié)發(fā)醉飼料用芽泡桿菌的分離篩選和安全性評價 芽泡桿菌也是一類比較常見的發(fā)醉飼料生產(chǎn)菌，但是這類菌 的應(yīng)用效果與菌種來源、飼養(yǎng)環(huán)境和動物類型都有很大的關(guān) 系。雖然種類很多，但是真正能體現(xiàn)由穩(wěn)定的、優(yōu)良效果的 還很少。另外，芽抱桿菌不同于乳酸菌和釀酒醉母（或者啤酒醉母），乳酸菌和解母菌的安全穩(wěn)定性一般都很可靠（一些耗氧發(fā)醉 的絲狀醉母除外），但是芽泡桿菌的安全穩(wěn)定性卻一直是行 業(yè)主管部

37、門關(guān)注的重點。芽泡桿菌一般都不是動物消化道固有菌，它們發(fā)揮作用的原 因至今還沒有統(tǒng)一的定論。但是目前人們對兩點原因是比較 認可的：產(chǎn)生能殺滅大腸桿菌和沙門氏菌等有害微生物的抗 菌肽類物質(zhì)（或者稱為細菌素）；消耗環(huán)境中的氧氣，為乳 酸菌的生長繁殖創(chuàng)造厭氧環(huán)境。芽泡桿菌的分離篩選主要也 是依據(jù)上述兩個原則。安全性評價主要依據(jù)抗生素敏感性以及致毒性，相關(guān)的技術(shù) 都比較成熟。一、樣品的采集和初篩與乳酸菌的分離篩選一樣，目標(biāo)芽泡桿菌也是從發(fā)生了瘟疫的動物養(yǎng)殖場或者進行攻毒試驗幸存的動物體中篩選。1.樣品的采集與初篩在發(fā)生了大批死亡的養(yǎng)殖場里，我們從土壤和糞便中采集樣品，共需采集24個樣品，每個樣品約 2

38、g,在無菌條件下分別保存在20mL無菌生理鹽水中，并用冰塊降溫，在 12h進 行后續(xù)的培養(yǎng)分離，具體方法如下：(1)取0.5ml樣品液，加入到5ml的復(fù)合營養(yǎng)肉湯(MNB) 中。MNB培養(yǎng)基組成與 pH:葡萄糖：5.0g/L;蛋白月東：5.0g/L;牛肉膏：3.0g/L;醉母浸粉：1.0g/L;MgSO 4 H2O:0.005g/L。 pH:7.0 0.2把上述組分均勻溶解在水溶液中，在120 c消毒30min ,然后冷卻到常溫，備用。(2)從24種樣品中分離得到芽胞桿菌菌株約120株，這些芽泡桿菌均具有革蘭氏陽性、過氧化物酶陽性、產(chǎn)生好氧芽抱的特性，但是僅有 6株對E.coliK88具有強烈

39、的抑制作用，它們都基本具備了芽泡桿菌的特性，將此6株菌株編號為：MA23、MA139、MA257、MA59、MA633 和 MA744 ,并將 這6株作為后續(xù)復(fù)篩的備選菌種。二、菌種的復(fù)篩在芽泡桿菌的復(fù)篩過程中，設(shè)計了待篩菌與4種指示菌同步混合培養(yǎng)的方法，這種設(shè)計的目的：創(chuàng)造豐富的營養(yǎng)條件 便于候選菌株的富集生長；采用指示菌混合培養(yǎng)，給候選 的芽泡桿菌營造一個競爭的環(huán)境，有利于產(chǎn)生高抗菌活性的芽抱桿菌，并能在有限的環(huán)境中為爭奪營養(yǎng)條件，拮抗其他細菌而存活下來。同時在不同的試管中分別接種4種指示菌（見表3.5）,濃度約為 106cfu/mL。表2-54種指示菌及其來源指示菌學(xué)名來源金黃色葡錮球菌

40、Staphylococcus IVDC C56005中國獸醫(yī)微生物菌種保藏中心鼠傷寒沙門氏菌SalmonellatyphimuriumIVDC中國獸醫(yī)微生物菌種保藏中心大腸桿菌K88C79-13中國獸醫(yī)微生物菌種保藏中心大腸桿菌K99Esherichia coli IVDC C83901中國獸醫(yī)微生物菌種保藏中心Esherichia coli IVDC C83529在上述4個指示菌中，大腸桿菌 K88的抵抗力最強，金黃色 葡萄球菌抵抗力最弱。制備指示菌懸液時，用接種針從斜面上挑取少量的指示菌，分別接種到營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（MNB）中，37 c培養(yǎng)1824h , 保證菌懸液的濃度為 108cfu/m

41、L左右。接種菌液后，在 37 c混合震蕩培養(yǎng) 48h,培養(yǎng)液然后置于 70 c的水浴中保溫30min ,殺死營養(yǎng)細胞。存活的芽泡經(jīng)過 10倍稀釋，取一定的稀釋液涂布于MNA固體培養(yǎng)基（在MNB培養(yǎng)液中加入1.8%左右的瓊脂）平皿表面，使之形成單 菌落。根據(jù)菌落形態(tài)的差異，挑起產(chǎn)芽泡的、革蘭氏陽性的 單菌落，接種到試管斜面中，編號后保存在4 c冰箱中。然后在采用平板擴散的方法，將分離由來的芽泡桿菌用滅菌牙簽疏取少許分別點種到倒好的MNA平板中（平板在使用前置于37 c下培養(yǎng)24h,除去部分水份以便于抗菌物質(zhì)在培 養(yǎng)基中擴散），37 c培養(yǎng)24h,然后把平板倒扣于盛一薄層氯 仿的培養(yǎng)皿蓋上并熏蒸約

42、 40min ,以便殺死活細胞并能讓菌 落固定于平板的表面，然后移去培養(yǎng)皿蓋并讓平板里殘余的 氯仿?lián)]發(fā)30min （以揮發(fā)徹底）。在平板表面鋪一層剛培養(yǎng)好 的指示菌培養(yǎng)液，均勻布滿后傾倒由剩余的菌液，晾干平板,置平板于37 c培養(yǎng)1618h ,觀察點種的芽泡桿菌周圍抗菌 圈的大小和清晰程度，來判斷受試菌對指示菌的抗菌能力。這6種芽泡桿菌當(dāng)中，MA139對4株指示菌表現(xiàn)由最強的抗菌能力（見表2-6、圖2-7 ）。表2-6初分離出6株芽抱桿菌對4株才旨7K菌的抑菌圈直徑菌株抑菌圈直徑/mmE. coliK88E.coliK99Staph.aureusS.typhimuriumMA2329.8 0.

43、635.6 0.746.80.540.60.8MA13932.0 1.035.9 0.747.50.542.50.7MA35728.2 0.435.0 0.645.40.840.80.7MA55931.30.933.6 0.844.4 1.138.30.9MA63429.6 0.731.5 1.245.60.638.6 1.0MA74431.0 1.033.6 0.645.70.838.4 1.1注：表中值為平均值士標(biāo)準(zhǔn)差*尸1圖2-7 MA139對指示菌的抑制作用（A、B、C、D分別代表對大腸桿菌K88、K99、鼠傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用）三、芽抱桿菌的抗逆性試驗與乳酸細菌的耐

44、受性試驗一樣，芬抱桿菌也需要進行類似的檢驗。芬抱桿菌必須在胃腸道存活，同時還必須能夠經(jīng)受住小腸液對菌體的破壞作用，也就是要求芬抱能夠抵抗小腸液中的膽鹽和 胰液素對它的毒害作用。分別提取生長羊（體重4060kg）的胃食糜和小腸食糜，分別是 用4層無菌醫(yī)用紗布擠壓過濾，取濾液，檢驗芬抱桿菌的耐受性。生羊胃液中含有的食糜量對胃酸的 pH有很大影響，食糜量越少， 酸度越大。為體現(xiàn)良好的代表性，生羊胃液的樣本數(shù)可以適當(dāng)多 一些（通常取10份）混合以后在用紗布擠壓過濾。經(jīng)過篩選出來細菌 MA139,活化兩次后接種于 MNB培養(yǎng)基中， 37 c下225r/min震蕩培養(yǎng)36h ,將培養(yǎng)液置于 80 c水浴保

45、溫 15min,離心收集芬抱（相對離心力為 2500 Xg, 5min ）,菌體用 磷酸緩沖液（PBS:0.144%NaHPO4,0.024%KHPO4,pH7.0）洗滌兩 次，最后復(fù)溶在PBS緩沖液中，即為菌懸液，用于后續(xù)的抗逆耐 受性試驗。從試驗的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在胃液中保持3h ,活性芬胞的數(shù)量基本沒有下降，證明其對胃酸的耐受性很好。在小腸液中，起始 24h 不生長，而24h后開始生長，培養(yǎng)液變得渾濁。在試驗的第 5 天，取樣染色分析，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液中有大量芬胞增殖。 表明MA139 在小腸液中開始受到了一定的抑制，但是隨著培養(yǎng)時間的延長， 能夠適應(yīng)這種環(huán)境。表明 MA139的芬抱可以在羊小腸中存

46、活弁 通過營養(yǎng)體增殖。四、芬抱桿菌的鑒定通過上述的分離篩選，我們獲得了比較有價值的桿菌MA139,但是這株桿菌還沒有經(jīng)過生理生化鑒定，我們只是從篩選的過程 中體現(xiàn)的發(fā)酪特性方面初步認為是芬抱桿菌。在投入應(yīng)用前，我們必須做嚴(yán)格的鑒定。.形態(tài)學(xué)鑒定首先進行形態(tài)學(xué)鑒定，觀察其單菌落的形態(tài)，弁對活細胞進行革 蘭氏染色及芬胞染色。MA139的細胞呈直桿狀，芬抱橢圓形近 中生，抱囊不膨大。在 MNA培養(yǎng)基上培養(yǎng)12h,產(chǎn)生黏液，細 胞形態(tài)為長桿狀；24h后菌落圓形，隆起，表面皺褶，不透明， 干燥；培養(yǎng)至36h,菌體均以休眠體芬抱的形式存在，菌落呈白 色圖2-8 (1)。在液體靜止培養(yǎng)時有菌膜形成。圖2-8

47、.生理生化鑒定形態(tài)鑒定結(jié)果(圖2-8)符合芬胞桿菌的特性，接著進行生理生 化鑒定。生理生化鑒定比較復(fù)雜，涉及的操作步驟很多。參照常 見細菌細菌系統(tǒng)鑒定手冊中的方法，對試驗菌種進行糖醇發(fā)酯試驗、需氧性測定、V-P試驗、淀粉水解試驗、明膠水解試驗、 過氧化氫酶試驗、檸檬酸鹽利用試驗、石蕊牛奶試驗等。芬抱桿菌鑒定用培養(yǎng)基如下：(1)糖醇發(fā)酯培養(yǎng)基及葡萄糖產(chǎn)氣試驗培養(yǎng)基組成：(NH，)2HPO4 1.0g/L;MgSo 4 7H20 0.2g/L ;酯母浸膏 0.2g/L。配好后加入2%勺澳百里香蘭指示劑1mL/L,調(diào)節(jié)pH為7.2,分 別加入1%勺底物(糖醇或者葡萄糖)，按照底物類型分裝試管， 弁將

48、杜蘭管口朝下放入試管，115 c滅菌30min。(2)運動型培養(yǎng)基瓊脂：3g/L;牛肉膏：3.0g/L;氯化鈉：5.0/g ;蛋白陳:10g/L。pH7.07.2。121c滅菌 15min。3) V-P試驗培養(yǎng)基 蛋白陳：5.0g/L ; K2HPO4:5.0g/L;葡萄糖: 5.0g/L。pH7.0 0.2o 2mL/支分裝試管,121c滅菌 15min。(4)耐鹽性試驗培養(yǎng)基營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基分別加入 2% 5% 7%10%勺 NaCl,pH7.07.2。121c滅菌 15min。(5)石蕊牛奶試驗培養(yǎng)基石蕊乙醇溶液25mL,脫脂牛奶1000mL, 4mL/支分裝試管，115 c滅菌 15mi

49、n。(6)檸檬酸鹽試驗培養(yǎng)基NaCl:5.0g/L; MgSO4 7H20:0.2g/L ;(NH4)H2PO4： 1.0g/L; K2HPO4： 1.0g/L;檸檬酸鈉：5.0g/L 澳 百里草酚蘭(濃度為4%)。pH6.8 0.2o分裝試管，121c滅菌15min。(7)明膠水解培養(yǎng)基蛋白陳：0.5%明膠：10%15%pH7.07.2。分裝試管，115 c滅菌20min。(8)淀粉水解試驗培養(yǎng)基 可溶性淀粉：20g/L; KNO3: 1.0g/L; NaCl:0.5g/L; K2HPO4: 0.5g/L ; MgSO4 7H2O:0.1g/L ; 瓊脂：2.0g/L o pH7.07.2。

50、121c 滅菌 15min。(9)厭氧生長試驗培養(yǎng)基營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，分裝厭氧試管，充氮除氧，121c滅菌15min。生理生化試驗結(jié)果見表2-9 o表2-9試驗菌的生理生化試驗結(jié)果項 目MA139項目MA139葡萄糖發(fā)醉+葡萄糖產(chǎn)氣-麥芽糖發(fā)醉+運動性+棉籽糖發(fā)醉+厭氧生長-乳糖發(fā)酵+淀粉水解試驗+甘露醇發(fā)醉+H2O2酶試驗+2%NaCl+檸檬酸鹽試驗+5%NaCl+石蕊牛奶還原+7%NaCl+V-P試驗+10%NaCl一明膠液化試驗+”為反應(yīng)陽性；，”為反應(yīng)陰性。根據(jù)生理生化的試驗結(jié)果，基本可以證明試驗菌MA139是芬抱桿菌。3.基因鑒定：16SrRNA分析為了進一步確證生理生化鑒定的可靠性，

51、還可以補充進行基因序列分析。16SrRNA分析是目前比較常用的分析手段。采用基因組DNA提純試劑盒提取 MAA139基因組DNA,弁以此為模版，選擇細菌16SrRNA基因特性引物進行 PCR擴增，弁對擴增產(chǎn)物提純回收，測定 16SrRNA序列。目前這種試驗 在實驗設(shè)備比較完善的生物研究所實驗室都能進行。其結(jié)果 證實MA139是枯草芬抱桿菌。五、芬抱桿菌的安全性評價確證了芬抱桿菌的特性，接下來需要考慮其安全性問題。益生菌菌種的安全性是研究開發(fā)中必須關(guān)注的問題。這其中包括：生產(chǎn)菌種必須屬于官方公布允許使用的飼用微生物 菌種；使用的菌種本身必須無毒無害，不會產(chǎn)生任何毒素； 不存在耐藥性的質(zhì)粒或者耐藥

52、性基因不存在轉(zhuǎn)移的問題。以下還以枯草芬抱桿菌 MA139為例，簡要說明進行芬胞桿菌 安全性評價的方法。安全性試驗的靶動物一般都選用老鼠，具體可參考如下方法：選擇12只體重基本一致的 SD大鼠(Sprague-Dawley,SD ) 初始體重在200220g比較適合，雌雄各半，分為兩個實驗 組，一組用5mL芬抱菌懸液(108cfu/mL )注射到大鼠腹腔 中；另一組用5mL生理鹽水注射大鼠作為試驗對照。注射前 禁食6h。灌服后觀察其中毒癥狀，看是否出現(xiàn)呼吸困難、抽 搐、肢體麻痹等。觀察時間為 1周。灌服MA139的芬抱后，所有大鼠均無明顯臨床癥狀， 無一死 亡，試驗組和對照組間，沒有明顯差異，證

53、明 MA139安全無 毒。六、抗生素敏感性試驗在實際生產(chǎn)中，絕大多數(shù)的動物飼料都添加了抗生素，動 物的腸道經(jīng)常處于抗生素壓力之下，這種選擇性壓力更容易 促進細菌間耐藥性基因的傳遞和轉(zhuǎn)移。所以在選擇菌種的時 候，對于哪些攜帶有可轉(zhuǎn)移耐藥性基因的質(zhì)粒的細菌，從長 遠考慮，在生產(chǎn)實際中一定不要采用。在抗生素尚未完全被 益生素類的綠色添加劑完全取代的時候，抗生素有時會與益 生素聯(lián)合添加，因而在菌株篩選的時候，會人為地篩選出對抗生素具有抗性的微生物應(yīng)用于實際，這種短期行為也加大 了耐藥性細菌擴散和轉(zhuǎn)移的可能。所以，為了確保芬抱桿菌 的使用效果，需要對抗生素的敏感性進行檢驗。研究結(jié)果顯示（表2-10 ,圖

54、 2-11）, MA139對試驗的十種抗 生素的敏感性不一樣，對桿菌肽 鋅不敏感，對其它的抗生素都有 一定的敏感性，對桿菌肽鋅的耐 藥性可能與產(chǎn)生桿菌肽的細菌具 有一定的同源性。圖2-11 MA139對抗生素的敏感性表2-10MA139對抗生素的敏感性抗生素名稱濃度抑菌圈直徑/mm結(jié)果判定大觀毒素Spectinomycin(SPT)100 Ng/片26.5+桿菌肽Bacitracin(B)0.04IU/片0.0-卡那霉素Kanamycin(K)30/片24.1+多黏BPolymyxinB(PB)300/片12.8+吠喃唾酮Furazolidone(FR)300/片21.3+紅毒素Erythro

55、mycin(E)15/片24.0+氯毒素Chloramphenicol(C)30/片28.7+四環(huán)素Tetracycline(TE)30/片17.7+萬古霉素Vancomycin(VA)30/片19.2+利福平Rifampin(RA)5/片27.8+注：+”為敏感；-8為不敏感。從上述分析可以發(fā)現(xiàn)，芬抱桿菌的分離篩選遠比乳酸菌復(fù) 雜，特別是在安全穩(wěn)定性方面的檢驗更是極為繁瑣。但是這些都是必須完成的工作，在實際生產(chǎn)過程中，任何步驟出現(xiàn)差錯都有 可能導(dǎo)致很嚴(yán)重的后果。第三節(jié)發(fā)酯飼料生產(chǎn)菌種的制備和保存在獲得了飼料生產(chǎn)菌種以后，需要對生產(chǎn)菌種進行擴大培養(yǎng) 和保存，在生產(chǎn)中稱為制種。生產(chǎn)企業(yè)的規(guī)模不同

56、，準(zhǔn)備生產(chǎn)菌 種的方式也有差別。大型生產(chǎn)企業(yè)由于用量比較大，往往自己制種，現(xiàn)生產(chǎn)現(xiàn)用。生產(chǎn)規(guī)模比較小的企業(yè)傾向于購買菌種，或者 部分購買，部分自己制備。在前期的敘述中，我們已經(jīng)知道，發(fā)酪飼料的生產(chǎn)菌種主要是 乳酸菌、酯母菌和芬抱桿菌?，F(xiàn)在就針對這三種微生物的擴大培 養(yǎng)和干燥保存進行論述。一、乳酸菌的培養(yǎng)乳酸菌是最常用的有益菌，一般都是厭氧菌，很難制成干粉，最好現(xiàn)培養(yǎng)現(xiàn)用。乳酸菌培養(yǎng)最簡便、最成熟的方式類似酸奶的發(fā)酪。在無抗生素 污染的牛奶中加入6.0%8.0%勺糖，經(jīng)過消毒，冷卻至37 c左右， 在無菌條件下接種、厭氧培養(yǎng)，就可以獲得比較理想的培養(yǎng)物。以下是在實際生產(chǎn)中采用的乳酸菌擴大培養(yǎng)方法

57、。選取無抗生素污染的純牛奶 10L,加入600800g白砂糖（也可用紅糖代替），加熱至6070 C,直至蔗糖完全溶解，然后分裝在500mL三角瓶中，用棉花塞塞緊，外包牛皮紙。在 110 c 左右消毒滅菌10min,冷卻至37 c左右，接種乳酸菌，這樣不 僅可以提高糖酸轉(zhuǎn)化效率，而且乳酸菌培養(yǎng)過程容易控制氣壓。在3640。恒溫培養(yǎng)2024h，就可以用于后續(xù)的發(fā)酪飼料擴大接種，乳酸菌培養(yǎng)液與發(fā)酯飼料的接種比例為0.2%&右。需要強調(diào)的是一定要用無抗生素污染的牛奶。乳酸菌一般對抗生素很敏感，溶液中只要有5mg/kg的抗生素就會對乳酸的生 長繁殖起到明顯的抑制作用，基本不能獲得合格的培養(yǎng)物。如果 沒有

58、合格的無抗生素污染牛奶，可以用無藥物污染的豆粕粉。豆粕經(jīng)過浸泡、磨漿以后可以替代牛奶，豆粕干物質(zhì)在溶液中的含 量為8.0炕右，類似于豆?jié){，其后續(xù)的補糖和接種發(fā)酪過程與牛 奶發(fā)酪過程類似。也可以用無抗生素污染的奶粉 （如新西蘭奶粉） 加水調(diào)漿（加水量是奶粉分量的8倍左右），恢復(fù)成原始牛奶的營養(yǎng)濃度。二、乳酸菌培養(yǎng)液的脫水干燥傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)液的干燥都是設(shè)法先除去培養(yǎng)液中的自由 水。但是對乳酸菌培養(yǎng)液來說，除水是比較困難的單元操作。乳 酸菌對熱和氧氣都很敏感，即使是高濃度的乳酸菌培養(yǎng)液， 其含水量一般都超過90%干物質(zhì)的含量不超過10%除水通常需要 較長的時間。對于厭氧的乳酸菌來說，與空氣接觸時間

59、越長，活 力損失也越大。采用常規(guī)的氣流干燥，乳酸菌的活性損失一般都要超過90% 以上。即使采用瞬時噴霧干燥，活力損失也要超過 85%脫水后 的制劑，在20c條件下，在空氣中暴露24h,活力損失就會達到 40%iZ上，給實際推廣造成很大困難。近年來，世界各地的畜牧科研工作者在活性乳酸菌的干燥保 存方面進行了大量研究，提出了很多高科技的方法， 其中比較常 用的方法是抽真空冷凍干燥和包埋造粒。但因成本造價高昂，弁不適合工業(yè)化生產(chǎn)。下面敘述是比較實用的乳酸菌脫水干燥方 法：一般普通的大麥、小麥和玉米等農(nóng)副產(chǎn)品的含水量都在14%左右，經(jīng)過100 c氣流干燥以后，可以比較簡單地把水份降低到 6%&右。然后

60、再用這些經(jīng)過干燥的載體以大比例（10倍以上）與乳酸絕培養(yǎng)液混合，使混合物的水份含量為11%20%從而使 乳酸菌處于休眠狀態(tài)，不易失活。干燥冷卻后的載體可以迅速的 吸附培養(yǎng)液中的游離水，然后在真空包裝。實驗表明，此方法保 存的乳酸菌，在室溫條彳下保存3個月，乳酸菌的活力可以保存 50%上，保存6個月時，乳酸菌的活力保存在 40炕右。此方 法簡便實用，成本低廉、質(zhì)量穩(wěn)定，保質(zhì)期長，且活性乳酸菌的 回收率較高。（一） 活性乳酸菌脫水干燥流程抽真空密封包裝干燥載體一|一混合乳酸菌培養(yǎng)一1（二）流程說明.載體的干燥載體為麥粉、玉米粉或者其他農(nóng)副產(chǎn)品。粉碎后過20目篩。對載體進行氣流干燥，檢測其含水量。將