Western-Blot常見(jiàn)問(wèn)題及處理總結(jié)

1、免疫細(xì)胞研究 western blotWestern Blot 常見(jiàn)問(wèn)題及處理總結(jié)阿木1、western blot 的優(yōu)點(diǎn)答： 靈敏，可達(dá) ng級(jí)，用 Ecl 顯色法理 論上可達(dá) pg 級(jí)。方便，特異性高。2、為什么我的細(xì)胞提取液中沒(méi)有目標(biāo)蛋白？答：原因有很多 : a) 你的細(xì)胞中不表達(dá)這 種蛋白質(zhì)，換一種細(xì)胞； b) 你的細(xì)胞中的 蛋白質(zhì)被降解掉了，你必需加入 PMSF ， 抑制蛋白酶活性； c) 你的抗體不能識(shí)別目 標(biāo)蛋白，多看看說(shuō)明，看是否有問(wèn)題。3、我的細(xì)胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，為什么呢？答： a) 有沉淀可能因?yàn)槟愕牡鞍讻](méi)有變 性完全，可以適當(dāng)提高 SDS 濃度，同時(shí) 將樣品

2、煮沸時(shí)間延長(zhǎng)， b) 也不排除你的 抗原濃度過(guò)高，這時(shí)再加入適量上樣緩沖 液即可。4、我做的蛋白質(zhì)分子量很小( 10KD )，請(qǐng)問(wèn)怎么做 WB ？答：可以選擇 0.2 m的l 膜，同時(shí)縮短轉(zhuǎn)移 時(shí)間。也可以將兩張膜疊在一起， 再轉(zhuǎn)移。其他按步驟即可。5、我的目的帶很弱，怎么加強(qiáng)？答：可以加大抗原上樣量。 這是最主要的。 同時(shí)也可以將一抗稀釋比例降低。6、膠片背景很臟，有什么解決方法？答：減少抗原上樣量，降低一抗?jié)舛龋淖円豢狗跤龝r(shí)間，提高牛奶濃度7、目標(biāo)帶是空白，周?chē)斜尘埃菫槭裁?？答：你的一抗?jié)舛容^高，二抗上 HRP 催 化活力太強(qiáng)，同時(shí)你的顯色底物處于一個(gè) 臨界點(diǎn)，反應(yīng)時(shí)間不長(zhǎng)，將周?chē)?/p>

3、物催化 完，形成了空白即 “反亮現(xiàn)象 ”。將一抗和 二抗?jié)舛冉档?，或更換新底物。、我的膠片是一片空白，是怎么回事？答：如果能夠排除下面的幾個(gè)問(wèn)題那么問(wèn)題多半出現(xiàn)在一抗和抗原制備上。a) 二抗的 HRP 活性太強(qiáng)，將底物消耗光；b) ECM 底物中 H2O2 ，不穩(wěn)定，失活；c) ECL 底物沒(méi)覆蓋到相應(yīng)位置； d) 二抗失活。9、我在顯影液中顯影 1 分鐘和 5 分鐘后 ,底片漆黑一片 ,是什么原因呢 ?答：a) 可能是紅燈造成的 , 膠片本來(lái)就被 曝光了，可以在完全黑暗的情況下操作 . 看是否有改善 .；b) 顯影時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。10、DAB 好還是 ECM 好？答：DAB 有毒，但是比較靈敏，是

4、 HRP 最敏感的底物； ECM 結(jié)果容易控制，但被催化時(shí)靈敏度差一點(diǎn)，但如果達(dá)到閥值，就特別靈敏，可以檢測(cè) pg 級(jí)抗原。要看你實(shí)驗(yàn)的情況。11、抗原檢測(cè)出的分子量比資料上的大，是怎么回事？答： a)抗原形成了二聚體。增多巰基乙醇 量，煮沸變性時(shí)間延長(zhǎng)， 可以打開(kāi)二聚體 b)蛋白本身的修飾如：糖基化，磷酸化等12、蛋白轉(zhuǎn)移不到膜上，但膠上有，同時(shí) Marker 轉(zhuǎn)上去了，為什么？答：可能是： a）樣品濃度過(guò)低； b）轉(zhuǎn)移時(shí)間不夠，。13、磷酸化抗體的檢測(cè)樣本制備時(shí)是否一 定要加 NaF 等？答： NaF 是一種廣譜磷酸化酶的抑制劑， 一般最好加。但是不加也可以，大部分時(shí) 候是不用加的。14、

5、要驗(yàn)證某個(gè)細(xì)胞上有無(wú)該蛋白的存在，需要做免疫組化和 western blot 試驗(yàn)嗎？做這兩個(gè)試驗(yàn)時(shí)的一抗和二抗可以共用嗎？答： 免疫組化可以用來(lái)進(jìn)行定位，但 是不能精確定量，而且有時(shí)會(huì)有假陽(yáng)性，不易與背景區(qū)分； Western blot 可以特異 性檢測(cè)某個(gè)蛋白質(zhì)分子，進(jìn)行定量，但是 不能定位。 兩種實(shí)驗(yàn)的一抗有時(shí)候不能通用，公司的產(chǎn)品說(shuō)明一般都會(huì)說(shuō)明可以進(jìn)行什么實(shí)驗(yàn)，在免疫組化時(shí)，是否適合石蠟切片或者冰凍切片。15、做 Western Blot 時(shí)，提取蛋白后凍存（未加蛋白酶抑制劑） ，用的博士德的一抗，開(kāi)始還有點(diǎn)痕跡，現(xiàn)在越來(lái)越差，上樣量已加到 120g，換了個(gè) santa cloz 的

6、一抗仍不行。是什么原因？蛋白酶抑制劑單加 PMSF 行嗎？答：懷疑是樣品問(wèn)題，可能是： 1，樣品 不能反復(fù)凍融； 2，樣品未加蛋白酶抑制 劑。同時(shí)，建議檢查 Western Blot 過(guò)程， 提高一抗?jié)舛?。?duì)于加蛋白酶抑制劑來(lái) 說(shuō)，一般加 PMSF 就可以了， 最好能多加幾中種蛋白酶抑制劑16、細(xì)胞水平要做 western blot ，多少細(xì)胞提的蛋白夠做 western blot ？答：一般 5106 就足夠了17、同一樣品能同時(shí)提 RNA 又提蛋白么？這樣對(duì) western blot 有無(wú)影響？答：能，沒(méi)有問(wèn)題同一蛋白樣品能同時(shí)進(jìn)行兩種因子的Western Blot 檢測(cè)嗎？答：當(dāng)然可以，

7、有的甚至可以同時(shí)測(cè)幾十種樣品。19、如果目標(biāo)蛋白是膜蛋白或是胞漿蛋白，操作需要注意什么？答：如果是膜蛋白和胞漿蛋白，所用的去 垢劑要溫和得多，這時(shí)最好加上 NaF 去抑 制磷酸化酶的活性。20、我的樣品的蛋白含量很低，每微升不 到 1 微克，但是在轉(zhuǎn)膜時(shí)經(jīng)常會(huì)發(fā)現(xiàn)只有 一部分蛋白轉(zhuǎn)到了膜上，就是在轉(zhuǎn)膜后染 膠發(fā)現(xiàn)有的孔所有的蛋白條帶都在，只是 顏色變淡了，有什么辦法可以解決？答：你可以加大上樣量，沒(méi)有問(wèn)題，還有轉(zhuǎn)移時(shí)你可以用減少電流延長(zhǎng)時(shí)間，加20甲醇。21、想分離的蛋白是分子量 200kd 的， SDS電泳的分離膠濃度多大合 適？積層膠的濃度又該用多少？這么大 分子量的蛋白容易作 Weste

8、rn Blot 嗎？答：200kd 的蛋白不好做， 分離膠用 7，積層膠 3.5。22、如果上樣量超載，要用什么方法來(lái)增加上樣量？答：可以濃縮樣品，也可以根據(jù)你的目標(biāo) 分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般 地，超載 30是不會(huì)有問(wèn)題的。 如果已經(jīng) 超了不少了，而且小分子量的也要，可以 考慮加大膠的厚度，可以試試 1.5mm 的。23、蛋白變性后可以存放多久？答：0，一兩年沒(méi)有問(wèn)題。最關(guān)鍵兩條：不要被蛋白酶水解掉；不要被細(xì)菌消化掉 （也是被酶水解了 ）24、我所測(cè)定的蛋白分子量是 105KD ，按理說(shuō)分離膠應(yīng)當(dāng)采用 7.5% ，但資料卻要求分離膠和濃縮膠均采用 11的配方， 不知為何？答：上述提到

9、的兩種凝膠均可以使用，因 為 105KD 的蛋白在上述兩種膠的線性分 辨范圍內(nèi)，但需注意條帶位置。25、二抗是生物素化的抗體，三抗是親和 素生物素體系，不知采用這樣的方案后， 封閉液是否要作調(diào)整，能否再用 5的脫 脂奶粉呢？好像有資料說(shuō)脫脂奶粉會(huì)影 響親和素生物素的生成，是嗎？ 解答：不能使用脫脂奶粉，因?yàn)槊撝谭?中含生物素，用代替應(yīng)該好一點(diǎn)26、問(wèn)一般一次上樣的蛋白總量是多少，跟目的蛋白的表達(dá)量有關(guān)系嗎？答： Western Blot 一般上樣 30100 微克 不等，結(jié)果跟目的蛋白的豐度、上樣量、 一二抗的量和孵育時(shí)間都有關(guān)系，也與顯 色時(shí)間長(zhǎng)短有關(guān)。開(kāi)始摸條件時(shí)，為了拿 到陽(yáng)性結(jié)果，各

10、個(gè)步驟都可以量多一點(diǎn)時(shí)間長(zhǎng)一點(diǎn)，當(dāng)然背景也就出來(lái)了。要拿到 好的結(jié)果，如果抗體好的話比較容易，抗 體不好的話就需要反復(fù)地試了，當(dāng)然有的 不適合 Western Blot 的怎樣做也不行。27、做組織樣品的 western 的時(shí)候，怎樣處理樣品？答：必須進(jìn)行研磨、勻漿、超聲處理，蛋 白質(zhì)溶解度會(huì)更好，離心要充分，膜蛋白 需用更劇 烈的方法抽提，低豐度膜蛋白 可能還要分步抽提 （超速離心 ）。還有一點(diǎn) 就是組織中的蛋白酶活性更強(qiáng)，需要注意 抑制蛋白酶的活性（加入） 。28、問(wèn)大分子量蛋白200KD ，在做 western要注意什么呢？答：做 200kd 蛋白的 Western Blot 時(shí)要注 意

11、，分離膠最好選擇 7% 的；剝膠時(shí)要小 心；轉(zhuǎn)移時(shí)間需要相應(yīng)延長(zhǎng)；要做分子量參照（否則出現(xiàn)雜帶不知道如何分析）29、有什么方法可以提高上樣量？答： a）可以濃縮樣品；增大上樣體積來(lái)增 大上樣量； b）用 5 倍的上樣緩沖液來(lái)稀釋30、蛋白的上樣量有沒(méi)有什么具體的要求？答：上樣量要根據(jù)實(shí)驗(yàn)的要求來(lái)定， 如果要求是定量和半定量的 Western Blot則上樣量要均等，如果只是要定性，則沒(méi)有太大的關(guān)系， 盡量多上就行了， 但是不要超載.31、一抗，二抗的比例是否重要？答：比較重要， 調(diào)整好一抗， 二抗的比例， 可以去掉部分非特異的本底。32、要做磷酸化某因子 Western Blot ，其 二抗有

12、何要求？答：對(duì)二抗無(wú)要求，要看你實(shí)驗(yàn)條件來(lái)選 擇，一般推薦用 HRP 標(biāo)記的二抗。33、免疫組化和 Western Blot 可以用同一種抗體嗎？答：免疫組化時(shí)抗體識(shí)別的是未經(jīng)變性處 理的抗原決定簇（又稱表位） ，有些表位 是線性的，而有的屬于構(gòu)象型；線性表位 不受蛋白變性的影響，天然蛋白和煮后的 蛋白都含有；構(gòu)象型表位由于受蛋白空間 結(jié)構(gòu)限制，煮后變性會(huì)消失。如果你所用 的抗體識(shí)別的是蛋白上連續(xù)的幾個(gè)氨基 酸，也就是線性表位，那么這種抗體可同 時(shí)用于免疫組化和 Western ，而如果抗體 識(shí)別構(gòu)象形表位，則只能用于免疫組化。34、Western Blot 中抗體的可以重復(fù)應(yīng)用嗎？答：抗體工

13、作溶液一般不主張儲(chǔ)存反復(fù)使 用，但是如抗體比較珍貴，可反復(fù)使用 2 3次。稀釋后應(yīng)在 23天內(nèi)使用， 4度 保存，避免反復(fù)凍融。35、在做 Western Blot 時(shí)， PVDF 膜用甲醇浸泡的目的？答： PVDF 膜用甲醇泡的目的是為了活化 PVDF 膜上面的正電基團(tuán)，使它更容易跟 帶負(fù)電的蛋白質(zhì)結(jié)合，做小分子的蛋白轉(zhuǎn) 移時(shí)多加甲醇也是這個(gè)目的。36、檢測(cè)同一抗體的磷酸化和非磷酸化的 抗原可以在同一張膜上嗎？答：可以。37、轉(zhuǎn)膜后經(jīng)麗春紅染色的條帶，為什么 大蛋白分子的一端的轉(zhuǎn)膜好象不是很好， 為什么？ 答：這是正常的，大分子的蛋白轉(zhuǎn)移的慢，你延長(zhǎng)轉(zhuǎn)移時(shí)間和電流，大分子一端就會(huì)好的多，但是

14、小分子的就有可能會(huì)變淡。38、做 Western Blot 時(shí)，同樣的抗體免疫組化能做出，而 Western Blot 卻不能？ 答：這多半是抗體的問(wèn)題，要看抗體的說(shuō) 明，是否能做 Western Blot 和免疫組化39、如果是 68 轉(zhuǎn)印膜，要加多少一抗？答：一抗的稀釋度是有說(shuō)明的，根據(jù)你的 一抗看看就知道了，但是那么大的膜孵育 體積一般最少為 3 5ml 。40、上下槽緩沖液有何要求，怎樣才能達(dá)到最佳效果答：無(wú)特殊要求。但我們一般是上槽放新 鮮的緩沖液，下槽可以是重復(fù)使用過(guò)一兩 次的緩沖液41、跑電泳的時(shí)候配的膠總是 “縮”是什么 原因呢？是有的成分不對(duì)嗎？答：沒(méi)什么問(wèn)題，就是你膠里的水

15、分被蒸 發(fā)了。過(guò)夜時(shí)拿保鮮膜包起來(lái)，在里面加 點(diǎn)水保持濕度就可以了；也可能母液（30%聚丙酰胺）有問(wèn)題，你可以重新配 制一份觀察；能夠替換的試劑，盡量換一 下，選用好的試劑。42、蛋白質(zhì)的分子量跨度很大，如要分離 小 21KD ，中至 66KD ，大至 170KD ，可 以一次做好嗎？ 答：這么廣的分布不好轉(zhuǎn)移，一般建議：21kd 和 66kd 可以一起轉(zhuǎn)， 12SDS， 濕轉(zhuǎn) 120mA ， 45-60min就可以了， 可以根據(jù)你實(shí)驗(yàn)室的經(jīng)驗(yàn)調(diào)節(jié)； 170kd 用 7%SDSPAGE，200mA90-120min。43、不能很好地將大分子量蛋白轉(zhuǎn)移到膜 上， 轉(zhuǎn)移效率低怎么樣解決？答：可以考

16、慮： 轉(zhuǎn)移緩沖液中加入 20%甲 醇（是指終濃度），因?yàn)榧状伎山档偷鞍?質(zhì)洗脫效率，但可增加蛋白質(zhì)和 NC 膜的 結(jié)合能力，甲醇可以防止凝膠變形，甲醇 對(duì)高分子量蛋白質(zhì)可延長(zhǎng)轉(zhuǎn)移時(shí)間；轉(zhuǎn)移 緩沖液加入終濃度 0.1%SDS，也是為了增 加轉(zhuǎn)移效率；用優(yōu)質(zhì)的轉(zhuǎn)移膜，或使用小 孔徑的 NC 膜（ 0.2微米） .44、我用的是可視 marker ，但是電泳總 跑不全 8 條帶，請(qǐng)問(wèn)什么原因？怎樣改 善？膠用過(guò) 8，10，12，都是這樣marker 是新買(mǎi)的。答：一般來(lái)說(shuō)，是小分子量 Marker 跑走 了，增加膠濃度或減少電泳時(shí)間試試看。當(dāng)然梯度膠也是不錯(cuò)的選擇。45、是否 Western Blo

17、t 實(shí)驗(yàn)半定量一定要加 ACTIN 內(nèi)參？答：對(duì)于發(fā)表文章的實(shí)驗(yàn)最好加內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)嚴(yán)謹(jǐn)。46、核內(nèi)抗原 Western Blot 內(nèi)參選擇什么合適？答：可以選用組蛋白，組蛋白在細(xì)胞核中 的表達(dá)是很穩(wěn)定的，有很多都可以當(dāng)成內(nèi) 參，在網(wǎng)上查查就可以選出你要的內(nèi)參。47、做半定量 Western Blot ，內(nèi)參 -actin ， GAPDH 哪個(gè)好？答：選用 beta-actin 就可以48、想問(wèn)一下細(xì)胞裂解液選擇蛋白酶抑制劑時(shí)有什么原則嗎？受不受組織來(lái)源的影響？胞膜和胞漿有區(qū)別嗎？答：一般來(lái)說(shuō)提取時(shí)加入廣譜的蛋白酶抑 制劑就可以了，操作時(shí)保持低溫。除非有 文獻(xiàn)特別指明用特殊的方法，一般來(lái)說(shuō)都 沒(méi)有

18、區(qū)別。49、轉(zhuǎn)膜后的脫脂奶粉封閉液是 5% 的TBST 脫脂奶粉 ”，其中 TBST 最后那個(gè) T是 Tween 嗎，濃度多大？答：是 Tween，配方如下 :Tris-BufferedSaline Tween-20 (TBST), NaClg，Trisbase：2.42g 加水00ml 溶解 , 加500-1000ul 的 Tween-20, 用 HCl 調(diào)節(jié)pH 至 7.4, 加水定容至 1L.50、封閉，一抗，二抗時(shí)的溫度有沒(méi)有什么規(guī)定呢，比如在室溫里做，或者要在 4度下?答：均可在室溫進(jìn)行，如果時(shí)間不夠，一抗孵育可以先在室溫進(jìn)行一個(gè)小時(shí)，然后4 度過(guò)夜。51、請(qǐng)問(wèn)一下 PVDF 膜和硝酸膜結(jié)合蛋白的原理是什么？答：一般而言，硝酸纖維素膜是通過(guò)疏水作用來(lái)和蛋白質(zhì)相聯(lián)，這樣的話，反復(fù)洗幾次后，蛋白容易掉下來(lái)，結(jié)果較差。PVDF 膜主要通過(guò)它膜上的正電荷和蛋白 接合，同時(shí)也有疏水作用，但相對(duì)較弱。 這樣的話， PVDF 膜和蛋白接合較牢，不 易脫落，結(jié)果較好。52、怎樣