《環(huán)境毒理學概論》實驗教案資料

1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。環(huán)境毒理學概論實驗教案-環(huán)境毒理學概論實驗教案孟慶俊，張明青中國礦業(yè)大學環(huán)境與測繪學院20083實驗一魚類回避試驗一目的與要求1學習魚類回避反應的生物學機理；了解回避裝置的結構，設計原理及使用方法；掌握回避試驗的操作步驟及試驗結果的計算和分析。2實驗前要求學生預習實驗指導書的內容，對整個實驗過程要熟悉，要有整體概念，充分理解實驗原理。二實驗的組織安排1由于學生人數(shù)較多，本實驗共分兩次進行，即每次一個班，每班分4組。2進入實驗室后，先由教師對實驗的原理等內容進行講解，告之實驗已準備的相關內容、學生要做的主

2、要工作，以及實驗中應請注意的有關事項。然后才能按部就班地進行實驗。三實驗原理魚類回避反應屬于行為毒理學的研究范疇，它闡明水生動物對污染物是否回避，及其引起回避的濃度，以期對水體污染進行早期預報，并為制定和評價漁業(yè)水質標準提供重要依據(jù)。本試驗以魚為試驗動物進行回避試驗。魚類的嗅覺、味覺、視覺、和側線等感受器對環(huán)境刺激具有保護性的本能反應，即回避反應。利用魚類對受污染水產(chǎn)生回避反應的特點，認為世界污染水區(qū)和非污染水區(qū)的迷宮回避裝置，給魚以污染物刺激，魚能主動躲避污染水區(qū)，迅速游向清潔水區(qū)，據(jù)此觀察污染物對魚的回避行為影響。四實驗準備（一）器材與試劑按照實驗指導書準備相關實驗器材，主要是Y型回避裝置

3、，并配制相關化學試劑。（二）實驗生物從市場提前一周購買實驗用魚，可以是當?shù)乜梢砸姷娜魏我环N魚，但不應過大，體長在4cm左右即可，在實驗室內馴養(yǎng)，以備實驗所用。五步驟和方法（一）預備試驗這部分內容由實驗教師在學生的正式實驗前來完成，主要的目的是確定實驗濃度范圍。具體的步驟如下：按魚類急性毒性試驗方法，求出待測物的96hLC50值。本實驗以資料中查得的96hLC50值為參考。魚類對銅是非常敏感的，因此實驗所選的受試化合物為硫酸銅。選用不同的魚種，以1/2和1/1096hLC50為試驗濃度，進行探索性的回避試驗，確定試驗用敏感魚種和試驗濃度范圍。調節(jié)供水系統(tǒng)的流量用24支20L的下口瓶構成可調的自供

4、水系統(tǒng)。以活動夾調節(jié)水流速度，用液體流量計測量水流量，使水流量為200400ml/min。（三）回避試驗步驟試驗槽全部注入清潔水，將試驗魚（110尾）移入槽中，讓其在槽內適應1530min。關閉供排水系統(tǒng)，將試驗魚全部驅入混合區(qū)，配置所需濃度的待測物。觀察于記錄目測計數(shù)，觀察污染物對魚的回避行為的影響，打開供排水系統(tǒng)，移去隔板，每分鐘（或每30s）監(jiān)視和記錄一次進入清潔區(qū)和污染區(qū)的魚數(shù)。歷時2030min。重復四次，每次試驗結束后，以清水洗凈試驗槽，間隔15min后，再行重復試驗（即每一試驗濃度重復四次，即兩槽各注入待測液，二次清潔水）。然后更換待測物的濃度。六結果和報告實驗結果后一周內要把實

5、驗報告交至實驗室，報告書中要重點寫明實驗的原始數(shù)據(jù)、實驗數(shù)據(jù)的處理過程與結果，實驗結論與討論等內容，字跡清楚，條理分明。七注意事項1試驗魚需預先在實驗室條件下馴養(yǎng)一周，且為健康魚種。2必須保持實驗室環(huán)境的安靜，有恒定的溫度和均一的光照條件。3嚴格控制槽中清潔水和試驗待測溶液的流速。4試驗應按由低濃度到高濃度的順序進行。每個濃度試驗結束后在更換濃度試驗時，都必須用清水洗凈回避裝置。5當待測物濃度低時，須先配成母液備用。6如待測物易揮發(fā)，試驗時應在回避裝置上加蓋，以免揮發(fā)，影響試驗液濃度。7記錄時，進入回避槽混合區(qū)的魚，不予記錄和計算。實驗二污染區(qū)沉積物對水生動物的急性毒性試驗（魚類急性毒性試驗）

6、0.0028-2.8mg/L一目的與要求1通過本實驗，熟悉和掌握急性毒性試驗的設計、條件、操作步驟，以及試驗結果的計算、分析和報告等全過程。2做好實驗預習工作。二實驗的組織安排1實驗生物的準備及相關的預實驗由實驗室教師來完成。2學生實驗分兩次進行，一次一個班，每班分10個組。3進入實驗后，先由教師簡單講解實驗原理、過程與注意事項，并說明實驗生物的準備與馴養(yǎng)過程。然后再開始正式的實驗。三實驗原理魚類對水環(huán)境的變化反應十分靈敏，當水體中的污染物達到一定程度時，就會引起一系列中毒反應，例如行為異常、生理功能紊亂、組織細胞病變、直至死亡。在規(guī)定條件下，使魚接觸含不同濃度受試物的水溶液，實驗至少進行24

7、小時，最好以96小時為一個實驗周期，在24、48、72、96小時時記錄實驗魚的死亡率，確定魚類死亡50%時的受試物的濃度。魚類毒性試驗在研究水污染及水環(huán)境質量中占有重要地位。考慮到污染沉積物的取樣難度，本實驗采用金屬銅作為受試物，測定其對魚類的急性毒性。四實驗準備1實驗魚的選擇與馴養(yǎng)試驗用的魚必須對毒物敏感，具有一定的代表性，便于實驗條件下飼養(yǎng)，來源豐富，個體健康，我國可采用的試驗魚有四大養(yǎng)殖淡水魚(青魚、草魚、鰱魚和鳙魚)、金魚、鯽魚等。本實驗選用草魚作為實驗魚。選用的試驗魚在試驗前必須在實驗室內以過馴養(yǎng)，使這適應實驗室條件的生活環(huán)境，至少馴養(yǎng)7天。馴養(yǎng)期間應每天換水，喂食12次，但在試驗前

8、一天應停止喂食，以免影響實驗結果。馴養(yǎng)期間試驗魚死亡率不得超過5%。2實驗儀器設備相關玻璃器皿。主要是1L的玻璃燒杯。五操作步驟1預實驗用于確定正式實驗所需濃度范圍，由實驗教師在學生正式實驗前完成。2正式實驗:根據(jù)預實驗的結果，在包括使魚全部死亡的最低濃度和96h魚類全部存活的濃度之間至少設置5個濃度組，并以幾何級數(shù)排布。每個濃度組至少設23個平行，每一個系列設一個空白對照。試驗魚的數(shù)目以每組實驗濃度1020尾合適.在24h、48h、72h、96h后檢查受試魚的狀況。如果沒有任何肉眼可見的運動即可判斷魚已死亡。觀察并記錄死魚數(shù)目后，將死魚從容器中取出。試驗結束時，對照組的死亡率不得超過10%。

9、六實驗報告1數(shù)據(jù)處理計算出24h、48h、72h、96h的半致死濃度(LC50)值，并計算95%的置信限。依據(jù)LC50值的大小和下表標準，確定銅對魚的急性毒性分級。魚LC50值(mg/L)10000毒性分級劇毒高毒中等毒低毒微毒2編寫報告在實驗報告中應包括試驗名稱、目的、試驗原理、試驗的準確起止日期。還有如下幾項：(1)試驗魚的種名、來源、體重、體長、健康和馴化狀況。(2)受試物質的名稱、來源、物化性質和保存方法。(3)實驗用水的來源、物化性質和實驗前的處理等。(4)實驗溶液的濃度與配置方法、實驗溫度。(5)實驗條件(6)實驗開始后24h、48h、72h、96h的半致死濃度(LC50)值，及其

10、毒性分級。(7)實驗結果討論等。七注意事項1生物材料選擇上應盡可能選擇敏感種，其年齡，大小應盡量一致。2試驗期間，對照組魚死亡率不得超過10%。3試驗宜在控溫室中進行，并保持一定的光強度。實驗三重金屬對魚肝過氧化氫酶的影響一目的與要求學習應用生物化學方法研究污染水體中重金屬對魚類的影響，掌握生物監(jiān)測的一個測試手段。二實驗的組織安排1實驗前由實驗室內的教師準備購買實驗用魚、進行室內染毒處理及相關器皿和化學試劑的準備。2兩個班同時進行實驗，4-6人一個小組。但由于實驗歷時較長，操作較復雜，要求安排時間上要找整塊的時間，如一個下午。三原理過氧化氫酶普遍存在于動物、植物和微生物細胞中。它催化分解細胞代

11、謝產(chǎn)生的H2O2和還原某些其他氧化物。在調節(jié)細胞免于死亡過程中其重要作用。過氧化氫每含有豐富的疏基，重金屬可與酶的疏基活其他活性基團相互作用，從而改變酶的活性，呈現(xiàn)致毒作用。過氧化氫酶催化分解H2O2，以H2O2消耗量來表示過氧化氫酶的活力。酶活力測定原理如下：2H2O2O2+2H2O剩余的H2O2用碘量法定量測定：H2O2+2KI+H2SO4I2+K2SO4+2H2OI2+2Na2S2O32NaI+Na2S4O6四設備與材料（一）設備1玻璃勻漿機；2解剖器具；3普通臺式分離機；4定時鐘；5恒溫水?。?滴定管（10ml，酸式）；7碘量瓶（100ml）。（二）試劑1）0.5mol/LH2SO4；

12、2）10%KI；3）0.01g/LNa2S2O3；4）0.01mol/L，PH6.8磷酸緩沖液：A稱取1.3610g的KH2PO4溶至1000ml，B稱取3.5816g的Na2HPO4溶至1000ml，取A與B大致同體積配成PH6.8的磷酸緩沖液；5）H2O2磷酸緩沖液：取1ml30%的H2O2試液，用0.01mol/L，PH6.8磷酸緩沖液稀釋至1000ml；6）淀粉指示劑：取0.3g可溶性淀粉，以少量冷蒸餾水拌勻，倒入沸水中，冷卻后，加入0.1g的Na2CO3，用蒸餾水稀釋至50ml；7）1%鉬酸銨溶液；8）0.25mol/L蔗糖溶液。（三）實驗材料處理測定重金屬離子對魚96hLC50值，

13、再以1/21/6LC50濃度的重金屬離子試液，將實驗用魚在試液中暴露96h。五步驟和方法酶勻漿制備將處理后的魚殺死，剝離肝臟，用濾紙吸干，稱重，按1:10（W/V）加入14冷0.25mol/L蔗糖液，勻漿，以1500r/min離心5min，取上清液，用0.25mol/L蔗糖稀釋20倍，置于14環(huán)境中，供測定酶活力使用。過氧化氫酶活力測定過氧化氫酶活力測定操作程序表測定組試劑試劑空白組處理組對照組0.01mol/LPH6.8H2O2磷酸緩沖液5ml5ml5ml25水浴中恒溫1分鐘2ml0.5mol/LH2SO41ml酶液1ml酶液25水浴中準確保溫3分鐘（混勻）1ml酶液2ml0.5mol/LH

14、2SO4(破壞酶活性)2ml0.5mol/LH2SO410%KI0.5ml0.5ml0.5ml1%鉬酸銨1滴1滴1滴混勻后放置3分鐘，用0.01g/LNa2S2O3滴定，達淺黃色時，加淀粉23滴，滴定至藍色消失。六結果和報告（一）過氧化氫酶活力以單位時間酶促分解H2O2的微克分子數(shù)表示。計算公式如下：酶活力=A處理組樣品消耗的Na2S2O3（ml）。B對照組樣品消耗的Na2S2O3（ml）。C試劑空白消耗的Na2S2O3（ml）。3反應時間3分鐘。2消耗2個分子的Na2S2O3相當于1個分子的H2O2。F酶液的稀釋倍數(shù)，本實驗為200。NNa2S2O3的當量濃度（g/L）。1000毫克分子換算

15、成微克分子的放大倍數(shù)。（二）過氧化氫酶實驗記錄表格試劑空白（C）處理組（A）對照組（B）123123456123456消耗的Na2S2O3（ml）fN(g/L)酶活力說明記錄人_七注意事項1實驗用魚應選擇規(guī)格相近的同種同齡魚。2測定過氧化氫酶活力的魚樣品數(shù)不得少于6條。3整個酶活力測定操作過程應在低于25室溫下進行。酶促反應必須在25恒溫下進行。4酶促反應時間必須計時準確。5滴定消耗0.01g/L的Na2S2O3在6ml左右為合適。超過或低于此值，應調節(jié)稀釋倍數(shù)。6實驗記錄表中，“酶活力”以下的記錄項目，只對處理組和對照組適用?！罢f明”一欄可記錄中毒試劑的濃度，或其他相應的實驗條件，以及在實驗

16、中出現(xiàn)的意外情況。實驗四氟化物對植物的靜態(tài)熏氣染毒試驗一目的與要求通過試驗掌握氣態(tài)污染物對植物毒性的染毒過程與方法，觀察大氣中氟化氫對典型植物的毒害癥狀。二實驗的組織安排1實驗前學生根據(jù)植物對氟化氫的敏感程度，在校園里自己采集植物樣本。其它儀器與試劑的準備由實驗室教師完成。2兩個班同時進行實驗，4-6人一個小組。三實驗原理隨著我國經(jīng)濟的發(fā)展，工業(yè)、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、日常生活和交通運輸向大氣中排放的污染物的數(shù)量和種類日益增加，這些大氣污染物直接或間接危害著植物。其中大氣中氟化物污染造成的危害情況日趨嚴重，目前，酸雨、溫室效應和臭氧層的破壞是現(xiàn)在世界范圍內的三大問題，而大氣中的氟化物與這三個問題都密切相關

17、，有關大氣中氟化物污染方面的研究也成為當前環(huán)境科學研究的重要內容，引起了人們的廣泛重視。通常情況下植物體內也含有一定量的氟，但當植物體內氟含量超過植物所能承受的量時植物就會受到傷害。因此，大氣中的氟化物超過一定量時就會對植物造成傷害。而氟化氫是毒性較強的大氣污染物之一，這類污染物在空氣中的濃度為1ppb到數(shù)十個ppb時即產(chǎn)生危害。而且氟化氫是能引起酸性危害的污染物。氟化物對植物的外型和生長發(fā)育產(chǎn)生直接影響外，還產(chǎn)生間接影響影響，主要表現(xiàn)為植物生長減弱、降低對病蟲害的抵抗能力。當大氣中氟的濃度超過110-9時，就能在植物體內富集，通過食物鏈危害人體健康。它對植物的毒性比二氧化硫要大，在同一濃度下

18、，氟化氫的傷害比二氧化硫要大10倍以上。氟化氫對植物危害的毒理主要在于它與葉片中的鈣質發(fā)生反應形成氟化鈣，干擾酶的作用，并阻礙植物正常的代謝，破壞葉綠素與原生質，使細胞失水而枯萎?？諝庵械姆瘹鋵χ参锏奈：哂蟹e累性的特點，即使空氣中氟化氫的濃度很低，也能被葉片吸收，并不斷累積。當葉片中氟的數(shù)量積累到一定限度時，就要出現(xiàn)傷害癥狀。氟化氫還有使植物葉片褪綠和過早落葉現(xiàn)象，使生長受到抑制，對結實過程也有影響。氟化氫對花粉粒萌發(fā)和花粉管伸長有抑制作用。氟污染還能使成熟前的桃、杏等果實在沿縫合線處的果實過早成熟軟化，降低產(chǎn)量。氟化氫對植物的急性危害癥狀表現(xiàn)為：傷斑出現(xiàn)的部位主要分布在葉尖和葉緣，氟化氫

19、經(jīng)氣孔進入葉內后，首先溶解在葉內的組織液中，然后轉移至葉尖和葉緣。當累積至一定程度后，就要干擾酶的活性，阻礙代謝活動，使葉肉細胞發(fā)生質壁分離和萎縮。這時葉尖和葉緣發(fā)生壞死現(xiàn)象，逐漸變成褐紅色，呈現(xiàn)特異的灼燒狀。有的植物受氟化氫危害時，最初在葉尖和葉緣出現(xiàn)水浸漬狀，再漸漸變成淺黃白色，最后變成褐紅色傷斑。另外，在受害的葉片上，健康組織（綠色部分）與壞死組織（傷斑部分）之間形成一條明顯的紅色或深褐色的分界線，壞死組織逐漸枯死。嚴重受害時，傷斑還可從葉緣向較大的葉脈之間發(fā)展，并向葉基部展延。水稻和小麥受氟化氫受害時，先在新葉的尖端和邊緣出現(xiàn)褪綠黃化現(xiàn)象。特別是抽穗前后的劍葉和幼穗的頂部最為敏感，常很

20、快出現(xiàn)受害癥狀，由綠變?yōu)榛揖G。當氟化氫的濃度增高時，葉尖、葉緣的傷斑迅速擴展，甚至幾小時內就使葉片變成褐色或黃白色，幾天后就要枯萎。對氟化氫敏感的植物有油菜、田芥菜、西風古、燕麥草、秋水仙、賣瓶草、墻生藜、繁縷、鳶尾草、水仙、萱草、風信子、唐菖蒲、鴨茅、馬蘭、鈴蘭、美人蕉、仙客來、沙列布、郁金香、杏樹、梨樹、桃樹、棗樹、，歐洲鵝耳櫪、德國鳶尾、樟葉槭、細子龍、阿爾卑斯忍冬、松樹、杜鵑、落葉松、金絲桃、楓以及禾本科、蓼科、藜科、石竹科、薔薇科、葡萄科、百合科、羊茅科、黃花茅屬植物等。對氟化氫抗性強的植物有蘋果樹、柑桔樹、芒果樹、海桐、麻瘋樹、構樹、山茶、女貞、陰香、大葉紫薇、牛乳樹、細葉榕、菩提

21、樹、十字花科和菊科植物等。四設備與材料（一）設備烘箱，微量注射器（10.0、5.0ml各一只），聚乙烯塑料瓶（100、50ml），玻璃鐘罩，60目篩、培養(yǎng)皿、陶瓷研缽、容量瓶（1000ml、500ml、250ml）、聚四氟燒杯（50ml）（二）試劑40%氟化氫溶液（分析純），用于配制熏氣的氟化氫溶液。（三）材料在校園中現(xiàn)場采集受試植物的帶葉枝條，根據(jù)對氟化氫的敏感程度，分別采集適量的敏感植物與抗性植物至少各一種，一部分用于氟化氫熏氣，一部分作為對照。五實驗過程1靜態(tài)熏氣采集待測植物帶葉枝條，于三角瓶中以清水供養(yǎng)，分放于兩個大鐘罩中，置于日光燈下，另準備二個培養(yǎng)皿，內放9cm濾紙3-5張，一個滴

22、入蒸餾水5ml，另一個滴入5mlHF溶液，立即分放于二個鐘罩內，在光照下放置1-2h，然后打開鐘罩，根據(jù)試驗需要，不加清洗或用去離子水快速清洗后，取部分葉片在60-80。C烘箱鐘充分干燥12-48h（隨植物組織性質而定），待測。2觀察植物的受害癥狀，并將枝條上剩余的其他葉片留下，過24h觀察后續(xù)植物的傷害癥狀。六結果和報告觀察植物樣品的受害癥狀。植物名稱癥狀樣品來源報告人：七注意事項1樣品分析是一項要求嚴格而細致的工作，烘樣品溫度控制在80攝氏度以下，粉碎后搖充分均勻。2熏氣濃度的合理選擇與控制是本實驗的重要因素，應注意鐘罩的密閉程度，正確操作。實驗五植物中氟化物含量的分析一目的與要求學習用酸

23、提取，離子選擇電極法測定植物中氟化物的方法，熟悉和掌握操作步驟及實驗結果的計算、數(shù)據(jù)分析，寫出相應的報告。二實驗的組織安排1實驗的儀器與器皿、試劑由實驗室內教師完成。2兩個班同時進行實驗，4-6人一個小組。三原理氟在植物中以易溶的無機鹽形似存在，用酸或堿都可以從植物中提出氟離子，在常溫下，用稀HCl、H2SO4、HNO3、HClO4等均可提取植物中的氟離子。本實驗采用酸浸提，離子選擇電極法，適用于樣品中可溶性氟化物的測定。一氟化鑭電極為指示電極，飽和甘汞電極為參比電極，當提取液中存在氟離子時，在氟電極上產(chǎn)生電位響應。工作電池表示如下：AgAgCl，Cl-，F(xiàn)-LaF3試液飽和甘汞電極當溶液中總

24、離子強度為定值時，電池的電動勢E依能斯特方程隨待測液中氟離子濃度變化而變化。E=E。-LgCF-E與LgCF-成直線關系，2.303RT/F為該直線的斜率（25時為59.16）。與氟離子形成絡合物的多價陽離子如F3+，Al3+及SiO32-干擾測定，用總離子強度緩沖液消除干擾離子及酸度影響。氟離子選擇電極法最低檢出濃度為0.1g/ml。四設備與材料儀器氟電極，飽和甘汞電極PXD-12型數(shù)字式離子計（或其他高精度數(shù)字式離子計。此外，也可用PHS-2型酸度計目測讀數(shù)）磁力攪拌器合磁性攪棒振蕩器植物磨粉機微量注射器（0.25ml）聚乙烯塑料瓶（500，100，50ml）自動加液器（10，5ml）植物

25、材料在氟污染區(qū)或人工熏氣罩鐘處理的供試植物與清潔區(qū)采集的同種植物及其同位葉，根據(jù)試驗需要，不加清洗或用去離子水快速清洗后，在6080烘箱鐘充分干燥1248h（隨植物組織性質而定），磨粉，過60目篩，分裝于塑料瓶中待測。五步驟和方法（一）試劑配制1制去離子水：測氟過程中所用的水均用去離子水。2提取液：0.1NHClO4-13ml（7072，AR）HClO4稀釋至1L:或0.5NH2SO4-14ml（比重1.84，AR）H2SO4稀釋至1L，任選一種即可。3總離子強度緩沖液（TISAB）：檸檬酸鈉-硝酸鉀溶液：147g檸檬酸鈉（Na3C5H5O7H2O）和50gKNO2，溶解后稀釋至1L。4氟標準

26、貯備液：稱優(yōu)級純氟化鈉（預先在105，烘2h）2.2105g，用去離子水稀釋至500ml，此溶液每ml含氟200ppm，冰箱保存。（二）稱樣及提取稱樣前，振搖裝樣品的瓶子，充分混勻，稱取100-500mg（視含氟量高低而定）。置于50ml塑料瓶中，加10ml酸液，于振蕩器或攪拌器上提取20min，提畢，加10ml緩沖液，待測。（三）測定可采用標準曲線法和標準加入法任選一種進行測定。標準曲線直接測定配置工作液：將氟標準液自冰箱中取出，放至常溫。吸取1ml，即為10ppm/ml的工作液。標準曲線制作：取5個50ml的容量瓶，依次放入工作液1、2、3、4、5ml，加10ml硫酸和10ml緩沖液，用去離子水定容至刻度，即為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ppm/ml的氟標準液系列。測量：標準液濃度由低到高依次倒入50ml塑料杯中，將已漂洗到空白電位值（-320mv）的F電極，用濾紙輕吸水分，與參比的甘汞電極插入溶液中，在中速攪拌下，12min電位達到穩(wěn)定（在低濃度F溶液中，電極的響應時間比高濃度的略長），測得mv值E。作圖：在半對數(shù)坐標紙上以電極電位位橫坐標，氟濃度為縱坐標繪制E-logCF曲線。樣品測定