專題二微生物的培養(yǎng)與應用必記知識點

1、專題二微生物的培養(yǎng)與應用課題一微生物的實驗室培養(yǎng)培養(yǎng)基：人們按照微生物對營養(yǎng)物質的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養(yǎng)基質，是進行微生物培養(yǎng)的物質基礎。培養(yǎng)基按照物理性質可分為液體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基。在液體培養(yǎng)基中加入凝固劑瓊脂（是從紅藻中提取的一種多糖，在配制培養(yǎng)基中用作凝固劑）后，制成瓊脂固體培養(yǎng)基。微生物在固體培養(yǎng)基表面生長，可以形成肉眼可見的菌落。根據菌落的特征可以判斷是哪一種菌。液體培養(yǎng)基應用于工業(yè)或生活生產，固體培養(yǎng)基應用于微生物的分離和鑒定，半固體培養(yǎng)基則常用于觀察微生物的運動及菌種保藏等。按照成分培養(yǎng)基可分為人工合成培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基。合成培養(yǎng)基是用成分已知的化學物

2、質配制而成，其中成分的種類比例明確， 常用于微生物的分離鑒定。 天然培養(yǎng)基是用化學成分不明的天然物質配制而成，常用于實際工業(yè)生產。按照培養(yǎng)基的用途，可將培養(yǎng)基分為選擇培養(yǎng)基和鑒定培養(yǎng)基。選擇培養(yǎng)基是指在培養(yǎng)基中加入某種化學物質，以抑制不需要的微生物生長，促進所需要的微生物的生長。鑒別培養(yǎng)基是根據微生物的特點，在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學藥品配制而成的，用以鑒別不同類別的微生物。培養(yǎng)基的化學成分包括水、無機鹽、碳源、氮源、生長因子等。碳源：能為微生物的代謝提供碳元素的物質。如CO2、NaHCO3等無機碳源；糖類、石油、花生粉餅等有機碳源。異養(yǎng)微生物只能利用有機碳源。單質碳不能作為碳源。氮源：能

3、為微生物的代謝提供氮元素的物質。如 N2、NH3、NO3-、NH4+ （無機氮源）蛋白質、氨基酸、尿素、牛肉膏、蛋白胨（有機氮源）等。只有固氮碳生物才能利用 N2。培養(yǎng)基還要滿足微生物生長對pH、特殊營養(yǎng)物質以及氧氣的要求。例如，培養(yǎng)乳酸桿菌時需要在培養(yǎng)基中添加維生素， 培養(yǎng)霉菌時須將培養(yǎng)基的 pH 調至酸性， 培養(yǎng)細菌是需要將pH 調至中性或碳堿性， 培養(yǎng)厭氧型碳生物是則需要提供無氧的條件。獲得純凈培養(yǎng)物的關鍵是防止外來雜菌的入侵，要注意以下幾個方面：對實驗操作的空間、操作者的衣著和手，進行清潔和消毒。將用于微生物培養(yǎng)的器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進行滅菌。為避免周圍環(huán)境中微生物的污染，實驗

4、操作應在酒精燈火焰附近進行。實驗操作時應避免已經滅菌處理的材料用具與周圍的物品相接觸。消毒與滅菌的區(qū)別：消毒指使用較為溫和的物理或化學方法僅殺死物體表面或內部一部分對人體有害的碳生物（不包括芽孢和孢子） 。 消毒方法常用煮沸消毒法， 巴氏消毒法 （對于一些不耐高溫的液體） 還有化學藥劑 （如酒精、 氯氣、石炭酸等）消毒、紫外線消毒。滅菌則是指使用強烈的理化因素殺死物體內外所有的碳生物， 包括芽孢和孢子。 滅菌方法有灼燒滅菌、干熱滅菌、高壓蒸汽滅菌。滅菌方法：接種環(huán)、接種針、試管口等使用灼燒滅菌法； TOC o 1-5 h z 玻璃器皿、金屬用具等使用干熱滅菌法，所用器械是干熱滅菌箱；培養(yǎng)基、無

5、菌水等使用高壓蒸汽滅菌法，所用器械是高壓蒸汽滅菌鍋；表面滅菌和空氣滅菌等使用紫外線滅菌法，所用器械是紫外燈。比較項理化因素的作用強度消滅微生物的數量芽抱和抱子能否被消滅較為溫和部分生活狀態(tài)的微生物不能滅菌強烈全部微生物能制作牛肉膏蛋白月東固體培養(yǎng)基：(1)方法步驟：計算、稱量、溶化、滅菌、倒平板。(2)倒平板操作的步驟：將滅過菌的培養(yǎng)皿放在火焰旁的桌面上，右手拿裝有培養(yǎng)基的錐形瓶，左手拔出棉塞。右手拿錐形瓶，將瓶口迅速通過火焰。用左手的拇指和食指將培養(yǎng)皿打開一條稍大于瓶口的縫隙，右手將錐形瓶中的培養(yǎng)基(約1020mL)倒入培養(yǎng)皿，左手立即蓋上培養(yǎng)皿的皿蓋。等待平板冷卻凝固，大約需 510min

6、。然后，將平板倒過來放置，使培養(yǎng)皿蓋在下、皿底在上。倒平板操作的討論.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到 50 c左右時，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計培養(yǎng)基的溫度？ 提示：可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時，就可以進行倒平 板了。.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？答：通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？答：平板冷凝后，皿蓋上會凝結水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使 培養(yǎng)基表面的水分更好地揮發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。.在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，

7、這個平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？答：空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個平板培養(yǎng)微生物。純化大腸桿菌：(1)微生物接種的方法最常用的是平板劃線法和稀釋涂布平板法。(2)平板劃線法是通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作。將聚集的菌種逐步稀釋分散 到培養(yǎng)基的表面。在數次劃線后培養(yǎng)，可以分離到由一個細胞繁殖而來的肉眼可見的子細胞群體，這就是 菌落。(3)稀釋涂布平板法是將菌液進行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固 體培養(yǎng)基的表面，進行培養(yǎng)。分為系列稀釋操作和涂布平板操作兩步。(4)用平板劃線法和稀釋涂布平板法接種的目的是：使聚集在一

8、起的微生物分散成單個細胞，從而 能在培養(yǎng)基表面形成單個的菌落，以便于純化菌種。(5)平板劃線法操作步驟：將接種環(huán)放在火焰上灼燒，直到接種環(huán)燒紅。在火焰旁冷卻接種環(huán)，并打開棉塞。將試管口通過火焰。將已冷卻的接種環(huán)伸入菌液中蘸取一環(huán)菌液。將試管通過火焰，并塞上棉塞。左手將皿蓋打開一條縫隙，右手將沾有菌種的接種環(huán)迅速伸入平板內，劃三至五條平行線，蓋上皿蓋。注意不要劃破培養(yǎng)皿。灼燒接種環(huán)， 待其冷卻后， 從第 一區(qū)域劃線的末端開始往第二區(qū)域內劃線。 重復以上操作， 在三、四、五區(qū)域內劃線。注意不要將最后一區(qū)的劃線與第一區(qū)相連。將平板倒置放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。平板劃線操作的討論：為什么在操作的第一步以及每次

9、劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結束時， 仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？答：操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數的增加，使每次劃線時菌種的數目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結束后灼燒接種環(huán)，能及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細菌污染環(huán)境和感染操作者。在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進行劃線？答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？答：劃線后，線條末端細菌的數

10、目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細菌的數目隨著劃線次數的增加而逐步減少，最終能得到由單個細菌繁殖而來的菌落。6 ）涂布平板操作的步驟：將涂布器浸在盛有酒精的燒杯中。取少量菌液，滴加到培養(yǎng)基表面。將沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃盡后，冷卻 810s。用涂布器將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面。涂布平板操作的討論：涂布平板的所有操作都應在火焰附近進行。結合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想，第2步應如何進行無菌操作？提示：應從操作的各個細節(jié)保證“無菌” 。例如，酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍；等等。菌種的保存：1 ）對

11、于頻繁使用的菌種，可以采用臨時保藏的方法。臨時保藏方法將菌種接種到試管的固體斜面培養(yǎng)基上，在合適的溫度下培養(yǎng)。當菌落長成后，將試管放入4 的冰箱中保藏。以后每 36個月，都要重新將菌種從舊的培養(yǎng)基上轉移到新鮮的培養(yǎng)基上。缺點：這種方法保存的時間不長，菌種容易被污染或產生變異。2 ）對于需要長期保存的菌種，可以采用甘油管藏的方法。在3mL的甘油瓶中，裝入1mL甘油后滅菌。將1mL培養(yǎng)的菌液轉移到甘油瓶中，與甘油充分混勻后，放在 20的冷凍箱中保存。課題二 土壤中分解尿素的細菌的分離與計數尿素是一種重要的農業(yè)氮肥，尿素并不能直接被農作物吸收。只有當土壤中的細菌將尿素分解成氨之后，才能被植物利用。土

12、壤中的細菌之所以能分解尿素，是因為他們能合成脲酶。尿素最初是從人的尿液中發(fā)現的。篩選菌株：1 ）實驗室中微生物的篩選應用的原理人為提供有利于目的菌株生長的條件（包括營養(yǎng)、溫度、 pH 等） ，同時抑制或阻止其他微生物生長。2 ）選擇性培養(yǎng)基在微生物學中，將允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基，稱作選擇培養(yǎng)基。3 ）配制選擇培養(yǎng)基的依據根據選擇培養(yǎng)的菌種的生理代謝特點加入某種物質以達到選擇的目的。例如，培養(yǎng)基中不加入有機物可以選擇培養(yǎng)自養(yǎng)微生物；培養(yǎng)基中不加入氮元素，可以選擇培養(yǎng)能固氮的微生物；加入高濃度的食鹽可選擇培養(yǎng)金黃色葡萄球菌等。統計菌落數目：1 ）測定微生

13、物數量的常用方法有稀釋涂布平板法和顯微鏡直接計數。2 ）稀釋涂布平板法統計樣品中活菌的數目的原理。當樣品的稀釋度足夠高時，培養(yǎng)基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌。通過統計平板上的菌落數，就能推測出樣品中大約含有多少活細菌。為了保證結果準確，一般設置35個平板，選擇菌落數在30300的平板進行計數，并取平均值。統計的菌落數往往比活菌的實際數目低，因此，統計結果一般用菌落數而不是活菌數來表示。采用此方法的注意事項：、一般選取菌落數在30300 之間的平板進行計數、為了防止菌落蔓延，影響計數，可在培養(yǎng)基中加入 TTC3、本法僅限于形成菌落的微生物設置對照：設置對照的主要目的是排除實驗

14、組中非測試因素對實驗結果的影響，提高實驗結果的可信度。對照實驗是指除了被測試的條件以外，其他條件都相同的實驗，其作用是比照試驗組，排除任何其他可能原因的干擾，證明確實是所測試的條件引起相應的結果。實驗設計：實驗設計包括實驗方案，所需儀器、材料、用具和藥品，具體的實施步驟以及時間安排等的綜合考慮和安排。1 ）土壤取樣：同其他生物環(huán)境相比，土壤中的微生物，數量最大，種類最多。在富含有機質的土壤表層，有更多的微生物生長。從富含有機物、潮濕、pH7的土壤中取樣。鏟去表層土，在距地表約3 8cm 的土壤層取樣。2 ）樣品的稀釋：樣品的稀釋程度將直接影響平板上生長的菌落數目。在實際操作中，通常選用一定稀釋

15、范圍的樣品液進行培養(yǎng)，以保證獲得菌落數在30300 之間、適于計數的平板。測定土壤中細菌的數量，一般選用 104 105 106測定放線菌的數量，一般選用 103 104 105測定真菌的數量，一般選用 102 1031043 ）微生物的培養(yǎng)與觀察不同種類的微生物，往往需要不同的培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間。細菌3037， 12 天；放線菌 2528，57 天；霉菌 2528， 34 天每隔 24 小時統計一次菌落數目，選取菌落數目穩(wěn)定時的記錄作為結果，這樣可以防止因培養(yǎng)時間不足而導致一樓菌落的數目。一般來說，在一定的培養(yǎng)條件下（相同的培養(yǎng)基、唯獨及培養(yǎng)時間） ，同種微生物表現出穩(wěn)定的菌落特征。課題三

16、分解纖維素的微生物的分離纖維素，一種由葡萄糖首尾相連而成的高分子化合物，是地球上含量最豐富的多糖類物質。纖維素與纖維素酶：1 ）棉花是自然界中纖維素含量最高的天然產物，木材、作物秸稈等也富含纖維素。2 ）纖維素酶是一種復合酶，一般認為它至少包括三種組分，即C1 酶、 CX 酶和葡萄糖苷酶，前兩種酶使纖維素分解成纖維二糖，第三種酶將纖維二糖分解成葡萄糖。纖維素最終被水解成葡萄糖，為微生物的生長提供營養(yǎng)。纖維素分解菌的篩選：1 ）篩選方法：剛果紅染色法。能夠通過顏色反應直接對微生物進行篩選。2 ）剛果紅染色法篩選纖維素分解菌的原理：剛果紅是一種染料，它可以與像纖維素這樣的多糖物質形成紅色復合物，但并不和水解后的纖維二糖和葡萄糖發(fā)生這種反應。當我們在含有纖維素的培養(yǎng)基中加入剛果紅時，剛果紅能與培養(yǎng)基中的纖維素形成紅色復合物。當纖維素被纖維素酶分解后，剛果紅纖維素的復合物就無法形成，培養(yǎng)基中會出現以纖維素分解菌為中心的透明圈。這樣，我們就可以通過是否產生透明圈來篩選纖維素分解菌。分離分解纖維素的微生物的實驗流程：土壤取樣-選擇培養(yǎng)（此步是否需要，應根據樣品中目的菌株數量的多少來確定）-梯度稀釋-將樣 品