多聚酶鏈式反應-極好

1、 課題2多聚酶鏈式反應擴增DNA片斷1概念：PCR即_，是一種體外迅速擴增DNA片段的技術。它能以極少量的_為模板，在短時間內復制出上百萬份的DNA拷貝。多聚酶鏈式反應DNA 遺傳疾病的診斷、 刑偵破案、 古生物學、 基因克隆 DNA序列測定。2 、PCR技術 的應用 一、基礎知識（一）回憶DNA的復制 回答相關問題1、發(fā)生時間：發(fā)生在細胞有絲分裂的間期和減數(shù)第一次分裂間期。2、特點(方式)：邊解旋邊復制半保留復制多起點復制3、合成條件模板：原料：游離的脫氧核苷酸DNA兩條鏈能量：ATP酶:解旋酶、DNA聚合酶反應條件溫和4、場所：細胞核(主)、線粒體、葉綠體DNA母鏈：提供復制的模板解旋酶：

2、打開DNA雙鏈4種脫氧核苷酸：合成子鏈的原料DNA聚合酶：催化合成DNA子鏈ATP：為復制過程提供能量引物：使DNA聚合酶從引物的3端開始連接脫氧核苷酸（二）DNA復制的條件12345脫氧核苷酸結構1DNA的平面結構：OOPOHO堿基OOHOOPOHOOH堿基堿基脫氧核糖磷酸基團堿基脫氧核糖堿基脫氧核糖53磷酸二酯鍵DNA3端，5端指什么。DNA的羥基(-OH)末端稱為3端，而磷酸基團的末端稱為5端。脫氧核苷酸 鏈 結構目錄上頁下頁習題參考書返回ATGCATGC5，端含磷酸基團3，端含羥基3，端5，端目錄上頁下頁習題參考書返回DNA聚合酶的特性 - 專一性 DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，

3、而只能從3端延伸DNA鏈。因此，DNA復制需要引物。觀察圖 2復制的方向：2 方向：子鏈的5端向 3端延伸。（1）、 DNA 分子的熱變性原理DNA雙鏈單鏈 變性（加熱80-100） 復性（緩慢冷卻）變性的目的：解開雙鏈:解開氫鍵 在80100 的溫度范圍內，DNA的雙螺旋結構將解體，雙鏈分開，這個過程稱為2、PCR原理變性 高溫解決了打開雙鏈的問題，但是，又導致DNA聚合酶失活的問題，耐高溫的Taq DNA聚合酶解決了高溫導致DNA聚合酶失活的問題，促成了PCR技術的自動化。（2）、Taq DNA聚合酶的應用（3）、PCR 反應的條件DNA模板；分別與兩條模板鏈相結合的兩種引物（引物和引物）

4、；四種脫氧核苷酸；耐高溫的聚合酶（Taq DNA聚合酶）；控制溫度，但不需解旋酶；需要在一定的緩沖液中進行。PCR 反應需要的這些條件的原因是什么？1234522557294時間（min）溫度（）適溫延伸高溫變性低溫復性重復13步30輪（1）、步驟：變性 復性延伸二、PCR的反應過程 5/3/3/5/5/3/引物5/3/引物變性95oC復性55oC延伸72oC5/3/3/5/5引物15引物2第二次復制第一次復制55 55 5 5模板DNA55 555 5 552530 次循環(huán)（復制）后，模板DNA的含量可以擴大100萬（220）倍以上。2、PCR的反應結果從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作

5、為模板參與反應，并且由引物延伸而成的DNA單鏈會與引物結合，進行DNA的延伸 DNA聚合酶只能特異性地復制處于兩個引物之間的DNA序列，使這段固定長度的序列呈指數(shù)擴增。三、 PCR反應的實驗操作1、PCR儀設備及用具2、微量離心管一種薄壁塑料管，總容積為0.5ml3、微量移液器 用于定量轉移PCR配方中的液體，其上的一次性吸液槍頭用一次更換一次實質上一臺能夠自動調控溫度的儀器三、 PCR反應的實驗操作（1）按配方將所需試劑擺放在實驗桌上（準備）（2）用微量移液器按配方在微量離心管中依次加入各組分（移液）（3）蓋嚴離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁（混合）（4）將微量離心管放在離心機上（離心）（

6、5）將離心管放入PCR儀上，設置好PCR儀的循環(huán)程序（反應）循環(huán)數(shù)變性復性延伸第一次94C,10min30次4，30s55，30s72，1min最后一次4，1min55，30s72，1minPCR技術高度靈敏，為了避免外源DNA等因素的污染而造成干擾實驗，PCR操作時要注意做到：（6）、注意事項隔離操作區(qū)，所用微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用必須進行高壓滅菌；分裝試劑，簡化操作程序，使用一次性槍頭四、結果分析與評價DNA 含量的測定：稀釋對照調零測定計算（ DNA含量（g/mL）50(260nm的讀數(shù))稀釋倍數(shù)）波長260nm處讀數(shù)蒸餾水做對照50倍（一）理論上DNA擴增數(shù)目的計算四

7、、課題成果評價1 、一條DNA，復制n次， DNA為2 n2 、 a條DNA，復制n次， DNA為a x2 n（二）實驗中DNA含量的測定1 、原理 可以通過測量DNA含量來評價擴增的效果，DNA在260nm的紫外線波段有一強烈的吸收峰，峰值的大小與DNA的含量有關五、 課題延伸例如：PCR產(chǎn)物每輪循環(huán)增加一倍，30輪循環(huán)擴增量達230個拷貝（109拷貝）PCR技術是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術。 它具有特異性強、敏感性高、產(chǎn)率高、 快速、 簡便、重復性好、易自動化等突出特點。體內DNA復制與PCR的技術區(qū)別：體內復制PCR技術解旋在解旋酶作用下，細胞提供ATP，部分解開加熱到94oC,雙鏈全部解開，不需解旋酶引物一小段RNA一般用DN