基因工程學(xué)原理內(nèi)蒙古大學(xué)

1、第七章 克隆基因的表達(dá)邢萬(wàn)金內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院二、克隆基因的表達(dá)外源基因mRNARNAPol載體外源基因大腸桿菌一、基因克隆第一節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)1. 真核生物的基因用cDNA2. 不能直接用真核基因組DNA（帶有內(nèi)含子）3. 必須利用原核細(xì)胞的調(diào)控原件（啟動(dòng)子等）5. 防止外源基因產(chǎn)物對(duì)宿主細(xì)胞的毒害4. 有Shine-Dalgarno（S-D）序列一、原核表達(dá)真核基因的注意事項(xiàng)是DNA上的能與RNA聚合酶結(jié)合并能起始mRNA合成的序列。大腸桿菌的所有啟動(dòng)子中都有兩段一致順序（consensus sequence）。二、原核生物基因表達(dá)的調(diào)控元件1. 啟動(dòng)子-35 Box 和

2、 -10 Box（1） 啟動(dòng)子序列 原核或噬菌體啟動(dòng)子MCSSD序列終止子大腸桿菌啟動(dòng)子的一致序列ACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTCCATCGAATGGCGCAAAACCTTTCGCGGTATGGCATGATAGCGCCCGGAATTTATTCCATGTCACACTTTTCGCATCTTTGTTATGCTATGGTTATTTGGATCCTACCTGACGCTTTTTATCGCAACTCTCTACTGTTTCTCCATACGCCGTGATTATAGACACTTTTGTTACGCGTTTTTGTCATGGCTTTGGTCAAATGA

3、GCTGTTGACAATTAATCATCGAACTAGTTAACTAGTACGCAAGTTCCAAAACGTGTTTTTTGTTGTTAATTCGGTGTAGACTTGTAAACCTACATAATCGACTTGTAAACCAAATTGAAAAGATTTAGGTTTACAAGTCTACAACGTAACACTTTACAGCGGCGCGTCATTTGATATGATGCGCCCCGCTCAAAAAAATACTTGTGCAAAAAATTGGGATCCCTATAATGCGCCTCCGTCAATTTTTCTATTGCGGCCTGCGGAGAACTCCCTATAATGCGCCTCCATAAAATAAATGCT

4、TGACTCTGTAGCGGGAAGGCGTATTATGCACACCCCG-35 region -10 regionlaclacIgalP2araBADaraCtrpbioAbioBtRNAtyrrrnD1rrnE1rrnA1一致序列T C T T G A C A T.11-15bp.T A T A A T.5-8bp.A5142 38 82 84 79 64 53 45 41 79 95 44 59 51 96 C55 T48 G42轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)5-TTGACA-35-TATAAT-32）-10 box（Pribnow Box）TTGACATATAAT轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)17 bp5核糖體結(jié)合位點(diǎn)R

5、NA聚合酶 s亞基的識(shí)別位點(diǎn) 。1）-35 box （Sextama box）原核啟動(dòng)子共有序列的功能Sextama-35Pribnow-10XXXX TTGACA XXXXXXXXXXXXXXXXX TATXXXX AACTGT XXXXXXXXXXXXXXXXX ATAAAT XXXXXXX XXTTA XXXXXXX XXXXXXXXXXXXXXAGTC16 -19bp5-9bpInitiation2. 翻譯的起始位點(diǎn)（1）核糖體結(jié)合位點(diǎn)（ RBS）1）Shine-Dalgarno（SD） 序列：mRNA上與核糖體16sRNA結(jié)合的序列。S-D序列距離AUG的距離也影響翻譯核糖體小亞基1

6、6S rRNA 35UCCUCCASD 序列mRNA 5AGGAGGUAUG位于SD序列后，目的基因前。2）轉(zhuǎn)錄終止子3）起始密碼在表達(dá)載體克隆位點(diǎn)的下游所設(shè)計(jì)一段轉(zhuǎn)錄終止序列。啟動(dòng)子操縱子S-D序列目的基因終止子AUG（91%）GUG（8%）UUG（1%）大腸桿菌偏愛UAAU。一般安置上全部的三個(gè)終止密碼防止核糖體跳躍。4）終止密碼5）翻譯增強(qiáng)子Translation enhancer能夠顯著增強(qiáng)外源基因在大腸桿菌細(xì)胞中的表達(dá)效率的特殊序列。T7噬菌體基因10前導(dǎo)序列（簡(jiǎn)稱g10-L序列）;大腸桿菌atpE基因mRNA5-UTR中富含U的區(qū)段。（1）強(qiáng)啟動(dòng)子能使外源基因的蛋白產(chǎn)量達(dá)到細(xì)胞總蛋

7、白的10%-30%以上。（2）低水平的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄不誘導(dǎo)時(shí)很少表達(dá)。（3）應(yīng)是可誘導(dǎo)型的用溫度或化學(xué)試劑誘導(dǎo)。1. 最佳啟動(dòng)子必須具備的條件三、基因工程常用的原核啟動(dòng)子2. 基因工程常用的原核生物啟動(dòng)子（1） 乳糖啟動(dòng)子lac1）來(lái)源可用乳糖或其類似物IPTG誘導(dǎo)。lacPlacO目的基因lac Zlac Ylac Alac Plac Olac I結(jié)構(gòu)基因來(lái)自于大腸桿菌的乳糖操縱子：2）結(jié)構(gòu)CAP結(jié)合區(qū)RNA聚合酶結(jié)合區(qū)阻遏物結(jié)合區(qū)核糖體結(jié)合區(qū)（包含lacZ的前8個(gè)密碼）HaeIII片斷（ “可移動(dòng)的lac啟動(dòng)子小片斷”）。HaeIIIHaeIIICAP結(jié)合區(qū)RNA聚合酶結(jié)合區(qū)阻遏物結(jié)合區(qū)核糖體結(jié)

8、合區(qū)203 bp（2）色氨酸啟動(dòng)子 trptrpRP1OtrpEtrpDP2trpCtrpBtrpAtrpR阻遏蛋白基因；P1P2啟動(dòng)子；O操縱基因；衰減子來(lái)自大腸桿菌色氨酸操縱子:P1O目的基因（3）PL和PR啟動(dòng)子1）來(lái)源cIIINPL/OLcIPMOR/PRCroPEcIIN:抗終止蛋白；Cro: 抗阻遏蛋白(裂解必需的）；cI, cII, cIII: 阻遏蛋白；P:啟動(dòng)子；O:操縱子。R:右；L:左PL/OLOR/PR目的基因目的基因噬菌體的啟動(dòng)子(比lac啟動(dòng)子的活性高8-10倍，比trp啟動(dòng)子活性高):阻遏物轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄當(dāng)cI合成后，與OL和OR結(jié)合阻止RNA聚合酶，則左右基因都受到抑

9、制。但促進(jìn)PM使cI進(jìn)一步轉(zhuǎn)錄。進(jìn)入溶原期。cIIINPL/OLcIPMOR/PRCroPEcII早期左邊轉(zhuǎn)錄早期右邊轉(zhuǎn)錄3）調(diào)節(jié)基因用cI85742oC時(shí)阻遏蛋白失活，外源基因大量轉(zhuǎn)錄cI857PL外源基因28oC時(shí)阻遏PL，外源基因不轉(zhuǎn)錄。是一個(gè)溫度敏感性的突變基因：2）表達(dá)載體常用噬菌體啟動(dòng)子PL（4）大腸桿菌表達(dá)常用的啟動(dòng)子啟動(dòng)子（來(lái)源）調(diào)節(jié)作用誘導(dǎo)作用Lac (E. coli)lacI, lacIQ; lacIts, IPTG；溫度Trp (E. coli)色氨酸饑餓，吲哚丙烯酸Lpp (E. coli)IPTG，乳糖phoA (E. coli)phoB(正)；phoR(負(fù))磷酸饑餓

10、recA (E. coli)lexA萘啶酮酸araBAD (E. coli)AraCL阿拉伯糖proU (E. coli)滲透性Cst-1 (E. coli)葡萄糖饑餓tetA(E. coli)四環(huán)素cadA(E. coli)cadRpHnar(E. coli)fnr厭氧環(huán)境，硝酸鹽離子Tac(雜）(E. coli)lacI, lacIQIPTGTrc(雜)(E. coli)lacI, lacIQ; lacIts, IPTG；溫度啟動(dòng)子（來(lái)源）調(diào)節(jié)作用誘導(dǎo)作用Lpp-lac (E. coli)lacI, lacIQ; lacIts, IPTG；溫度Psyn (E. coli)lacI, lac

11、IQIPTGPLtet0-1(E. coli)無(wú)水四環(huán)素Plac-ara-1 (E. coli)IPTG，阿拉伯糖PL (噬菌體)lacIts857溫度PL-9G-50 (噬菌體)溫度cspA (E. coli)溫度PR-PL (噬菌體)lacIts857溫度T7(T7噬菌體)級(jí)聯(lián)系統(tǒng)IPTGT7-lac(T7,E. coli)lacIQIPTGPL-T7(,T7)lacIts857; lacIQ溫度;IPTGT3-lac(T3)lacIQIPTGT5-lac(T5)lacI, lacIQ; IPTGT4基因32(T4)T4感染nprM-laclacIQIPTGVHb(vitreoscilla

12、)氧氣，cAMP-CAP四、外源蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)部位1. 細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)（1）包涵體（inclusion body）細(xì)胞質(zhì)中的一種不溶性蛋白質(zhì)聚集折疊而成的晶體結(jié)構(gòu)物。50%以上的重組蛋白，其余為核糖體元件、RNA聚合酶、外膜蛋白o(hù)mpC、ompF和ompA等，環(huán)狀或缺口的質(zhì)粒DNA，以及脂體、脂多糖等，大小為，難溶與水，只溶于變性劑如尿素、鹽酸胍等。1）組成成分2）形成原因重組蛋白的表達(dá)過程中缺乏某些蛋白質(zhì)折疊的輔助因子，或環(huán)境不適，無(wú)法形成正確的次級(jí)鍵等。 表達(dá)量過高。 含硫氨基酸多。 溫度高或胞內(nèi)pH接近蛋白的等電點(diǎn)。 重組蛋白是大腸桿菌的異源蛋白。3）包涵體表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)重組蛋白易于分

13、離、免受細(xì)菌蛋白酶降解、不損害寄主細(xì)胞回收的蛋白生物活性差。4）缺點(diǎn)5）減少包涵體形成的策略 降低重組菌的生長(zhǎng)溫度。 添加可促進(jìn)重組蛋白質(zhì)可溶性表達(dá)的生長(zhǎng)添加劑。 供給豐富的培養(yǎng)基，最佳培養(yǎng)條件，如氧、pH等。 2. 周質(zhì)中表達(dá)（1）周質(zhì)（periplasm）格蘭氏陰性大腸桿菌位于內(nèi)膜和外膜之間的細(xì)胞結(jié)構(gòu)部分。容易被濃縮和純化、有利于正確折疊、被降解的少。（2）周質(zhì)表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)一般位于N端，為15-30 aa 。真核與原核的結(jié)構(gòu)相似, 功能相似，可以互換。 堿性氨基酸N疏水氨基酸核心區(qū)Arg、LysLeu、IleAlaGlySer信號(hào)肽酶切割位點(diǎn)外源蛋白（3）信號(hào)肽（signal peptide

14、）phoA、OmpA、OmpT、OmpF、LamB、-內(nèi)酰胺酶（lactamase）、腸毒素（enterotoxin）ST-II、LT-B等 大腸桿菌的信號(hào)肽：1）常用的原核信號(hào)肽 胡蘿卜歐氏桿菌PelB蛋白。 金黃色葡萄球菌的蛋白A。 枯草芽孢桿菌內(nèi)切葡聚糖酶（endoglucanase）。由于需要穿過兩層膜，大腸桿菌只能分泌極少的蛋白質(zhì)到培養(yǎng)基中，效果都不太理想。溶血素（hemolysin）、使在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)的外源蛋白分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中。3. 胞外表達(dá)細(xì)菌素釋放蛋白（bacteriocin release protein)。（1）策略與大腸桿菌細(xì)胞的分泌蛋白融合表達(dá)。（2）優(yōu)點(diǎn)1

15、）蛋白質(zhì)受酶解作用最少2）蛋白質(zhì)容易純化（胞外蛋白種類很少）（3）缺點(diǎn)1）外源真核蛋白一般不會(huì)被分泌到胞外2）分泌的量很稀。載體表達(dá)出的外源基因蛋白質(zhì)不與細(xì)菌的任何蛋白質(zhì)融合在一起。S-D序列ATG -外源基因- TAA（1）優(yōu)點(diǎn)五、幾種類型的原核表達(dá)載體1. 非融合型表達(dá)載體產(chǎn)物結(jié)構(gòu)接近于真核細(xì)胞體內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。（2）缺點(diǎn)容易被宿主蛋白酶破壞、或形成包涵體。哈佛大學(xué)的Gilbert實(shí)驗(yàn)室建立的。表達(dá)能力強(qiáng)。（1）pKK223-3 載體1）組成結(jié)構(gòu)： 強(qiáng)啟動(dòng)子: tac（trp-lac）:trp的-35區(qū)lacUV5的-10區(qū)lacO操縱基因操縱基因：終止子：調(diào)節(jié)基因：宿主菌染色體上的乳糖操

16、縱子調(diào)節(jié)基因Lac I。rrnB的強(qiáng)終止子S-D插入位點(diǎn)區(qū)S-D序列和插入位點(diǎn)區(qū)：載體的其余部分：來(lái)自pBR322質(zhì)粒。2）表達(dá)誘導(dǎo)tac PLac OS-D插入位點(diǎn)區(qū)rrnB T宿主lac IIPTG阻遏物IPTGRNA聚合酶EcoRISmaIBamHISalIPstIHindIIIPKK223-34586 bpamprrrnBSDlacOtacPtetroriEcoRISmaIBamHISalIPstIHindIII與細(xì)菌的分泌信號(hào)肽連在一起，可被宿主菌分泌到細(xì)胞周質(zhì)中。如：pIN III系列 2. 分泌型表達(dá)載體pIN III-comA1, pIN III-comA2, pIN III-

17、comA3,（1）組成結(jié)構(gòu)Ipplac Plac OS-D/ATGompa插入位點(diǎn)Ipp（脂蛋白基因啟動(dòng)子）和lacUV5啟動(dòng)子。調(diào)節(jié)基因：lac IS-D序列和ATG。大腸桿菌外膜蛋白基因ompa。插入位點(diǎn)區(qū)（多克隆位點(diǎn)）。 強(qiáng)啟動(dòng)子：分泌信號(hào)肽：EcoRI , HindIII, BamHIpIN III-comA17.4 kpamprIPPlacPlacOSDompaorilacIEcoRI HindIIIBamHI外源基因產(chǎn)物蛋白與載體上的菌體蛋白連接在一起。1）啟動(dòng)子：tac2）操縱基因：lacP3）調(diào)節(jié)基因：lacI4）S-D序列5）ori：pBR322 ori6）GST(谷胱甘肽S

18、轉(zhuǎn)移酶）3. 融合蛋白表達(dá)載體系統(tǒng)-pGEX系列（1）優(yōu)點(diǎn)（2）組成結(jié)構(gòu)便于分離和純化。便于溶解pGEXlacItaclacPlacOSDGSToriamprMCS（3）產(chǎn)物分離用Glutathione Sepharose親和層析柱分離純化，凝血酶或Xa因子把外源蛋白從GST上切下來(lái)。columnGST凝血酶可再利用目的蛋白洗脫再利用收集（4）幾種pGEX的多克隆位點(diǎn)1）pGEX-1TEcoRIBamHI凝血酶Leu Val Pro Arg Gly Ser Pro Glu Phe Ile Val Thr Asp *CTG GTT CCG CGT GGA TCC CCG GAA TTC ATC

19、GTG ACT GAC TGA CGAGST2）pGEX-2XSmaIEcoRIBamHI凝血酶Leu Val Pro Arg Gly Ser Pro Gly Ile His Arg Asp *CTG GTT CCG CGT GGA TCC CCG GGA ATT CAT CGT GAC TGA CTGA CGAGST3）pGEX-3X Ile Glu Gly Arg Gly Ile Pro Gly Asn Ser Ser *ATC GAA GGT CGT GGG ATC CCC GGG AAT TCA TCG TGA CTG ACTEcoRIBamHISmaIXa因子（5）其他融合蛋白系統(tǒng)1）His-tag（組氨酸標(biāo)簽）：在外源多肽的N端或C端接上6個(gè)組氨酸（His）。His-tag能與Ni2+柱結(jié)合，但很容易被EDTA（或咪唑溶液）洗脫下來(lái)，可以純化蛋白質(zhì)。如pET-his等。pET-his2.9 kb