008免疫熒光觀察細胞骨架實驗

1、免疫熒光技術觀察腫瘤細胞骨架根據抗原抗體反應的原理，先將已知的抗原或抗體標記上熒光素制成熒光標記物，再用這種熒光抗體（或抗原）作為分子探針檢查細胞或組織內的相應抗原（或抗體）。在細胞或組織中形成的抗原抗體復合物上含有熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標本，熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光（黃綠色或桔紅色），可以看見熒光所在的細胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質、定位，以及利用定量技術測定含量。 實驗原理：異硫氰酸熒光素（Fluorescein isothiocyanate, FITC） 呈黃色、橙黃或褐黃色粉末或結晶，性質穩(wěn)定，在室溫下能保存2年以上，在低溫中可保存多年。易溶于水和酒精。最大吸收光

2、譜為490495nm，最大發(fā)射光譜為520530nm，呈現(xiàn)黃綠色熒光，分子量為389.4。在堿性條件下，F(xiàn)ITC的異硫氰酸基在水溶液中與免疫球蛋白的自由氨基經碳酰胺化而形成硫碳氨基鍵，成為標記熒光免疫球蛋白，即熒光抗體。一個Ig分子上最多能標記1520個FITC分子。人宮頸癌上皮細胞 爬片（HeLa）多聚甲醛固定液配法：稱取40g多聚甲醛，置于三角燒瓶中，加入500800ml 0.1mol/L磷酸緩沖液（Phosphate Buffer以下簡稱PB），加熱至60左右，持續(xù)攪拌（或磁力攪拌）使粉末完全溶解，通常需滴加少許1n NaOH才能使溶液清亮，最后補足0.1mol/L的PB于1000ml，

3、充分混勻 透化試劑： 950ml 0.1M PBS中加入20TritonX-100母液50ml（終濃度為0.5%）20TritonX-100母液（10）：180ml PBS中加入 20ml TritonX-100 至完全溶解 20Tween-20母液（2）：10ml PBS中加入0.2ml Tween20腫瘤細胞及實驗試劑：一抗：小鼠抗人-actin多克隆抗體，用時稀釋了200倍。二抗：羊抗鼠免疫球蛋白（FITC標記），用時稀釋60倍 一抗稀釋液：1ml PBS中加入0.02g牛血清白蛋白（BSA）粉末，溶解后加入20Tween-20母液2550l（終濃度0.05%0.1）。二抗稀釋液：配法同

4、一抗?？贵w準備1去除35mm Dish 中的培養(yǎng)基，用1ml PBS中洗一次，去除PBS；2多聚甲醛固定液中室溫固定20min；3. 將爬片放入35mm Dish（鋪好濾紙）中，在其上滴加50ul含0.5% TritonX-100的PBS，室溫透化20min；4吸去透化液，加200ul PBS清洗3次，每次3min；5用鑷子小心將蓋玻片夾起，用濾紙吸干水分，放入事先鋪好濾紙，并用PBS浸濕的一新35mm Dish中間，滴加80ul 2BSA封閉液，室溫溫育20min；6用濾紙上吸至半干；7滴加30 ul一抗稀釋液至細胞表面， 37恒溫箱中溫育60min；9PBS洗三次，每次10min（搖床中進行）；10. 滴加50ul熒光標記的二抗室溫溫育60min（避光）；11PBS洗三次，每次3min（搖床中進行）；12. DAPI 50ul染色5 min ，PBS漂洗1min；13濾紙上吸干玻片上殘余的液體，在干凈載玻片上滴一滴封固劑（10ul），細胞面朝下蓋于封固劑上，在載玻片上貼好，趕走氣泡；14避光保存待觀察。實驗步驟：預備實驗結果HeLa c