鼻用人參皂苷Rg殼聚糖微球的制備

1、鼻用人參皂苷Rg3殼聚糖微球的制備 第二軍醫(yī)大學學報?2008年7月第29卷第7期? AcademicJournalofSecondMilitaryMedicalUniversity,Jul.2008,Vol.29,No.7 ?817? DOI:10.3724/SP.J.1008.2008.00817 ?論?著? 唐文燕,高?靜,丁雪鷹,高?申 * 第二軍醫(yī)大學藥學院藥劑學教研室,上海200433摘要? 目的:以殼聚糖為載體材料,人參皂苷Rg3為模型藥物,制備鼻腔給藥微球。方法:采用復乳化化學交聯(lián)技術制備人 中圖分類號?R943.43?文獻標志碼?A?文章編號?0258-879X(2008)0

2、7-0817-05 PreparationofGinsenosideRg3-loadedchitosanmicrospheresforintranasaladministration TANGWen-yan,GAOJing,DINGXue-ying,GAOShen* DepartmentofPharmaceutics,SchoolofPharmacy,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China ABSTRACT?Objective:ToprepareginsenosideRg3-loadedchitosanmicrospheresf

3、orintranasaladministration.Methods:ThechitosanmicrosphereswerepreparedbytheO/W/Ocombinedwithmultipleemulsificationchemicalcrosslinktechnique.Quadraticpolynomialequationandlinearregressionequationwerefittedbythestatisticsoftware,andtheresultingequationswereusedtoproduceresponsesurfacegraphs.Thebestex

4、perimentconditionswerescreenedbycentralcompositedesign(CCD)usingdrugload,encapsulationefficiency,andtheproportionsofmicrospheres(withdiameterof40-60?m)asvariables.Theshapeofmicrosphereswasobservedbyscanningelectronmicroscope.Results:Thebestrangesoftheprescriptionincluded:drugtocarriermaterialratio:0

5、.4-0.5;organicphaseandwaterphaseratio:0.4-0.6;andfirstemulsionandoilphaseratio:0.13-0.17.The3batchesofmicrospherespreparedaccordingtotheaboveconditionwerewell-shaped(fullsphere),withthemeandrugloadingcapacitybeing(10.25?0.08)%andtheencapsulationefficiencybeing(30.61?1.46)%.Conclusion:Theoptimizedtec

6、hniquehasagoodreproducibilityandcanbeusedforpreparationofRg3-loadedchitosanmicrospheresforintranasaladministration. KEYWORDS?ginsenoside;chitosan;microspheres;drugpreparation;drugdesign AcadJSecMilMedUniv,2008,29(7):817-821 ?人參皂苷Rg3是存在于天然藥物人參中的一種四環(huán)三萜皂苷,具有多方面的藥理作用,如抗腫 瘤1-2、神經(jīng)保護3、促進記憶4、抗血管增生5等。但是人參皂苷R

7、g3人口服后血漿濃度很低,3.2mg/kg口服后的cmax值僅為(16.0?6.0)ng/ml,tmax值僅為(0.66?0.10)h6。一般認為,口服后血藥濃度很低的原因大致有三:一是口服后經(jīng)胃腸道吸收的藥量少;二是口服后進入胃腸道內(nèi)的藥物被其中的酶或腸道細菌所代謝;三是藥物雖可被胃腸黏膜 收稿日期?2008-01-28?接受日期?2008-03-26 吸收,但被腸壁或肝臟的酶所代謝,即首過效應。?鼻腔可作為藥物吸收部位,因為鼻黏膜上有大量的細微絨毛,可大大增加上皮細胞的藥物吸收面積,上皮細胞下分布著豐富的血管網(wǎng),流經(jīng)鼻腔的靜脈血不經(jīng)過肝臟可直接進入體循環(huán)7;鼻腔中pH為6.57.1,對藥物

8、吸收影響很小;分子量較大的藥物也可通過鼻黏膜吸收。因此,鼻黏膜給藥特別適合在胃腸道不穩(wěn)定、在胃腸道內(nèi)不易被吸收或首過作用強的藥物。但鼻腔中纖毛的正常生理擺動能將 基金項目?全軍醫(yī)藥衛(wèi)生科研基金(2006172006).SupportedbyMedicalandHealthResearchFundsofPLA(2006172006).作者簡介?唐文燕,碩士.E-mail: * 通訊作者(Correspondingauthor).TelE-mail: ?818? 第二軍醫(yī)大學學報?2008年7月,第29卷 滴入的藥物很快清除,影響藥物吸收。若將藥物制成親水性凝膠微球制劑

9、,能延長藥物在鼻腔中滯留時間8-9,以提高藥物的吸收。 ?本文采用具有生物黏附性和吸收促進作用的殼聚糖(chitosan)作為載體材料,制備了鼻黏膜用人參皂苷Rg3殼聚糖微球。1?材料和方法 1.1?藥品、試劑及儀器?人參皂苷Rg3(大連富生藥業(yè)有限公司,純度93.58%,批號:070221);殼聚糖(南通生物制品有限公司,100目,脫乙酰度91.72%);液體石蠟(國藥化學試劑),化學純;甲醛(國藥化學試劑),分析純;乙腈(J&KChemical.Ltd.),色譜純;其余試劑均為分析純。剪切乳化攪拌器(上海標本模型廠);磁力攪拌器(上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司);光學顯微鏡(EUROMEX

10、,Holland);S-520型掃描電鏡(日本日立);LC-10A型高效液相色譜儀(日本島津)。 1.2?殼聚糖微球的制備?以復乳法10-11為基礎制備Rg3殼聚糖微球,取處方量殼聚糖溶于5%醋酸溶液中形成水相。將Rg3溶解于二氯甲烷中形成有機相,將有機相滴入水相中超聲制得初乳;以液體石蠟(含2%Span80)作為油相,將初乳滴入油相攪拌制成復乳;攪拌30min后,加甲醛固化,固化3h后,靜置,傾去油相,沉淀經(jīng)石油醚洗滌,無水乙醇脫水,真空干燥即得。 1.3?Rg3含量測定方法的建立及方法學考察1.3.1?色譜條件?DiamondODS色譜柱(200mm?4.6mm,5?m);流動相:乙腈?水

11、(55?45);流速1ml/min;檢測波長203nm;室溫進樣;進樣量20?l。1.3.2?標準曲線的繪制?分別配制1、2.5、5、10、25、50、100?g/ml的Rg3系列標準溶液,按1.3.1色譜條件分析,測定峰面積,以濃度對峰面積回歸得到標準曲線。 1.3.3?精密度試驗?配制低、中、高(25、50、100?g/ml)3種濃度Rg3溶液,分別按1.3.1項下色譜條件分析,測其峰面積。1d內(nèi)測定5次及每天測定1次,連續(xù)5d,計算日內(nèi)與日間精密度。 1.3.4?回收率試驗?精密稱取空白微球9份,每3份為一組,分別加入低、中、高(25、50、100?g/ml)濃度的Rg3溶液,加稀硝酸溶

12、液(1?5)4ml于70?水浴消解30min,放冷,再用甲醇定容至10ml,用0.45?m微孔濾膜過濾后用流動相稀釋到適當倍數(shù),按1.3.1項下色譜條件分析,測定峰面積,代入標準1.4?包封率和載藥量的測定?取含藥微球約50mg,精密稱定后置于10ml容量瓶中,按1.3.4項下回收率試驗方法處理,按1.3.1項下色譜條件測定Rg3濃度,根據(jù)下列公式計算每一處方微球的載藥量和包封率。載藥量=微球中藥物量/微球重量?100%;包封率=微球中藥物量/投藥量?100%。1.5?微球的粒徑及形態(tài)考察?在帶標尺的光學顯微鏡下觀察干態(tài)微球的球形及分散性,選擇具有代表性的區(qū)域,測定500個微球,計算平均粒徑。

13、將干態(tài)微球均勻散在樣品平臺上,用導電膠固定后濺金,用掃描電鏡觀察微球表面形態(tài)。 1.6?星點設計優(yōu)化微球制備工藝?在預實驗的基礎上,選擇對Rg3殼聚糖微球性質(zhì)影響較顯著的3個因素為考察對象,即投藥比(X1)、有機相與水相比(X2)、初乳與油相比(X3)。采用三因素五水平表(表1),以包封率(Y1)、載藥量(Y2)和4060?m粒徑微球所占比例(Y3)為評價指標,并作為因變量,分別對各因素、各水平用Statistic軟件進行二項式擬合。經(jīng)逐步回歸計算,求得復相關系數(shù)較高的目標函數(shù),固定3個自變量之一為中值,其他2個自變量為橫坐標,并繪制效應面(responsesurface)圖,由圖選取較佳工藝

14、條件,并按優(yōu)化的工藝條件制備3批微球。 表1?星點設計優(yōu)化微球制備工藝的因素水平表Tab1?IndependentvariablesandcorrespondentvaluesincodedandphysicalformofCCD IndependentvariableX1(W/W)X2(V/V)X3(V/V) Level -1.6820.50.5 -10.70270.7027 0110.1 11.59451.59450.1595 1.682220.2 0.06670.0802 ?X1:Drugandcarriermaterialratio;X2:Organicphaseandwaterpha

15、seratio;X3:Firstemulsionandoilphaseratio 2?結?果 2.1?Rg3含量測定HPLC法的方法學考察結果2.1.1?標準曲線?回歸方程為:C=0.0007A-2.5253(r2=0.9993),表明濃度在1100?g/ml范圍內(nèi)線性關系良好。HPLC圖譜見圖1。在此色譜條件下,Rg3的保留時間為5.3min左右。各組分峰分離效果好,空白微球不干擾Rg3微球的測定。2.1.2?精密度與回收率?結果見表2。Rg3殼聚糖微球的回收率在98%102%之間,而日內(nèi)日間精密度均小于2%,表明該含量測定方法回收率和精密度符合要求。 ?819? 2.2?Rg3微球制備工藝

16、優(yōu)化結果?見表3。?二項式回歸方程及其復相關系數(shù)如下: ?Y1=-15.20445-39.12614X1+17.69138X2+723.28081X3+11.37559X21-28.77773X22-2279.19745X3+9.56869X1X2- 61.25310X1X3-14.57971X2X3(r=0.8315)?Y2=-9.61607-9.24557X1+4.58785X2+295.57791X3+1.89888X1-3.65380X2-圖1?Rg3含量測定HPLC色譜圖 Fig1?ChromatographyofRg3contentdetermination A:Non-loade

17、dmicrosphere;B:Rg3standardsolution;C:Rg3-loadedmicrosphere 2 2 986.18820X3+6.20663X1X2-18.07232X1X3+3.34036X2X3(r=0.7724) ?Y3=53.86277+27.99942X1+9.91994X2-2 428.67169X3-7.24955X21-5.70773X2+ 2 3693.33211X23+0.23814X1X2-101.97252X1X3-316.16971X2X3(r=0.8558) ?從擬合方程的復相關系數(shù)可見,3個方程采用二項式方程擬合效果較好,3個因素對包封率、

18、載藥量及粒徑均有影響。 ?分別以Y1、Y2、Y3值為因變量,固定影響最小的自變量為中值,相對于另2個自變量的效應面三維圖見圖24。 表2?方法回收率與精密度結果Tab2?RecoveryandprecisionofHPLC Concentration -1)?B/(?g?ml 2550100 Recovery/% (n=3)98.97?0.3399.53?0.72101.12?0.39 Inter-dayRSD/%0.9180.8830.827 Intra-dayRSD/%1.071.331.29 表3?星點設計優(yōu)化微球制備工藝結果 Tab3?Experimentaldesignwithexp

19、erimentallydeterminedvaluesofdifferentdependentvariables No.123456789101112131415-20 X10.70271.59450.70271.59450.70271.59450.70271.59450.5211111 X20.70270.70271.59451.59450.70270.70271.59451.5945110.52111 X30.08020.08020.08020.08020.15950.15950.15950.1590.10.06670.20.1 Y1/%(n=3)11.93?0.2011.57?0.272

20、1.71?0.3217.98?0.9228.96?0.1912.20?0.5227.36?1.1823.40?0.5028.26?1.709.62?0.139.75?0.2412.28?0.658.78?0.819.51?0.8410.77?0.55 Y2/%(n=3)4.92?0.737.11?0.918.96?0.4611.05?0.1011.95?0.247.50?0.6811.29?0.2514.38?0.559.42?0.386.41?1.984.87?1.026.14?0.244.39?0.134.76?0.125.38?0.48 Y3/%(n=3)46.00?6.0835.67?

21、6.1100 63.67?14.4746.33?12.5800 20.33?5.7740.00?7.8130.33?13.3210.00?7.0058.33?9.4556.33?14.0140.33?12.22 ?X1:Drug/chitosan;X2:Organicphase/waterphase;X3:Firstemulsion/oilphase;Y1:Encapsulationefficiency;Y2:Drugloadingcapacity;Y3:Ratioof40-60?mmicrospheres ?820? 第二軍醫(yī)大學學報?2008年7月,第29 卷 ?根據(jù)效應面優(yōu)選的較佳處方范

22、圍為Xl:0.40.5;X3:0.130.17。其中有機相與水相比對處方影 響較小,則選取原則為剛好能溶解藥物的有機溶劑量,取X2范圍為0.40.6。即較佳處方為:投藥比(X1):0.45;有機相與水相比(X2):0.5;初乳與油相比(X3):0.15。照此條件制備的3批Rg3殼聚糖微球,其平均包封率、載藥量和4060?m微球所占比例的數(shù)據(jù)結果見表4。 圖2?包封率(Y1)對投藥比(X1)及初乳與油相比(X3)的預測效應面圖Fig2?ResponsesurfaceofencapsulationefficiencyasafunctionofX1andX3 Organicphaseandwater

23、phaseratioX2= 1 Parameter Y1Y2Y3 ? a: 表4?優(yōu)化處方制備Rg3微球實測值與預測值的比較 Tab4?Predictedandmeasuredvaluesofmicrospherespreparedaccordingtooptimalexperimentalconditions (%) Predicted30.2810.5656.78 Measured(n=3)30.61?1.4610.25?0.0852.00?3.00 Variancea-1.092.948.42 Variance(%)=(predictedvalue-measuredvalue)/pred

24、icted value?100%.Y1:Encapsulationefficiency;Y2:Drugloadingcapae-ity;Y3:Ratioofmicrophereswhichsizebetween40?mand60?m ?由表4可見,包封率、載藥量及4060?m微球 圖3?載藥量(Y2)對投藥比(X1)及初乳與油相比(X3)的預測效應面圖Fig3?Responsesurfaceofdrugloadingcapacity asafunctionofX1andX3 OrganicphaseandwaterphaseratioX2= 1 所占比例得到的實測值與預測值偏差均較小,表明優(yōu)選

25、處方的制備工藝較為穩(wěn)定。重復3次測定所得結果的平均值與預測值很接近,表明所得的擬合方程可以較好地描述指標與因素之間的關系。由光鏡可見微球球形圓整,分散性良好,粒徑大小均勻。圖5 為粒徑分布直方圖。 圖5?粒徑分布直方圖 圖4?4060?m微球所占比例(Y3)對投藥比(X1)及 初乳與油相比(X3)的預測效應面圖 Fig4?Responsesurfaceofproportionof40-60?m microspheresasafunctionofX1andX3 OrganicphaseandwaterphaseratioX2=1 Fig5?SizedistributionofRg3-loaded

26、 chitosanmicrospheres ?其中4060?m的微球占總數(shù)的52.0%,微球平均粒徑為(44.99?12.59)?m。 ?821? ?圖6為載藥微球的掃描電鏡(SEM)圖片,由圖片可見,微球表面較粗糙,球形圓整,形態(tài)良好,含藥 微球表面有很多微小孔洞,可能是復乳法制備時溶 解藥物的有機溶劑揮發(fā)排走后形成的。 支氣管,而當粒徑很大時,微球主要分布在外鼻腔非纖毛區(qū),藥物吸收差。因此,鼻黏膜給藥微球的粒徑最好在4060?m范圍內(nèi)14,本研究制備的Rg3殼聚糖微球平均粒徑為(44.99?12.59)?m,4060?m的微球占總數(shù)的52.0%,符合此要求。參考文獻 1?ParkIH,Pi

27、aoLZ,KwonSW,LeeYJ,ChoSY,ParkMK,et al.CytotoxicdammaraneglycosidesfromprocessedginsengJ.ChemPharmBull,2002,50:538-540. 2?KeumYS,HanSS,ChunKS,ParkKK,ParkJH,LeeSK,et al.InhibitoryeffectsoftheginsenosideRg3onphorbolester-inducedcyclooxygenase-2expression,NF-?BactivationandtumorpromotionJ.MutRes,2003,523

28、-524:75-85.3?KimS,NahS,RhimH.Neuroprotectiveeffectsofginsengsapo-ninsagainstL-typeCa2+channel-mediatedcelldeathinratcorticalneuronsJ.BiochemBiophysResCommun,2008,365:399-405. 4?張?晶,王世榮,陳全成,LongPH,KangJS.人參皂苷Rg3 (R),Rg3(S),Rg5/Rk1對乙醇致小鼠記憶阻礙改善作用的影響J.吉林農(nóng)業(yè)大學學報,2006,28:283-284. 5?YuePYK,WongDYL,WuPK,Leun

29、gPY,MakNK,Ye-ungHW,etal.Theangiosuppressiveeffectsof20(R)-ginsen-osideRg3J.BiochemPharmacol,2006,72:437-445.6?龐?煥,汪海林,富?力,蘇成業(yè).20(R)-人參皂苷Rg3人體藥 代動力研究J.藥學學報,2001,36:170-173. 7?CostantinoHR,IllumL,BrandtG,JohnsonPH,QuaySC.In-tranasaldelivery:physicochemicalandtherapeuticaspectsJ.IntJPharm,2007,337(1-2)

30、:1-24. 8?GaviniE,RassuG,MuzzarelliC,CossuM,GiunchediP.Spray -driedmicrospheresbasedonmethylpyrrolidinonechitosanasnewcarrierfornasaladministrationofmetoclopramideJ.EurJPharmBiopharm,2008,68:245-252. 9?WangJ,TabataY,MorimotoK.Aminatedgelatinmicrospheres asanasaldeliverysystemforpeptidedrugs:evaluationofinvitroreleaseandinvivoinsulinabsorptioninratsJ.JControlRel,2006,113:31-37. 10敦潔寧,鄧樹海,苗彩云,張?娜.大蒜素殼聚糖微球的研究 J.山東大學學報(醫(yī)學版),200