分子生物學(xué)提綱

1、第一章 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能構(gòu)型 ：指在立體異構(gòu)體中取代原子或基團(tuán)在空間的取向；建；構(gòu)型的轉(zhuǎn)變涉與共價鍵的破裂和重構(gòu)象 conformation：指構(gòu)成分子的原子和基團(tuán)由于化學(xué)鍵的旋轉(zhuǎn)而形成在三維空間上不同的排布、走向；構(gòu)象的轉(zhuǎn)變不涉與共價鍵的破裂,僅涉與氫鍵、疏水鍵等次級鍵的變化；一級結(jié)構(gòu)：指多肽鏈中氨基酸的排列次序；穩(wěn)固因素：肽鍵二級結(jié)構(gòu) ：多肽鏈的某一段肽鏈中,鄰近氨基酸殘基之間,通過氫鍵形成的有規(guī)那么重復(fù)的 - 螺旋和 - 折疊、局部有規(guī)那么的- 轉(zhuǎn)角和 環(huán)或無序結(jié)構(gòu)的一種局部構(gòu)象；二面角 構(gòu)象角 連結(jié)兩個相鄰肽平面的C產(chǎn)生的角；二面角打算了兩個相鄰肽平面的空間相對位置；二級結(jié)構(gòu)與一級結(jié)

2、構(gòu)的關(guān)系：各種氨基酸殘基在不同的二級結(jié)構(gòu)中顯現(xiàn)的頻率不同 a. 形成 - 螺旋才能強(qiáng)的氨基酸有：Glu、Met、Ala 、Leu b. 形成 - 折疊才能強(qiáng)的氨基酸有：Val 、Ile 、Tyrc. 形成 - 轉(zhuǎn)角才能強(qiáng)的氨基酸有：Pro 、 Gly 、Asn、Asp、Ser；此外,多肽鏈中假設(shè)存在連續(xù)酸性或堿性的氨基酸殘基時,因同電相斥也影響構(gòu)象的形成,所以, 多肽鏈的 R側(cè)鏈的位置、大小、極性、荷電情形等,最終打算蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的形成；超二級結(jié)構(gòu) ：相鄰的幾個二級結(jié)構(gòu)相互作用形成有規(guī)那么的組合體,是特別的序列或結(jié)構(gòu)的根本組成單元,又稱為基序或模體； EF hand;Leucine zipp

3、er 、 ；結(jié)構(gòu)域： 超二級結(jié)構(gòu)進(jìn)一步組合折疊成半獨(dú)立嚴(yán)密的球狀類型：1, 平行 / 型 2, 反平行 - 型 3, 全 - 型 4, 小的不規(guī)那么結(jié)構(gòu)三級結(jié)構(gòu) ：在二級結(jié)構(gòu), 超二級結(jié)構(gòu)與結(jié)構(gòu)域根底上,一級結(jié)構(gòu)相隔較遠(yuǎn)的氨基酸殘基以次級鍵相連, 回旋折疊成球狀,形成包括主鏈和側(cè)鏈在內(nèi)全部原子和基團(tuán)的特定空間排布；穩(wěn)定因素：側(cè)鏈 R 基團(tuán)之間相互作用形成的各種非共價鍵,包括疏水鍵、氫鍵、離子鍵和 X德華力等；四級結(jié)構(gòu) ：多亞基蛋白的各亞基的相對空間排布與亞基間的相互作用,維系力主要是疏水作用力、氫鍵和離子鍵等次級鍵；HB 變性 denaturation：物理化學(xué)因素使蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)變化 ,

4、生物學(xué)功能降低或丟失,其實(shí)質(zhì)是破壞維系蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的次級鍵,但不涉與肽鍵的斷裂；復(fù)性 ：將蛋白質(zhì)從結(jié)構(gòu)不規(guī)那么、無活性的狀態(tài),復(fù)原到有唯獨(dú)立體結(jié)構(gòu)、有生物活性的狀態(tài)的過程；同源蛋白質(zhì) homologus protein 先；執(zhí)行同一種功能的蛋白質(zhì)在進(jìn)化過程中可能來自同一祖分子病 結(jié)構(gòu)反常鐮刀狀細(xì)胞貧血; 分子削減或缺失蠶豆病構(gòu)象病 折疊錯誤導(dǎo)至功能轉(zhuǎn)變酵母雙雜交系統(tǒng) 其原理是當(dāng)靶蛋白和誘餌蛋白特異結(jié)合后,誘餌蛋白結(jié)合于報道基因的啟動子,啟動報道基因在酵母細(xì)胞內(nèi)的表達(dá) . 其次章 糖蛋白、蛋白聚糖與脂蛋白糖蛋白 ：蛋白質(zhì)與糖類構(gòu)成的共價復(fù)合物,含糖類較少,含糖量一般為 2%50%；蛋白聚糖 ：

5、蛋白質(zhì)與糖類構(gòu)成的共價復(fù)合物,含糖類較多,含糖量一般為 50%90%；血脂 ：血漿中所含脂類統(tǒng)稱血脂,包括甘油三酯 TG,磷脂 PL, 膽固醇 Ch 與游離脂酸 FFA；血漿 中 血 脂 與 蛋 白 質(zhì) 結(jié) 合 以 脂 蛋 白 lipoprotein 的 形 式 進(jìn) 展 運(yùn) 輸 ； 分 為 ：CM,VLDL,IDL,LDL,HDL；脂蛋白中的蛋白質(zhì)稱為 載脂蛋白 apolipoprotein；CM：來源于食物脂肪, 顆粒最大, 密度最低, 含 TG最多, 蛋白質(zhì)含量最少,主要為 apo B48.DOC. 主要含有外源性甘油三酯,是運(yùn)輸外源性甘油三酯與膽固醇的主要形式；正常人血漿中的乳糜微粒空腹

6、 12 小時后就被完全去除,不是動脈粥樣硬化的主要危急因素,但簡潔誘發(fā)胰腺炎. VLDL：含 TG也多,但蛋白質(zhì)含量高于CM,主要為 apo B100. 是運(yùn)輸內(nèi)源性甘油三酯的主要形式；正常人極低密度脂蛋白大局部代謝變成低密度脂蛋白；這類脂蛋白由于攜帶膽固醇數(shù)量相對較少,且它們的顆粒相對較大,不易透過血管內(nèi)膜,因此,正常的極低密度脂蛋白沒有致動脈硬化作用,像乳糜微粒一樣也不是冠心病的主要危急因素,極低密度脂蛋白代謝產(chǎn)生的中密度脂蛋白具有致動脈硬化作用；VLDL 在肝臟合成,利用來自脂庫的脂肪酸作為合成材料,其中膽固醇來自 CM殘粒與肝自身合成的局部；IDL：VLDL向 LDL轉(zhuǎn)化過程中的中間產(chǎn)

7、物,與 VLDL相比, Ch含量已明顯增加 ,apoB100,apoC . 含膽固醇與其酯最多,幾乎只含 apo B100. LDL: 是富含膽固醇的脂蛋白,其膽固醇主要來自從CE轉(zhuǎn)運(yùn)的高密度脂蛋白中的膽固醇；目前認(rèn)為血漿中 LDL 的來源有兩條途徑：主要途徑是由 VLDL異化代謝轉(zhuǎn)變而來；次要途徑是肝合成后直接分泌到血液中；LDL 的降解是經(jīng) LDL 受體途徑進(jìn)展代謝,當(dāng)?shù)兔芏戎鞍走^量時, 它攜帶的膽固醇便積存在動脈壁上,久了簡潔引起動脈硬化；因此低密度脂蛋白被稱為“ 壞的膽固醇；Lpa : 脂質(zhì)成分類似于LDL, 但多含一分子apoa, 直接由肝臟產(chǎn)生, 不能轉(zhuǎn)化為其他種類的脂蛋白 .

8、HDL：顆粒最小 , 蛋白質(zhì)含量最多,apo 主要為 apoAI 與 apoAII. 由于可輸出膽固醇促進(jìn)膽固醇的代謝,所以為動脈硬化預(yù)防因子；HDL主要由肝和小腸合成；肝合成的新生HDL以磷脂和 ApoA為主；HDL可將蓄積于末梢組織的游離膽固醇與血液循環(huán)中脂蛋白或與某些大分子結(jié)合而運(yùn)輸?shù)礁鹘M織細(xì)胞,主要是肝臟；實(shí)際上是膽固醇逆轉(zhuǎn)RCT,RCT促進(jìn)組織細(xì)胞內(nèi)膽固醇的去除, 維護(hù)細(xì)胞內(nèi)膽固醇量的相對衡定,從而限制動脈粥樣硬化的發(fā)生開展,起到抗動脈粥樣硬化作用；脂蛋白結(jié)構(gòu) : 甘油三酯與膽固醇酯構(gòu)成內(nèi)核; 載脂蛋白、磷脂與膽固醇等兼性分子以單分子層借助其非極性的疏水基團(tuán)與內(nèi)核相連,而極性的親水基

9、團(tuán)位于外表 . 脂蛋白的臨床意義 :CM可能與 AS有關(guān)； VLDL水平上升是 CHD的危急因子 IDL 始終被認(rèn)為具有致 AS作用； LDL 是首要的致 AS因子；經(jīng)過氧化或其他化學(xué)修飾后的 LDL, 具有更強(qiáng)的致AS作用； HDL被認(rèn)為是一種抗動脈粥樣硬化的血漿脂蛋白, 是冠心病的愛護(hù)因子；脂蛋白受體 ：一類位于細(xì)胞膜上的糖蛋白,它們能以高親和性的方式與其相應(yīng)的脂蛋白配體相互作用, 介導(dǎo)細(xì)胞對脂蛋白的攝取和代謝,從而進(jìn)一步調(diào)劑血漿脂蛋白和血脂的水平；功能 a. 參與脂蛋白代謝 b. 參與視黃酸和類固醇的內(nèi)吞性攝取 , 如 Megalin c. 參與體內(nèi)細(xì)胞信號的傳遞,如 LRP、VLDL-

10、R 與 apoE-R2；LDL 受體家族、清道夫受體家族、脂解激活受體；LDL在內(nèi)小體的酸性環(huán)境中與LDL 受體別離 1. 含受體局部的小泡成再循環(huán)小泡,又回到細(xì)胞外表 LDL 受體的再循環(huán)途徑 2. LDL 被運(yùn)輸?shù)饺苊阁w,并被溶酶體內(nèi)的酶類分解,載脂蛋白主要為 apoB100降解成氨基酸,膽固醇酯那么被酸性酯酶水解為游離膽固醇；LDL受體的功能： 1 結(jié)合 LDL或其它含 apoB100 或 apoE 的脂蛋白,內(nèi)吞入細(xì)胞以獲得脂類,主要為膽固醇 2 50% LDL在肝臟經(jīng) LDL受體途徑降解 3. 影響 LDL的生成速率以與 VLDL代謝,并能在 CM代謝中發(fā)揮作用 LDL R VLDL

11、R 3 LDL receptor related protein LRP4.apoE R-2 血漿中的 LDL 仍可被修飾,修飾的 LDL 如氧化修飾 LDL ox-LDL 可被去除細(xì)胞；即單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)中的巨噬細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞去除；這兩類細(xì)胞膜外表具有清道夫受體scavenger receptor, SR,攝取去除血漿中的修飾LDL；ox-LDL 引起動脈粥樣硬化的機(jī)理：沉積在動脈粥樣斑塊上的脂質(zhì)是來源于血漿中低密度脂蛋白 LDL ；膽固醇與其酯在血管壁內(nèi)的集合很可能與兩條途徑有關(guān): 一是依靠內(nèi)皮細(xì)胞 和DOC. 血管壁內(nèi)的其他細(xì)胞 膜上的特異性受體進(jìn)展的主動攝取; 二是經(jīng)過非受體途徑被

12、動性進(jìn)入, 如在嚴(yán)峻內(nèi)皮損耗時；血管壁內(nèi)和動脈粥樣硬化損耗處的全部主要細(xì)胞都能氧化LDL, 產(chǎn)生氧化型 LDLOx-LDL ；但是 , 在動脈樣硬化的早期階段, 內(nèi)皮細(xì)胞對 LDL 的輕度氧化可能是至關(guān)重要的；輕度氧化的LDL 或微小修飾的LDLmmLDL在引起單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞集合方面具有啟動因子的作用；巨噬細(xì)胞吞噬了大量的Ox-LDL 后就衍變成泡沫細(xì)胞,巨噬細(xì)胞或泡沫細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)飽和后, 無論破裂與否 , 都可釋放大量的活性物質(zhì), 加速病變的進(jìn)展； 泡沫細(xì)胞逐步增多并融合,形成脂質(zhì)條紋,繼而開展為成熟的粥樣斑塊；Lpa 的組成 1. 脂質(zhì)成分與 apoa 以二硫鍵相連LDL 相像 含量

13、:TG 高于 LDL,Ch 低于 LDL2.蛋白質(zhì) apoB100 和Lpa 致 As 的機(jī)制 Lpa 與纖溶酶原結(jié)構(gòu)同源1. Lpa 與纖溶酶原競爭底物的結(jié)合部位 Lpa 中的 apoa 與纖溶酶原競爭同一底物纖維蛋白或纖維蛋白原,但由于apoa 不具備酶的活性,導(dǎo)致其不能溶解或分解與其結(jié)合的纖維蛋白,相反它仍促進(jìn)或有利于纖維蛋白冷靜于血管壁,參與血栓形成,繼而啟動 As 的發(fā)生和開展；2. Lpa 競爭性抑制纖溶酶原與細(xì)胞纖溶酶原受體的結(jié)合纖溶酶原受體的主要作用是加速纖溶酶原的活化,促進(jìn)血栓的溶解,愛護(hù)纖溶酶不被抑制；但由于Lpa 的分子結(jié)構(gòu)與纖溶酶原極為相像, 因此它能與纖溶酶原競爭纖溶

14、酶原受體,從而抑制血栓的溶解,促進(jìn)血栓的形成；非編碼 RNANon-Coding RNA ,指的是不被翻譯成蛋白質(zhì)的RNA,如 tRNA, rRNA 等,這些RNA不被翻譯成蛋白質(zhì),但是其中有一些會參與蛋白質(zhì)翻譯過程；miRNA是在真核生物中發(fā)覺的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼 RNA,其大小長約 2025個核苷酸；成熟的 miRNAs是由較長的初級轉(zhuǎn)錄物經(jīng)過一系列核酸酶的剪切加工而產(chǎn)生的,隨后組裝進(jìn) RNA誘導(dǎo)的緘默復(fù)合體,通過堿基互補(bǔ)配對的方式識別靶 mRNA,并依據(jù)互補(bǔ)程度的不同指導(dǎo)緘默復(fù)合體降解靶 mRNA或者阻遏靶 mRNA的翻譯；第九章 染色質(zhì)與基因表達(dá)調(diào)控表觀遺傳學(xué) ：是討論表

15、觀遺傳變異的遺傳學(xué)分支學(xué)科；表觀遺傳變異是指,在基因的 DNA序列沒有發(fā)生轉(zhuǎn)變的情形下,基因功能發(fā)生了可遺傳的變化,并最終導(dǎo)致了表型的變化；它是不符合孟德爾遺傳規(guī)律的遺傳；表觀遺傳學(xué)的意義：DNA或相關(guān)蛋白的修飾, ,而不是 DNA序列的變化來打算表型；常染色質(zhì)堿性染料著色淺而均一,DNA 復(fù)制較早,對核酸酶敏銳,富含基因、轉(zhuǎn)錄調(diào)劑蛋白和乙酰組蛋白,核小體陣列不規(guī)那么,壓縮程度低；異染色質(zhì)堿性染料著色深而不均,DNA 復(fù)制晚而慢,對核酸酶不敏銳,所含基因、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白甚少,富含高度重復(fù)序列,核小體陣列規(guī)那么,高度壓縮；重建復(fù)合物 ：為多蛋白巨型分子,別離純化時輔基或結(jié)合的蛋白質(zhì)共沉淀；具解旋酶

16、基序或結(jié)構(gòu)域, 能直接在 DNA模板區(qū)引入負(fù)超螺旋,對染色質(zhì)結(jié)構(gòu)極具影響；有 ATP依靠性 ATPase活性, 靠 ATP供能而調(diào)劑核小體結(jié)構(gòu)；有些亞基具有組蛋白修飾酶活性,體外促核小體重定位或解體；無論基因復(fù)制、修復(fù)和轉(zhuǎn)錄調(diào)劑,均需染色質(zhì)重建復(fù)合物不斷沿著核小體 DNA滑動,實(shí)施其對核小體減壓縮 / 壓縮和靶基因 DNA元件開 / 關(guān)的調(diào)控, 以應(yīng)答內(nèi)外環(huán)境各種信號與其需求；核小體 ：是真核染色質(zhì)的根本結(jié)構(gòu)單位,包含核心顆粒、接頭 白；DNA和組蛋白 H1 以與非組蛋組蛋白密碼 ：核小體核心組蛋白 N-端尾區(qū),具細(xì)胞信息潛在的儲存功能,是供應(yīng)表型遺傳信息的豐富來源, 此信息可傳遞至子代；尾區(qū)

17、位點(diǎn)修飾與其組合,構(gòu)成一套限定染色質(zhì)局部轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的密碼；DOC. 染色質(zhì)化學(xué)修飾與基因表達(dá)核染色質(zhì)化學(xué)修飾是指其組成DNA、RNA、組蛋白和非組蛋白分子參與 / 去除某個化學(xué)基團(tuán)的反響；1. 染色質(zhì) DNA甲基化 / 去甲基化,甲基化促使基因緘默,對胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖和分化、基因表達(dá)等調(diào)劑, 表型遺傳和腫瘤發(fā)生都具有非常重要的意義；惡性腫瘤伴DNA甲基化總水平降低、多種癌基因伴低甲基化與其轉(zhuǎn)錄激活,或多種抑癌基因伴高甲基化與其轉(zhuǎn)錄抑制；2. 染色質(zhì)組蛋白甲基化/ 去甲基化主要發(fā)生在H3H4賴氨酸殘基上,甲基化促進(jìn)異染色質(zhì)的形成；3. 染色質(zhì)組蛋白乙?；虮磉_(dá)/ 去乙?；蜿P(guān)閉 HAT/HD

18、AC 4. 染色質(zhì)磷酸化 / 去磷酸化 主要發(fā)生在絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸羥基上,與負(fù)電荷磷酸基團(tuán)結(jié)合,誘導(dǎo)分子構(gòu)象轉(zhuǎn)變,增加分子間排斥力或吸引力,產(chǎn)生特有的生物學(xué)效應(yīng)；5. 染色質(zhì)泛素化 / 去泛素化 影響蛋白質(zhì) / 蛋白質(zhì)相互作用、DNA定位、轉(zhuǎn)錄激活 / 阻遏、降解/ 穩(wěn)固等；很多重要靶基因上游的調(diào)劑蛋白具泛素連接酶活性,特別很多真核 RNA聚合酶相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的活性受 E3 泛素化和 / 或蛋白體降解的調(diào)控；順式作用元件 ：凡能激活 / 阻遏基因轉(zhuǎn)錄的 DNA序列；啟動子 ：位于基因編碼區(qū)上游并為 RNA聚合酶識別、結(jié)合和啟動轉(zhuǎn)錄的 DNA序列；增強(qiáng)子 ：能加強(qiáng)其上游或下游基因轉(zhuǎn)錄的 DN

19、A序列；終止子 ：基因編碼區(qū)下游能促使 RNAP識別并終止 RNA合成的 DNA序列；緘默子 ：能抑制上游或下游基因轉(zhuǎn)錄的 DNA序列；隔離子 ：在真核基因組內(nèi)建立獨(dú)立轉(zhuǎn)錄活性結(jié)構(gòu)域的調(diào)劑元件；反式作用因子 ：凡直接或間接與順式作用元件相互作用并影響基因表達(dá)的調(diào)劑蛋白；轉(zhuǎn)錄因子 ：與核心啟動子特異結(jié)合并啟動轉(zhuǎn)錄的調(diào)劑蛋白；第六章 細(xì)胞信號傳遞細(xì)胞信號傳遞 ：信息物質(zhì) 分子通過一系列中間環(huán)節(jié)把信號傳遞到靶細(xì)胞內(nèi),使靶細(xì)胞產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)細(xì)胞信號傳遞的根本過程：特定細(xì)胞合成并分泌信號分子信號分子通過擴(kuò)散或血循環(huán)到達(dá)靶細(xì)胞 靶細(xì)胞的受體識別并結(jié)合信號 胞內(nèi)生物學(xué)效應(yīng) 通過一系列的化學(xué)反響將信號傳遞到靶

20、細(xì)細(xì)胞間的信號分子,又稱第一信使,細(xì)胞分泌的具有調(diào)劑靶細(xì)胞生命活動的化學(xué)物質(zhì)；分類： 1. 激素：內(nèi)分泌信號 endocrine signal 特點(diǎn)由內(nèi)分泌細(xì)胞分泌；通過血循環(huán)到達(dá)靶細(xì)胞 作用時間較長 2. 局部化學(xué)介質(zhì)：旁分泌信號 paracrine signal 特點(diǎn)：由特定細(xì)胞分泌通過擴(kuò)散作用于鄰近的靶細(xì)胞作用時間較短 3. 神經(jīng)遞質(zhì)： 突觸分泌信號 synaptic signal特點(diǎn)：由神經(jīng)元突觸前細(xì)胞分泌通過突觸間隙到達(dá)突觸后細(xì)胞作用時間較短 4. 氣體信號特點(diǎn) 直接穿越細(xì)胞膜進(jìn)入靶細(xì)胞 直接轉(zhuǎn)變效應(yīng)酶的活性 舉例： NO, CO 細(xì)胞內(nèi)的信號分子：第一信使與受體結(jié)合后在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的

21、傳遞信號的化學(xué)物質(zhì)；受體 Receptor : 是細(xì)胞膜上或細(xì)胞內(nèi)能特異識別生物活性分子并與之結(jié)合,進(jìn)而引起生物學(xué)效應(yīng)的特別蛋白質(zhì)；配體 Ligand : 能與受體特異結(jié)合的生物活性分子,如：細(xì)胞間信號分子、藥物、維生素、毒物；一. 膜受體 1. 配體門控離子通道 配體：神經(jīng)遞質(zhì) 舉例：乙酰膽堿受體 2.G 蛋白偶聯(lián)受體 GPCR 此類受體承擔(dān)的信息 需 G蛋白的轉(zhuǎn)換才能傳遞到靶細(xì)胞內(nèi),即與 G蛋白偶聯(lián)；單鏈糖蛋白 , 七個跨膜 螺旋 N 端在細(xì)胞膜外側(cè),C端在細(xì)胞內(nèi)側(cè),三個細(xì)胞外環(huán),三個細(xì)胞內(nèi)環(huán)； N 端常被糖基化 C 端常被棕櫚酰化 配體結(jié)合域胞內(nèi)域與 G蛋白偶聯(lián)DOC. 3. 單個跨膜螺

22、旋受體受體酪氨酸蛋白激酶RTKs/TPKs 非酪氨酸蛋白激酶受體 Non-TPK receptors 不具有 TPK活性,與酪氨酸蛋白激酶偶聯(lián)功能: 細(xì)胞分化、增殖和癌變二、胞內(nèi)受體胞內(nèi)受體通常為反式作用因子trans-acting factors L- R 順式作用原件調(diào)劑基因轉(zhuǎn)錄配體：類固醇激素,甲狀腺素受 體 作 用 特 點(diǎn) ： 高 特 異 性 High specificity 高 親 和 力 High affinity 可 飽 和 性Saturability 可逆性 Reversibility 可調(diào)劑性G蛋白 是鳥苷酸結(jié)合蛋白 guanine nucleotide binding pr

23、otein 的簡稱；與 GDP/GTP可逆結(jié)合 位于細(xì)胞膜胞漿面的外周蛋白 屬于 GTPase超家族 雜三聚體 : 活性亞基,結(jié)合GDP/GTP,結(jié)合受體 GTPase 活性GTPGDP + Pi : 7個 -sheet : 2個 -helix 脫落構(gòu)象 Inactive: -GDP ； Active: -GTP, 信號傳遞途徑 cAMP-PKA途徑 第一信使 R: GPCRs AC腺苷酸環(huán)化酶其次信使：cAMP PKA蛋白 激酶 A, 又稱為 cAMP依靠性蛋白激酶,變構(gòu)酶- 四聚體 R2C2 R2C2: inactive R 自身抑制的結(jié)構(gòu)域占據(jù)了 C上底物結(jié)合部位4 cAMP + R2C

24、2inactive R 2.4 cAMP + 2C active生物學(xué)效應(yīng)磷酸化下游靶蛋白調(diào)劑代謝的關(guān)鍵酶/ 調(diào)劑轉(zhuǎn)錄的蛋白因子的Ser/Thr 殘基,轉(zhuǎn)變靶蛋白的活性,從而調(diào)劑細(xì)胞的物質(zhì)代謝和基因表達(dá)；磷蛋白磷酸酶 Protein Phosphatase, PP 使被磷酸化的蛋白質(zhì)脫去無機(jī)磷酸鹽,回復(fù)根本狀態(tài)；可被 cAMP抑制；PKA調(diào)劑基因表達(dá)順式作用元件 : cAMP 應(yīng)答元件 cAMP response element, CRE TGACGTCA 反 式 作 用 因 子 : cAMP 應(yīng) 答 元 件 結(jié) 合 蛋 白 cAMP response element binding prot

25、ein,CREBCREB 結(jié)合蛋白 CREB-binding protein,CBP PKA 的C 亞 基 進(jìn) 入 細(xì) 胞 核 磷 酸 化CREB 的Ser/Thr殘 基 p-CREB-CRE CBP-p-CREB-CRE 調(diào)劑基因的轉(zhuǎn)錄Ca 2+-PKC 途徑 第一信使 G 蛋白偶聯(lián)受體PLC 磷脂酶 CPIP 2 IP 3+DAG其次信使： IP3、DAG、Ca 2+ PKC 鈣依靠性蛋白激酶 Ca 2+ -dependent protien kinase, PKC或蛋白激酶 C,調(diào)劑代謝：磷酸化靶蛋白的 Ser/Thr 殘基靶蛋白：膜受體,膜蛋白和多種酶舉例 PKC磷酸化質(zhì)膜的 Ca 2

26、+通道 Ca 2+內(nèi)流胞漿內(nèi) Ca 2+ ； PKC磷酸化肌漿網(wǎng)的Ca 2+-ATP 酶 Ca 2+進(jìn)入肌漿網(wǎng)胞漿內(nèi) Ca 2+ 調(diào)劑基因表達(dá)： 早期反響： 磷酸化立早基因的反式作用因子促進(jìn)立早基因的表達(dá)早期反響；立早基因 : 細(xì)胞原癌基因 c-fos, AP1/c-jun第三信使 : c-fos蛋白 , AP1/c-jun蛋白晚期反響：第三信使磷酸化晚期反響基因活化晚期反響生物學(xué)效應(yīng)： IP3: 從膜上擴(kuò)散到胞漿中與ER 的受體結(jié)合鈣通道打開胞漿內(nèi)Ca 2+ ； DAG: PS, Ca 2+的幫助下,激活 PKC cGMP-PKG途徑 第一信使 : 心房肽、鳥苷素、NO GC 鳥苷酸環(huán)化酶其

27、次信使：cGMP PKG生物學(xué)效應(yīng)Ca 2+-CaM途徑 第一信使受體其次信使：Ca 2+ CaM生物學(xué)效應(yīng)四個 Ca結(jié)合區(qū),與 Ca結(jié)合后,即引起構(gòu)象轉(zhuǎn)變從而引起其與受體蛋白的作用而表現(xiàn) CaM的生物活性；肌球蛋白輕鏈激酶DOC. 核因子 B nuclear factor- B NF- B 由 Rel 家族成員的同源 / 雜二聚體組成NF- B 的活化機(jī)制 在胞質(zhì)中與其抑制蛋白 I B 結(jié)合,并與 PKA的催化亞基結(jié)合,呈不具活性狀態(tài)； 很多刺激因子如細(xì)胞因子,氧自由基等均可使其活化；在這些因子作用下,I B激酶 IKK激活,使抑制蛋白磷酸化,后經(jīng)泛素化被降解；同時PKAc使 NF- B 亞

28、基磷酸化,解離,使 NF- B 活化,轉(zhuǎn)移入胞核,并與 DNA的 B 反響元件結(jié)合,從而調(diào)劑特異基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)；受 NF- B 調(diào)控的靶基因：TNF, IL, CSF, 免疫受體,粘附因子,趨化因子,急性期蛋白,病毒,轉(zhuǎn)錄調(diào)劑子,抗凋亡因子等功能：炎癥反響、應(yīng)激反響、細(xì)胞增殖、細(xì)胞轉(zhuǎn)化和細(xì)胞凋亡第十章基因克隆DNA片段連接在載體如細(xì)菌質(zhì)粒或病毒DNA分子上去, 即在基因克隆 ：將任何生物包括人的體外重組,隨后引入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞進(jìn)展無性繁衍的過程；常用工具酶：限制性內(nèi)切酶RE是一類特異性水解雙鏈 DNA的磷酸二酯酶；DNA聚合酶：催化體外 DNA合成；RNA聚合酶：轉(zhuǎn)錄酶,體外 DNA轉(zhuǎn)錄成 R

29、NA所必需；反轉(zhuǎn)錄酶：催化 RNA模板反轉(zhuǎn)錄生成 DNA產(chǎn)物；DNA連接酶：將兩段 DNA分子拼接的酶叫 DNA連接酶；載體條件： 1 必需有自身的復(fù)制子,能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主地進(jìn)展復(fù)制,并能使靶 DNA片段同步擴(kuò)增； 2 載體分子上必需有限制性內(nèi)切酶點(diǎn),以供外源 DNA插入, 具有多種酶的單一位點(diǎn), 給予載體在使用上有更大的敏捷性；3 應(yīng)具有可供挑選的遺傳標(biāo)志,以便于陽性重組體的挑選； 4 載體分子本身應(yīng)盡量小,可容納較大的外源 DNA片段, 并具有拷貝數(shù)高、易與宿主 DNA別離與抗剪切力強(qiáng)等特點(diǎn)；子、前導(dǎo)次序、增強(qiáng)子等調(diào)控元件；5 對于表達(dá)型載體仍應(yīng)具備與宿主細(xì)胞相適應(yīng)的啟動基因克隆 是

30、用別離純化或人工合成的基因DNA片段,在體外與載體DNA連接,將重組DNA分子,導(dǎo)入宿主細(xì)胞,經(jīng)過擴(kuò)增、挑選、鑒定等程序,獲得含重組 一、別離或合成外源基因DNA的活細(xì)胞；從基因組文庫中挑選；從 cDNA文庫中挑選；人工合成目的基因；PCR擴(kuò)增目的基因二、目的基因與載體重組 特定靶基因插入載體 DNA,經(jīng) DNA連接酶催化形成嵌合 DNA；三、基因?qū)敕?體外連接的重組 DNA分子導(dǎo)入相宜的受體細(xì)胞才能大量復(fù)制、增殖和表達(dá)；轉(zhuǎn)化：質(zhì)粒 DNA與其重組體導(dǎo)入細(xì)菌；轉(zhuǎn)染：病毒與其重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞；轉(zhuǎn)導(dǎo)：噬菌體與其重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞；氯化鈣法；電穿孔法；轉(zhuǎn)染試劑法；顯微注射法四、重組體的挑選與鑒定

31、從轉(zhuǎn)化菌落中,挑選含有陽性重組體的菌落并鑒定重組體的正確性,通過細(xì)胞培育,重組體的擴(kuò)增, 獲得足量靶基因片段,供進(jìn)一步討論該基因與其表達(dá)產(chǎn)物的機(jī)構(gòu)、功能；第十一章基因突變?nèi)笔Щ蜣D(zhuǎn)變而引起的基因結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變,進(jìn)而基因突變 ：基因組 DNA分子中發(fā)生堿基的增加、引起遺傳表型的轉(zhuǎn)變；突變分類：1. 堿基轉(zhuǎn)變：點(diǎn)突變 DNA 被化學(xué)修飾或復(fù)制時發(fā)生錯配,使一個堿基變成另一個堿基；堿基插入突變 DNA鏈中插入 1 個或多個堿基轉(zhuǎn)座子 Tn,突變后可引起 DNA序列閱讀框架轉(zhuǎn)變DOC. 堿基缺失突變 DNA 鏈中 1 個或多個堿基發(fā)生丟失,突變后可引起 DNA序列閱讀框架轉(zhuǎn)變2. 密碼效應(yīng)：同義突變：堿基被

32、替代后沒有密碼子轉(zhuǎn)變,其產(chǎn)物AA序列也無變化；錯義突變：堿基序列的轉(zhuǎn)變引起 AA序列轉(zhuǎn)變；無義突變：某個堿基轉(zhuǎn)變使某個AA的密碼子成為蛋白質(zhì)合成的終止密碼子；3表型特點(diǎn) : 外形突變 : 突變主要影響生物體的外在可見的外形結(jié)構(gòu),故又稱可見突變；如外形、大小、色澤等的轉(zhuǎn)變；生化突變 : 突變影響生物的代謝過程；導(dǎo)致一個特定的生化功能的轉(zhuǎn)變或丟失；致死突變 : 影響生物體的生活力,導(dǎo)致個體死亡的一類突變；4發(fā)生突變的細(xì)胞分類：體細(xì)胞突變: 在保持分裂的身體組織的一個細(xì)胞發(fā)生突變,這個細(xì)胞便成為一群一樣突變細(xì)胞的祖先；在發(fā)育過程中, 體細(xì)胞突變大事發(fā)生的愈早,對表型的影響就愈大；體細(xì)胞突變一般不能遺

33、傳給后代；生殖細(xì)胞突變：生殖細(xì)胞突變發(fā)生在種系germ line中；假如突變的性細(xì)胞參與受精過程,那么突變基因就會傳給下一代；基因突變特點(diǎn) ： 一 突變的平行性、重演性和可逆性平行性 是指親緣關(guān)系相近的物種因遺傳根底較近似而發(fā)生相像基因突變的現(xiàn)象；重演性 一樣的基因突變可以在同種生物的不同個體間重復(fù)發(fā)生,稱為重演性；可逆性 基因突變的發(fā)生方向是可逆的；正突變 forward mutation：顯性基因 A 隱性基因 a ；反突變 reverse mutation：隱性基因 a 顯性基因 A ； 二 突變的多方向性與復(fù)等位基因突變的多方向性：指基因突變可以多方向發(fā)生,即基因內(nèi)部多個突變部位分別轉(zhuǎn)

34、變后會產(chǎn)生多種等位基因形式；復(fù)等位基因 multiple allele：位于同一基因位點(diǎn)上的多種等位基因；在二倍體與異源多倍體中, 同一位點(diǎn)只能有一對基因,最多存在兩種等位基因形式；因此復(fù)等位基因的各種形式會存在于生物群體的不同個體中 三 隨機(jī)性生物個體發(fā)育的任何時期體細(xì)胞突變不遺傳給后代生殖細(xì)胞突變遺傳給后代 四 廣泛性和有害性多數(shù)定點(diǎn)突變技術(shù)： 在體外條件下定向誘發(fā)突變,分析這些突變的表型；各種核酸酶和突變劑制造突變技術(shù)制造點(diǎn)特異突變,然后導(dǎo)入生物體內(nèi),觀看并寡核苷酸介導(dǎo)的定點(diǎn)突變：利用化學(xué)合成的含義突變堿基的寡核苷酸片段作引物,啟動單鏈 DNA分子進(jìn)展復(fù)制, 隨后這段寡核苷酸引物便成為新

35、合成 DNA子鏈的一個組成局部,新生成的鏈便已具有突變的堿基序列；為了使靶基因的特點(diǎn)位點(diǎn)發(fā)生突變,所設(shè)計的寡核苷酸引物的序列除了所需的突變堿基外,其余的序列那么與靶基因編碼鏈的特定區(qū)段完全互補(bǔ)；Kunkel 定點(diǎn)誘變法 ：通過篩除含尿嘧啶DNA模板鏈； 在 dut-,ung-雙缺陷的大腸桿菌中培育重組 M13噬菌體,制備的單鏈模板DNA含有很多 U堿基, DNA聚合酶, dNTP,DNA連接酶,合成的新鏈那么不含U而含 T,轉(zhuǎn)染野生型大腸桿菌ung + 結(jié)果含 U的模板在尿嘧啶脫糖苷酶的作用下發(fā)生鏈的斷裂而被破壞；硫代磷核苷酸誘變法：限制性核酸內(nèi)切酶 Ava, Ava, Ban, Hind,

36、Nci, Pst,Pvu等不能切割有硫代磷核苷酸衍生物取代正常核苷酸形成的 DNA；用硫代磷核苷酸 , 在DOC. DNA聚合酶催化和DNA連接酶作用下,形成異源dsDNA分子,再用Nci消化該異源dsDNA分子,可獲的高效率的定點(diǎn)突變分子；PCR定點(diǎn)突變重疊延長 PCR誘變：用 PCR法各擴(kuò)增兩條帶有預(yù)設(shè)突變堿基的DNA片段, 擴(kuò)增的 DNA片段在預(yù)設(shè)突變處有重疊區(qū)域,混合重疊片段,并與兩個原始片段互補(bǔ)的側(cè)翼引物進(jìn)展第三次 PCR擴(kuò)增,以獲得全長 DNA；需兩個突變誘導(dǎo)引物,兩個側(cè)翼引物,3 次 PCR；誘變率極高大引物 PCR定點(diǎn)誘變：兩輪 PCR,2 個側(cè)翼引物,其中一個為預(yù)設(shè)突變引物,

37、第一輪 PCR后,大引物不需純化,第一輪退火溫度較低,其次輪較高效率可達(dá) 80第十三章 腫瘤相關(guān)基因72特點(diǎn)：簡潔,經(jīng)濟(jì),平均誘變癌基因 oncogene,onc. ：是指細(xì)胞或病毒中存在的,能誘導(dǎo)正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化的基因,并參與 細(xì)胞的生長與代謝；這些基因在正常情形下不表達(dá)或僅限量表達(dá),當(dāng)其被激活時那么可引起 癌變,通常將病毒中的這類癌基因稱為病毒癌基因 v-onc,細(xì)胞中存在的癌基因稱為細(xì)胞 由 于 c-onc 在 正 常 細(xì) 胞 中 以 非 激 活 狀 態(tài) 存 在 , 故 又 稱 為 原 癌 基 因 癌 基 因 c-onc, proto-onc. 原癌基因 ：未激活的細(xì)胞癌基因在人體正常細(xì)胞中

38、存在是一種正常基因作用,可調(diào)控細(xì)胞生 長和分化,廣泛存在于生物界中,從酵母到人的細(xì)胞中都存在；病毒癌基因v-onc 存在于病毒基因組的癌基因稱為病毒癌基因；它不編碼病毒的結(jié)構(gòu) 成分,對病毒的復(fù)制也沒有作用,但其反常表達(dá)可以使宿主細(xì)胞連續(xù)增殖 , 產(chǎn)生腫瘤或使培 養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化成癌細(xì)胞的動物病毒基因；細(xì)胞癌基因 c-onc 存在于正常細(xì)胞基因組的癌基因稱為細(xì)胞癌基因c-onc ；在正常細(xì) 只有在肯定的條件下發(fā) 胞內(nèi)可以表達(dá), 其表達(dá)產(chǎn)物具有調(diào)劑細(xì)胞生長、增殖和分化的功能；生轉(zhuǎn)變而有過度表達(dá)時,才可能與腫瘤的發(fā)生有關(guān)pro-onc , 正常狀態(tài)下為非活化形式即原癌基因病毒癌基因和細(xì)胞癌基因的區(qū)分1.

39、轉(zhuǎn)錄調(diào)控：病毒癌基因轉(zhuǎn)錄效率高；細(xì)胞癌基因轉(zhuǎn)錄效率低； 2. 基因結(jié)構(gòu)：病毒癌基因無內(nèi)含子；細(xì)胞癌基因有內(nèi)含子；3. 表達(dá)產(chǎn)物：病毒癌基因表達(dá)蛋白常缺失C 端,轉(zhuǎn)化功能加強(qiáng)；4. 功能 : 病毒癌基因?qū)Σ《颈旧頍o關(guān)緊要,卻可使宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化,引起腫瘤,而細(xì)胞癌基因?qū)?xì)胞的生長、分化和功能活動卻是至關(guān)緊要的癌基因的激活機(jī)理1. 點(diǎn)突變 ：原癌基因在射線或化學(xué)致癌劑作用下,可能發(fā)生單個堿基的替換導(dǎo)致點(diǎn)突變,從而轉(zhuǎn)變了表達(dá)蛋白的氨基酸組成,造成蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)反常；點(diǎn)突變常見于 ras 癌基因ras 基因的表達(dá)產(chǎn)物 RAS是一種小分子 G蛋白,在信號傳導(dǎo)中起重要作用, ras 基因的點(diǎn)突變主要發(fā)生在第 1

40、2、13 和 61 位密碼子, 正常 RAS的作用因其自身的 GTP酶活性而受到嚴(yán)格掌握,而突變了的 RAS其 GTP酶活性下降或丟失, 失去了原有掌握, 致使增殖信號連續(xù)作用,細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化； ras 基因的點(diǎn)突變可導(dǎo)致多種腫瘤： H-ras 點(diǎn)突變導(dǎo)致膀胱癌、甲狀腺癌、宮頸癌、肺癌 K- ras 點(diǎn)突變導(dǎo)致結(jié)腸癌、肺腺癌、胰腺癌、膽管癌 N- ras 點(diǎn)突變導(dǎo)致神經(jīng)母細(xì)胞瘤、黑色素瘤、急性淋巴母細(xì)胞白血病等2. 啟動子插入 ：插入具有高活性的啟動子或增強(qiáng)子,使原癌基因長久、過量地表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄病毒的 LTR 含較強(qiáng)的啟動子和增強(qiáng)子；雞淋巴細(xì)胞瘤由于白細(xì)胞增生病毒ALV的 LTR插入 c-my

41、c 的旁側(cè)5 或 3 端,使 c-myc 的表達(dá)比正常高 30-100倍3. 基因擴(kuò)增基因拷貝數(shù)的增加稱為基因擴(kuò)增；原癌基因擴(kuò)增使轉(zhuǎn)錄模板增加,mRNA的水DOC. 平增高, 表達(dá)活性增加, 產(chǎn)生過量的表達(dá)蛋白而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生；反常：雙微小染色體,無著絲粒,基因擴(kuò)增導(dǎo)致染色體結(jié)構(gòu)4. 染色體易位 原癌基因在腫瘤細(xì)胞中從染色體正常位置轉(zhuǎn)移到其他某個位置上稱為染色體 易位；易位導(dǎo)致原先無活性的原癌基因移至啟動子或增強(qiáng)子鄰近而激活；易位后失去原旁 側(cè)的抑制性調(diào)劑作用,使其表達(dá)增強(qiáng)；不同的癌基因有不同的激活方式,一種癌基因也可有幾種激活方式；例如 c-myc 的激活就有基因擴(kuò)增和基因重排兩種方式,變,

42、各種癌基因之間存在協(xié)同作用 腫瘤發(fā)生的不同階段；抑癌基因 ：一類抑制細(xì)胞過度生長、很少見 c-myc 的突變； 而 ras 的激活方式那么主要是突 , 腫瘤的發(fā)生是多步驟,多因素的,不同的癌基因作用于增殖,從而遏制腫瘤形成,當(dāng)其缺失或變異抑癌功能喪失導(dǎo)致腫瘤生成的基因,也稱為腫瘤抑制基因或隱性癌基因；抑癌基因的主要功能：調(diào)劑細(xì)胞生長 抑制細(xì)胞增殖 誘導(dǎo)終末分化和細(xì)胞凋亡 維護(hù)基因穩(wěn)固 抑制蛋白激酶活性轉(zhuǎn)變 DNA甲基化酶活性 調(diào)劑組織蛋白酶活性Rb基因 位于人 13 號染色體 q14, 全部序列約 200 kb, 含 27 個外顯子 , 可轉(zhuǎn)錄出 4.7kb 的 mRNA, 該 mRNA編碼分

43、子量為 105kD , 故被稱之為 P105 蛋白,能與 DNA結(jié)合； Rb 基因的作用是調(diào)劑細(xì)胞周期pRB具有兩種形式 : 磷酸化與非磷酸化非磷酸化的P105 為非活性型 , 可抑制細(xì)胞增殖, 磷酸化的 P105 為活性型可促進(jìn)細(xì)胞增殖Rb基因?qū)δ[瘤的抑制作用與轉(zhuǎn)錄因子 E-2F 有關(guān)E-2F 是一類激活轉(zhuǎn)錄作用的活性蛋白,掌握著 S 期的重要蛋白質(zhì)的合成如 DNA合成酶,在 G0、G1期,低磷酸化型的 Rb蛋白與 E-2F 結(jié)合成復(fù)合物,使 E-2F 處于非活化狀態(tài)；在 S期, Rb 蛋白被磷酸化而與 E-2F 解離, E-2F 變成游離狀態(tài),細(xì)胞立刻進(jìn)入增殖階段；當(dāng) Rb基因發(fā)生缺失或突

44、變,丟失結(jié)合、抑制E-2F 的才能,于是細(xì)胞增殖活躍,導(dǎo)致腫瘤發(fā)生；p53 基因定位 17p13.1 ,長 20kb, 有 11 個外顯子, 10 個內(nèi)含子；外顯子1 不編碼； 2、4、5、7、8 分別編碼五個高度保守的結(jié)構(gòu)域- ：13-19 ,117-143 ,171-181 ,236-258 ,270-286 ； p53 基因轉(zhuǎn)錄生成 2.5kb mRNA,編碼生成 393 個氨基酸的蛋白質(zhì), 分子量為 53kD；1、P53 蛋白的一級結(jié)構(gòu)可分為三個結(jié)構(gòu)域：.N-端 17-80 肽段為酸性區(qū),具有轉(zhuǎn)錄因子活性,促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄；DNA. 102-292 肽段為 DNA結(jié)合區(qū),能與DNA特異序列

45、結(jié)合,結(jié)合時需要Zn 2+參與；. C- 端 300-393 肽段為 p53 四聚體結(jié)合部位,該部位除與p53 四聚體結(jié)合外,與非特異結(jié)合也有關(guān)；P53 的生物學(xué)功能：1、抑制細(xì)胞增殖 P53 基因時刻監(jiān)控著基因的完整性,一旦細(xì)胞 DNA遭到損害, P53 蛋白與基因的 DNA 相應(yīng)部位結(jié)合,起特別轉(zhuǎn)錄因子作用,活化 p21 基因轉(zhuǎn)錄,P21 蛋白與cyclinE/CDK2 結(jié)合抑制該激酶的活性和其對 PRb的磷酸化, 使細(xì)胞停滯于 G1期； P53 蛋白與復(fù)制因子 A 相互作用參與 DNA的損耗修復(fù)；假如修復(fù)失敗,P53 蛋白即啟動程序性死亡過程誘導(dǎo)細(xì)胞自殺,阻擋有癌變傾向突變細(xì)胞的產(chǎn)生,從

46、而防止細(xì)胞惡變；2、促進(jìn) DNA損耗修復(fù)：當(dāng) DNA因各種物理、化學(xué)因素引起 DNA損耗時, P53 蛋白與受損DNA部位結(jié)合,起特別轉(zhuǎn)錄因子的作用,活化 GADD45基因轉(zhuǎn)錄修復(fù) DNA； GADD45蛋白與 CDK3和增殖細(xì)胞核抗原 PA 結(jié)合形成復(fù)合體 CDK3/ GADD45蛋白 /PA,促進(jìn) DNA修復(fù)； GADD45蛋白也可以 P21/CDK/ GADD45蛋白 /PA 四聚體形式,促使 DNA修復(fù)3、P53 蛋白仍可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡：當(dāng) DNA損耗不能修復(fù)時,P53 可誘導(dǎo) Bax 基因表達(dá), 形成Bax / Bax 復(fù)合體,因 Bax 基因具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；另外

47、,當(dāng) DNA損耗時,細(xì)胞表達(dá)DOC. p53 mRNA而導(dǎo)致 GADD45基因表達(dá)水平上升,使細(xì)胞的生長停止或凋亡；第十四章基因診斷和基因治療, 從 DNA/RNA水平檢測分析致病基因的存在, 變異和表達(dá)狀態(tài)基因診斷 ：應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)從而對疾病作出診斷的技術(shù)二、基因診斷的特點(diǎn)針對性強(qiáng)：以探測疾病基由于目標(biāo),屬于“ 病因診斷；3106kb 的基因組中檢測出特異性高：以分子雜交技術(shù)為根本原理靈敏度高：基因探針帶有非常敏銳的檢測標(biāo)記,可從人類長達(dá)某一基因的單堿基轉(zhuǎn)變；而且待測標(biāo)本微量；適應(yīng)性強(qiáng)： 其應(yīng)用的 X 圍已從原先局限的遺傳性疾病擴(kuò)大到感染性疾病、腫瘤、 心血管疾病等領(lǐng)域；基因探針可為任何

48、來源,任何種類,探針序列可為亦可未知,檢測目標(biāo)可為內(nèi)源基因亦可外源基因,診斷 X 圍廣；早期診斷： 基因診斷不僅可對有表型顯現(xiàn)的疾病作出明確診斷,它仍可在產(chǎn)前早期診斷遺傳性疾病,可檢出感染疾病埋伏期的病原微生物、仍可猜測和早期發(fā)覺某些惡性腫瘤；基因診斷的根本流程：制備基因探針；提取目的基因,獲得單鏈DNA； PCR 擴(kuò)增 DNA；目的 DNA與尼龍膜結(jié)合；探針與目的DNA互補(bǔ)配對；沖洗尼龍膜；檢測雜合分子基因診斷的根本技術(shù)一、核酸分子雜交hybridization依據(jù)堿基互補(bǔ)配對原那么,將樣品 DNA/RNA雙鏈經(jīng)變性處理,參與已標(biāo)記的單鏈 DNA/RNA探針,樣品中與探針互補(bǔ)的 DNA/RN

49、A序列可與探針形成雜交雙鏈 DNA,通過顯示標(biāo)記物或其它方法來檢測特定的核酸片段；分子雜交技術(shù)過程：探針制備與標(biāo)記同位素或非同位素待測核酸樣品制備別離,純化雜交液相,固相雜交后處理去掉非特異雜交分子顯示結(jié)果顯色,發(fā)光,放射自顯影結(jié)果分析分子雜交的根本方法原位雜交 不須提取 DNA或 RNA；直接用培育 / 采集的細(xì)胞涂載玻片上、組織切片固定載玻片上 和細(xì)菌菌落復(fù)印至濾膜上與標(biāo)記核酸探針雜交；可測知特定基因的存在或表達(dá)狀況；仍可觀看被測基因在細(xì)胞內(nèi)或染色體上的定位；斑點(diǎn)印跡雜交 把提取的 DNA/RNA樣本,直接點(diǎn)到硝酸纖維膜或尼龍膜上與標(biāo)記核酸探針雜交；通過纖維素膜雜交斑點(diǎn)的放射自顯影或膠片斑

50、點(diǎn)的光吸取值掃描可以測定待檢核酸的含量；可檢測特定基因的存在或表達(dá)情形；Southern 印跡雜交 將制備的 DNA經(jīng)酶切電泳、 再轉(zhuǎn)印到固相支持物上,用探針雜交后進(jìn)展檢測的方法,用于 DNA/DNA雜交；該方法主要用于檢測基因組中待測的基因或序列Northern 印跡雜交 檢測 RNA主要是 mRNA的方法PCR根本原理 DNA復(fù)制.三個步驟：變性denaturation 退火 annealing延長 extension 限制性片段長度多態(tài)性分析RFLP限制性核酸內(nèi)切酶能夠識別特定的DNA序列,并在其中的某一特定堿基位點(diǎn)限制性位點(diǎn)將 DNA切斷,使 DNA形成限制性片段 . RFLP技術(shù)診斷

51、疾病的機(jī)理 : 由于基因突變的結(jié)果 , 使 DNA上原有的核酸內(nèi)切酶的識別序列發(fā)生轉(zhuǎn)變 , 導(dǎo)致使用限制酶去切割時得到的結(jié)果與不發(fā)生突變的結(jié)果完全不同 , 可借此做出診斷. 如: 某些遺傳性疾病發(fā)生特異的點(diǎn)突變 , 而點(diǎn)突變位置正好是某些酶的識別和切割點(diǎn) , 可用酶切方法做出診斷 . DOC. 1. 點(diǎn)多態(tài)性 表現(xiàn)為 DNA鏈中發(fā)生單堿基突變,且突變導(dǎo)致一個原有酶切位點(diǎn)的丟失或形成一個新的酶切位點(diǎn)；據(jù)此,樣品 DNA經(jīng)特定內(nèi)切酶消化或 Southern 印跡雜交即可診斷某些疾病；2. 序列多態(tài)性 DNA鏈內(nèi)發(fā)生較大片段的缺失、重復(fù)、插入等變異；結(jié)果,內(nèi)切酶位點(diǎn)本身堿基序列雖未轉(zhuǎn)變,但原有內(nèi)切酶

52、位點(diǎn)在基因組中的相對位置轉(zhuǎn)變了從而導(dǎo)致 RFLP；也可用 Southern 印跡雜交診斷相關(guān)疾??；基因芯片 Gene chip, DNA chip,又稱為 DNA微陣列 DNA Microarray,是指固定在載體上的高密度 DNA微點(diǎn)陣；詳細(xì)地說就是將DNA片段或 cDNA片段作為探針,嚴(yán)密有序地排列固定于支持物 多聚賴氨酸硅膠上,然后與熒光標(biāo)記的樣品分子進(jìn)展雜交,通過檢測每個探針分子雜交信號的強(qiáng)度,獵取樣品分子的數(shù)量和序列信息；限制性內(nèi)切酶譜分析法 RE 等位基因特異寡核苷酸探針 ASO 原理 ：針對突變位點(diǎn)的基因：可以分別針對突變位點(diǎn)的序列,設(shè)計一對寡核苷酸探針,其中一條為野生型探針,與

53、無突變序列互補(bǔ),另一個為突變型探針,與突變序列互補(bǔ)；同時設(shè)計探針時, 突變堿基應(yīng)位于探針的中心,這樣在嚴(yán)格掌握雜交和洗脫條件下,只有完全互補(bǔ)的探針儲存下來,形成穩(wěn)固雜交分子,而中心堿基與靶序列不匹配的探針那么被洗脫；一、遺傳性疾病的診斷例 1：鐮狀紅細(xì)胞貧血 HBS-Beta 株蛋白基因突變點(diǎn)突變 , 發(fā)生在限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)上限制性片段長度多態(tài)性分析法 RFLP PCR- 限制性內(nèi)切酶分析技術(shù) Southern blot 鐮刀狀紅細(xì)胞貧血癥是由于 b 珠蛋白基因的點(diǎn)突變導(dǎo)致 mRNA第 6 位密碼子 GAG突變成 GUG,導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)反常 Glu Val ,限制酶 Mst 1 識別序列,突變后

54、不能識別,酶切位點(diǎn)消逝,限制酶切片段長度發(fā)生變化；Southern blot 檢測鐮狀細(xì)胞貧血,制備血液 DNA MstII消化 瓊脂糖電泳 轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜 與標(biāo)記的珠蛋白 DNA雜交 放射自顯影； PCR擴(kuò)增檢測 PCR擴(kuò)增珠蛋白基因 MstII 消化 瓊脂糖電泳 EB染色例 2： 地中海性貧血基因診斷PCR-ASO點(diǎn)突變,無限制性酶切位點(diǎn)轉(zhuǎn)變,采納PCR結(jié)合等位基因特異性寡核苷酸探針雜交技術(shù)突變 Gene 部位和性質(zhì),合成寡核 雜交 / 斑點(diǎn)雜交；Normal Gene 苷酸探針,32P 標(biāo)記,進(jìn)展Probe與正常 雜交穩(wěn)固Southern Blot Mutation S Gene P

55、robe 與反常S雜交穩(wěn)固病原體基因診斷的主要技術(shù)方法實(shí)時熒光定量 PCR Real Time Flourescence quantitative PCR, FQ PCR 實(shí)時熒光定量 PCR 在常規(guī) PCR 根底上,添加了一條標(biāo)記 2 個熒光基團(tuán)的熒光雙標(biāo)記探針；一個標(biāo)記在探針的 5 端,稱為熒光報告基團(tuán) R ；另一個標(biāo)記在探針的 3 端,稱為熒光抑制基團(tuán)淬滅基團(tuán) Q ；探針的 3 羥基 -OH 已被去除或封閉,不具有延長才能； 在探針分子完整的情形下, R 發(fā)出的熒光被 Q 淬滅吸取； 此時檢測不到熒光信號；當(dāng)特異性 PCR 擴(kuò)增發(fā)生時,探針會在 PCR 過程中被 Taq 酶的 5 -3

56、外切酶 活性作用切斷,釋放出 R 基團(tuán) , Q 的抑制作用消逝,從而引起報告基團(tuán)熒光信號的產(chǎn)生 , 熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號,即每擴(kuò)增一條 DNA鏈,就有一個熒光分子形成,實(shí)現(xiàn)了熒光信號的累積與 PCR產(chǎn)物形成完全同步；熒光信號相伴 PCR 產(chǎn)物的增長而增長目前用于臨床檢測的病原體基因診斷試劑絕大局部是此類；指紋圖譜法 : 用 HinfI 切割染色體 DNA.由于該酶在小衛(wèi)星 DNA的重復(fù)序列上無切點(diǎn) , 因此電泳后在用標(biāo)記的小衛(wèi)星 DNA做探針雜交時 , 不同個體顯現(xiàn)不同的雜交帶型 , 稱為指紋圖譜 . 至今世界上仍未發(fā)覺有兩個人的雜交帶型完全一樣 .1 高度的特異性 2 穩(wěn)固的遺傳性：

57、DNA 是人的遺傳物質(zhì),其特點(diǎn)是由父母遺傳的；分析發(fā)覺, DNA .指紋圖譜中幾乎每一條帶紋都能在其雙親之一的圖譜中找到,這種帶紋符合經(jīng)典的孟德爾遺傳規(guī)律,即雙方的特點(diǎn)平DOC. 均傳遞 50 給子代； 3 體細(xì)胞穩(wěn)固性：即同一個人的不同組織如血液、 . 肌肉、毛發(fā)、精液等產(chǎn)生的 DNA 指紋圖形完全一樣；基因治療 ：指應(yīng)用 DNA重組技術(shù), 將外源正?；?qū)氚屑?xì)胞,反常引起的疾病 , 以達(dá)到治療的目的；以訂正或補(bǔ)償因基因缺陷和基因敲除技術(shù) gene knockout 是指通過基因同源重組的過程定向的在活細(xì)胞中從基因組上 移出特定基因的過程,從而建立基因剔除細(xì)胞和基因剔除生物；直接基因治療和

58、間接基因治療1、直接基因治療 致病基因的原位置換 ：訂正突變基因,在原位修復(fù)缺陷的基因,以達(dá)到治療目的,為較抱負(fù)的基因治療策略；2、 間接基因治療：1 基因增補(bǔ)：將目的基因?qū)氩∽兗?xì)胞,并在細(xì)胞內(nèi)表達(dá),不需將缺陷基因替換出來,只 要目的基因在細(xì)胞中能夠表達(dá),就達(dá)到了治療的目的；這是目前基因治療大多采納的方法,對單拷貝基因遺傳病有效；如血友病；2 基因干預(yù) gene interference ：指采納特定的方式抑制某個基因的表達(dá),或者通過破壞某個基因而使之不表達(dá),以達(dá)到治療疾病的目的；基因干預(yù)的種類：反義RNA：封閉基因表達(dá)；核酶：裂解特異的靶mRNA；RNA干預(yù)技術(shù)：反義 RNAantisen

59、se RNA:是指與 mRNA互補(bǔ)的 RNA分子 , 通常由 15-20 個核苷酸組成 ；這種反義 RNA能與 mRNA分子特異性地互補(bǔ)結(jié)合形成二聚體 , 從而阻擋靶核酸的表達(dá)；1. 反義寡聚核苷酸可以激活 RNaseH,該酶可以切割 DNA RNA雜合分子中的 RNA鏈,導(dǎo)致靶 mRNA降解 2. 反義寡聚核苷酸可以通過空間位阻效應(yīng)阻擋核糖體結(jié)合來抑制靶 mRNA的翻譯RNA干預(yù) RNA interference, RNAi 是一種由雙鏈 RNA誘發(fā)的基因緘默現(xiàn)象；在此過程中,與雙鏈 RNA有同源序列的信使 RNAmRNA被降解,從而抑制該基因的表達(dá)；RNA干預(yù)機(jī)制 : 外源 dsRNA進(jìn)入

60、細(xì)胞后可激活 Dicer 多種核酸 酶、解螺旋酶、RNA依靠的 RNA聚合酶, 可以切割雙鏈 RNA,雙鏈 RNA再與 Dicer 形成緘默復(fù)合物 RISC ,RISC具有結(jié)合和切割 mRNA的作用而介導(dǎo) RNA干預(yù)的過程；2 個步驟：1長雙鏈 RNA被細(xì)胞源性的雙鏈 RNA特異的核酸酶 Dicer 切成 21-23個堿基對的短雙鏈 RNA,稱為小干擾性 RNAsmall interfering RNA 2小干擾性 RNA 與細(xì)胞源性的某些酶和蛋白質(zhì)形成復(fù)合體,稱為RNA 誘導(dǎo)的緘默復(fù)合體RNA-induced silencing plex,RISC,該復(fù)合體可識別與小干擾性RNA有同源序列的