前列腺癌方面免疫組化基礎(chǔ)知識(shí)

1、前列腺癌的免疫組化標(biāo)記物發(fā)表時(shí)間：2022-5-13 來(lái)源：?中外健康文摘?2022年第10期供稿 胡新梅 于民 姜敏第一頁(yè)，共三十八頁(yè)。1 前列腺特異性抗原前列腺特異性抗原(prostate specific antigen，PSA)是分子量34000的單鏈糖蛋白，由237個(gè)氨基酸構(gòu)成，它是一種絲氨酸蛋白酶，使凝固的精液溶解、液化。它是在1979年作為前列腺腺上皮細(xì)胞的標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)的。血清PSA目前已被廣泛應(yīng)用于前列腺癌的早期篩查。第二頁(yè)，共三十八頁(yè)。PSA在正常前列腺、前列腺增生、前列腺癌、前列腺上皮內(nèi)瘤，均呈陽(yáng)性表達(dá)，定位于上皮細(xì)胞的胞質(zhì)中，而在前列腺轉(zhuǎn)移癌那么呈陰性表達(dá)，因此PAS陽(yáng)性

2、提示腫瘤來(lái)自前列腺上皮，可用于區(qū)分前列腺癌與前列腺轉(zhuǎn)移癌5。PSA在前列腺良、惡性病變中均呈陽(yáng)性表達(dá)，故PSA不能用于鑒別良惡性病變。幾乎所有的前列腺癌除了分化最差的癌和少數(shù)激素治療后復(fù)發(fā)的進(jìn)展期癌以外PSA標(biāo)記都陽(yáng)性，而高分化前列腺癌的PSA表達(dá)強(qiáng)于低分化前列腺癌, 說(shuō)明PSA表達(dá)與分化程度有關(guān)。而對(duì)于分化很差的癌，即使PSA陰性也不能完全排除前列腺癌，還要結(jié)合其他檢查綜合考慮。偶爾PAS陽(yáng)性可出現(xiàn)在前列腺以外的組織和腫瘤，但一般為局灶性弱陽(yáng)性 6。第三頁(yè)，共三十八頁(yè)。5Harvey AM, Grice B, Hamilton C, et a1. Diagnostic utility of

3、p504s/p63 cocktail, prostate-specific antigen, and prostatic acid phosphatase in Verifying prostatic carcinoma involvement in seminal Vesicles: a study of 57 cases of radical prostatectomy, speciments of pathologic stage pT3bJ. Arch Pathol Lab Med,2022,134(7):983-988.6Bostwick D G, Qian J, Ramnani D

4、 M. Immunohistochemistry of the prostate and bladder, testis and renal tumors. In: Dabbs D J, ed. Diagnostic Immunohistochemistry. Philadelphia: Churchill Livingstone, 2002.407-33第四頁(yè)，共三十八頁(yè)。CK34El21984年，Gown等7首先報(bào)道了CK34El2，它是一種高分子量5700066000的細(xì)胞角蛋白。CK34El2標(biāo)記良性前列腺組織，僅在前列腺基內(nèi)幕胞的細(xì)胞膜以及細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，而不在前列腺分泌上皮細(xì)胞表達(dá)，

5、故CK34El2可作為對(duì)前列腺的基內(nèi)幕胞層進(jìn)行選擇性的標(biāo)記8。由于基內(nèi)幕胞消失是診斷前列腺癌的重要形態(tài)學(xué)依據(jù)，而蘇木素-伊紅染色切片判斷基內(nèi)幕胞是否存在常十分困難，因此用CK34El2標(biāo)記基內(nèi)幕胞就成為前列腺良惡性鑒別診斷的重要手段之一。第五頁(yè)，共三十八頁(yè)。在正常和良性增生以及上皮內(nèi)瘤的前列腺腺體，導(dǎo)管周圍形成連續(xù)或斷續(xù)的CK34E12分布。而前列腺癌的腺體的基內(nèi)幕胞層完全消失，所以最終表現(xiàn)為CK34E12不表達(dá)。但CK34E12標(biāo)記基內(nèi)幕胞可局部陰性，對(duì)經(jīng)尿道電切的標(biāo)本，常因標(biāo)本經(jīng)人為燒灼而受影響，因此可靠性和穩(wěn)定性欠佳。有20%30%的前列腺癌導(dǎo)管腺癌和篩狀癌周圍有連續(xù)或間斷的基內(nèi)幕胞，而

6、局部良性前列腺病變,如腺病和不完全性萎縮的腺泡周圍基內(nèi)幕胞可局部甚至完全消失。說(shuō)明基內(nèi)幕胞消失并非診斷前列腺癌的絕對(duì)指標(biāo)。而免疫組化操作不當(dāng)，那么有可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果而誤診。故免疫組化結(jié)果應(yīng)結(jié)合HE切片中的其他形態(tài)學(xué)特征綜合判斷。第六頁(yè)，共三十八頁(yè)。P63 1998年，Okada等9別離出新基因P63，P63是P53抑癌基因家族的成員，位于人類染色體3q27-29。P63能特異性地標(biāo)記前列腺基內(nèi)幕胞，呈胞核陽(yáng)性，棕黃色顆粒狀，故而可以顯示基內(nèi)幕胞的存在，而前列腺的分泌上皮細(xì)胞那么呈陰性10。絕大多數(shù)的前列腺良性增生及低級(jí)別上皮內(nèi)瘤的腺體的周圍呈現(xiàn)連續(xù)性的P63分布；而高級(jí)別上皮內(nèi)瘤可見P63不

7、同程度的間斷消失，而前列腺癌中腺體周圍P63為陰性，顯示基內(nèi)幕胞已經(jīng)完全的消失。因此，P63也可用于前列腺癌的鑒別診斷。第七頁(yè)，共三十八頁(yè)。CK34E12、P63均可用于標(biāo)記基內(nèi)幕胞，而作為診斷前列腺癌的有力手段。P63與CK34El2相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)：局部CK34E12標(biāo)記陰性的基內(nèi)幕胞，P63標(biāo)記可呈陽(yáng)性；對(duì)有燒灼的經(jīng)尿道電切的前列腺標(biāo)本，P63標(biāo)記結(jié)果比較穩(wěn)定。P63標(biāo)記基內(nèi)幕胞呈核陽(yáng)性，結(jié)果容易判斷，背景比較清晰。缺點(diǎn)那么是其陽(yáng)性表達(dá)是間斷的，當(dāng)可疑腺泡少時(shí)，判斷其基內(nèi)幕胞是否消失有時(shí)比較困難。在實(shí)際應(yīng)用中，兩者具有互補(bǔ)作用。第八頁(yè)，共三十八頁(yè)?；鶅?nèi)幕胞消失是前列腺癌的重要診斷依據(jù)，

8、但局部的基內(nèi)幕胞缺失卻不能作為診斷前列腺癌的唯一標(biāo)準(zhǔn)。由于前列腺癌可有殘留的基內(nèi)幕胞，而且浸潤(rùn)性癌在管腔內(nèi)擴(kuò)散及良性腺體陷入癌組織中11,因此個(gè)別前列腺癌中CK34El2與P63亦有陽(yáng)性表達(dá)。少數(shù)前列腺增生病變基內(nèi)幕胞標(biāo)記亦呈陰性表達(dá)，說(shuō)明少數(shù)前列腺良性腺體基內(nèi)幕胞可以不連續(xù)或不能被證實(shí)存在，這也提示基內(nèi)幕胞免疫標(biāo)志物陰性不能單獨(dú)作為確診惡性的指標(biāo)。第九頁(yè)，共三十八頁(yè)。-甲基-輔酶A-消旋酶 (P504s)2001年Jiang等12首次將P504s抗體應(yīng)用于前列腺癌的診斷。P504s即-甲基-輔酶A-消旋酶(alpha-methylacyl-CoA racemase)，其基因定位于染色體5P1

9、3，它所編碼的蛋白由382個(gè)氨基酸組成，在支鏈脂肪酸的-氧化和衍生過(guò)程中起作用。P504s在前列腺癌中高表達(dá)，而在正常中前列腺組織中那么呈陰性或灶性弱陽(yáng)性。Jiang等在所檢測(cè)的137例前列腺癌中陽(yáng)性率高達(dá)100%，并提出P504s是前列腺癌高度敏感性和特異性的標(biāo)記物。第十頁(yè)，共三十八頁(yè)。P504s陽(yáng)性，CK34El2和p63陰性，能從正反兩面支持前列腺癌診斷，從而大大提高前列腺癌的診斷正確率13。然而，臨床上并非所有的前列腺癌都是P504s陽(yáng)性，CK34El2及p63陰性，也并非所有的前列腺良性病變都是P504s陰性，CK34El2及p63完整陽(yáng)性。楊京哲14等人的試驗(yàn)中，P504s不僅在前

10、列腺癌中有高表達(dá)，而且在前列腺上皮內(nèi)瘤中也高表達(dá)，這說(shuō)明P504s不但對(duì)前列腺癌敏感，并且對(duì)PIN也非常敏感，故用P504s只能區(qū)別前列腺良性增生，而不能把前列腺癌和PIN鑒別開來(lái)。第十一頁(yè)，共三十八頁(yè)。2004版 WHO中， P504s在前列腺癌的陽(yáng)性率為80%以上，但在某些前列腺癌如泡沫狀腺癌、萎縮性癌、假增生性癌和治療后前列腺癌中陽(yáng)性率比較低。而且P504s在12%的良性增生，17.5%的前列腺腺病，萎縮型腺體以及90%以上的高級(jí)別PIN中呈陽(yáng)性反響。此外，P504s在前列腺以外的腫瘤如尿路上皮癌、結(jié)腸癌、腎癌以及良性腎源性腺瘤也可陽(yáng)性。這說(shuō)明P504s沒有組織特異性，不是前列腺癌的特異

11、性標(biāo)志物。第十二頁(yè)，共三十八頁(yè)。綜上所述，免疫組化在前列腺癌診斷中的應(yīng)用具有重要價(jià)值，但決不能完全依靠免疫組化去診斷前列腺癌，單獨(dú)的P504s(或基內(nèi)幕胞標(biāo)志物)陽(yáng)性或陰性均不能確診前列腺癌。只有將組織病理形態(tài)與免疫組化染色結(jié)果結(jié)合起來(lái)，全面分析，綜合判斷，才能有效地防止誤診。第十三頁(yè)，共三十八頁(yè)。免疫酶細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)-實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸技術(shù)周德山免疫酶細(xì)胞化學(xué)是免疫細(xì)胞化學(xué)Immunocytochemistry,ICC中最常用的方法之一，它是在抗原抗體特異反響存在的前提條件下，借助于酶細(xì)胞化學(xué)的手段，檢測(cè)某種物質(zhì)抗原/抗體在組織細(xì)胞內(nèi)存在部位的一門新技術(shù)：即預(yù)先將抗體與酶連結(jié)，再使其與組織

12、內(nèi)特異抗原反響，經(jīng)細(xì)胞化學(xué)染色后，于光鏡或電子顯微鏡下觀察分析的形態(tài)學(xué)研究方法。第十四頁(yè)，共三十八頁(yè)。為克服熒光抗體法的缺乏、并能在超微結(jié)構(gòu)水平定位抗原物質(zhì)的存在部位，Nakane(1966)等成功地引入了酶代替熒光色素標(biāo)記抗體，進(jìn)行組織細(xì)胞內(nèi)抗原或半抗原的定位，開辟了酶標(biāo)抗體技術(shù)免疫酶細(xì)胞化學(xué)之路。結(jié)合筆者經(jīng)驗(yàn)，介紹ICC染色中的主要程序：組織標(biāo)本的固定、切片、染色原理及步驟、結(jié)果判定及一些進(jìn)展、特殊應(yīng)用等供讀者參考。第十五頁(yè)，共三十八頁(yè)。第一節(jié)固定和切片一、固定假設(shè)想得到理想的ICC染色結(jié)果、正確地判斷抗原物質(zhì)在組織細(xì)胞內(nèi)的位置，除需有良好酶和抗體外，保持組織細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的不動(dòng)性Immo

13、bility和免疫活性也是至關(guān)重要的。換言之，如果抗原物質(zhì)在組織細(xì)胞間彌散、喪失或失去免疫活性，無(wú)論如何努力染色都是徒勞的，所以說(shuō)固定是ICC染色中非常重要的一環(huán)。ICC與其它組織學(xué)技術(shù)不同，除要求保存良好的結(jié)構(gòu)外，還需保存組織抗原的免疫活性。一般認(rèn)為，新鮮組織能夠最大限度地保存組織抗原的免疫活性，但結(jié)構(gòu)較差，易出現(xiàn)抗原彌散喪失現(xiàn)象。第十六頁(yè)，共三十八頁(yè)。Cumming1980報(bào)告，不固定的組織切片ICC染色時(shí)，環(huán)鳥苷酸含量喪失80%以上。固定的目的是使構(gòu)成組織細(xì)胞成分的蛋白等物質(zhì)不溶于水和有機(jī)溶劑，并迅速使組織細(xì)胞中各種酶降解、失活，防止組織自溶和抗原彌散，保持組織細(xì)胞的完整性和所要檢測(cè)物質(zhì)

14、的抗原性。因此迅速充分固定是ICC染色成功的關(guān)鍵一步。用于ICC的固定劑種類較多，選擇時(shí)應(yīng)根據(jù)所要檢測(cè)物質(zhì)的抗原性質(zhì)和切片方法以及所用抗體特征等做最佳答案篩選。制片及固定方法見第一章，下面介紹兩種近年報(bào)道的新方法。第十七頁(yè)，共三十八頁(yè)。1AMEXAcetone Meth Enzoate Xylene 法是改進(jìn)的冰凍置換法freeze substitution的簡(jiǎn)稱，主要用于石蠟包埋標(biāo)本。Sato(1986)報(bào)告，該法具有同新鮮未固定組織冰凍切片同樣的抗原保持性和石蠟切片的良好組織結(jié)構(gòu)保存。其機(jī)制為：組織在丙酮中固定脫水，組織細(xì)胞內(nèi)水份逐漸被丙酮取代，繼之，用苯甲酸酯取代組織內(nèi)丙酮，經(jīng)二甲苯置換

15、后，石蠟包埋。組織在-20丙酮內(nèi)過(guò)夜亦形成冰晶，所以原方法將組織先置4丙酮2030min，再移入-20丙酮過(guò)夜。實(shí)際上組織在4丙酮內(nèi)過(guò)夜亦可得到同樣效果。如在該固定液內(nèi)參加少量蛋白酶活性阻斷劑，并采用低溶點(diǎn)石蠟包埋等，可獲得更佳染色結(jié)果。第十八頁(yè)，共三十八頁(yè)。微波固定Microwave fixation為近幾年所注目的問(wèn)題之一。該方法能保持良好的組織結(jié)構(gòu)和抗原性，適于各種切片的酶組化、ICC以及免疫電鏡等材料固定。其固定機(jī)理可能與微波頻率10003000MHz具有被水分吸收的性質(zhì)通常所用的微波是頻率2450MHz，波長(zhǎng)12cm；生物材料含有大量水份，照射后，溫度升高，分子運(yùn)動(dòng)加快，促進(jìn)固定液向

16、組織內(nèi)滲透，加速與組織成分的反響，短時(shí)間內(nèi)到達(dá)固定的效果等有關(guān)。經(jīng)微波照射固定的組織，需置相同固定液中，繼續(xù)固定26h，室溫。第十九頁(yè)，共三十八頁(yè)。二、切片光鏡ICC染色，常用的有冰凍切片和石蠟切片兩種，二者各有其優(yōu)缺點(diǎn)，應(yīng)根據(jù)抗原的性質(zhì)、實(shí)驗(yàn)室條件，合理選擇之。對(duì)未知抗原顯示時(shí)，最好同時(shí)應(yīng)用。冰凍切片為ICC研究所首選。第二十頁(yè)，共三十八頁(yè)。Shi1991等報(bào)告：微波爐照射的切片，能夠激活局部核內(nèi)抗原活性。其機(jī)制不清，可能與高溫、高熱的作用，使核內(nèi)DNA雙鏈解開，DNA、RNA解離，抗原暴露有關(guān)。其步驟為：將切片脫蠟水洗后，置染色瓶中，參加去離子水或緩沖液至瓶頸處，反復(fù)屢次照射，每次1min

17、，照射510次，每次照射后，補(bǔ)充瓶中蒸發(fā)掉的液體，照射溫度不超過(guò)9095為宜。此處理后，細(xì)胞核染色以蘇木精為佳第二十一頁(yè)，共三十八頁(yè)。第二節(jié)染色方法一、本科標(biāo)抗體法酶標(biāo)抗體技術(shù)是通過(guò)共價(jià)鍵將酶連結(jié)在抗體上，制成酶標(biāo)抗體，再借酶對(duì)底物的特異催化作用，生成有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒，于光鏡或電鏡下進(jìn)行細(xì)胞外表及細(xì)胞內(nèi)各種抗原成分的定位。第二十二頁(yè)，共三十八頁(yè)。一酶的種類及特點(diǎn)從理論上講，用細(xì)胞化學(xué)方法能顯示的酶，均可用于標(biāo)記抗體，進(jìn)行ICC染色，但實(shí)際上在ICC中所能用的酶并不多?，F(xiàn)將常用的幾種酶列于表4-1，供選用時(shí)參考。第二十三頁(yè)，共三十八頁(yè)。第二十四頁(yè)，共三十八頁(yè)。Sternb

18、erger(1986)指出，用于標(biāo)記的酶應(yīng)具備以下幾點(diǎn)酶催化的底物必須是特異的，且容易被顯示，所形成的產(chǎn)物易于光鏡或電鏡下觀察；所形成的終產(chǎn)物沉淀必須穩(wěn)定，即終產(chǎn)物不能從酶活性部位向周圍組織彌散，影響組織學(xué)定位；較易獲得的酶分子，最好有商品出售；中性pH時(shí)，酶應(yīng)穩(wěn)定，酶標(biāo)記抗體后，保存12年活性不應(yīng)改變，且酶的催化活性Turnover越高越好；酶標(biāo)過(guò)程中，酶與抗體連結(jié)，不能影響二者的活性；被檢測(cè)組織中，不應(yīng)存在與標(biāo)記酶相同的內(nèi)源性酶或類似物質(zhì)。第二十五頁(yè)，共三十八頁(yè)。二本科標(biāo)抗體的制備Boosma,DM, 1983酶標(biāo)抗體與熒光色素標(biāo)記抗體不同，它需借助橋-偶聯(lián)劑的作用，將酶連結(jié)在抗體分子上。

19、偶聯(lián)劑是一種雙功能試劑，具備3個(gè)根本特征：偶聯(lián)劑與抗體和酶之間的連結(jié)，必須是不可逆的，即借共價(jià)鍵連結(jié)；偶聯(lián)劑不應(yīng)影響酶和抗體的活性；不能因偶聯(lián)劑的參加，使酶與組織成分了生非特異結(jié)合?？贵w制作步驟未列出第二十六頁(yè)，共三十八頁(yè)。四染色原理及步驟1根本原理酶標(biāo)抗體與熒光色素標(biāo)記抗體的染色相同，亦分直接法和間接法。直接法是將酶直接標(biāo)記在每一抗體上，間接法是將酶標(biāo)記在第二抗體上，檢測(cè)組織細(xì)胞內(nèi)的特定抗原物質(zhì)。間接法所用的第一抗體是對(duì)組織細(xì)胞內(nèi)某種抗原的特異性抗體80%90%的抗血清系由家兔制得，而絕大數(shù)單克隆抗體系由小鼠制備；第二抗體那么為第一抗體家兔/小鼠的IgG的抗體。所以，只要不同的第一抗體均來(lái)自

20、同一種屬，同一標(biāo)記的第二抗體就能用來(lái)顯示其不同特異性抗原的存在，這樣可防止了直接法中標(biāo)記每一種第一抗體的麻煩，并且提高了方法的敏感度。目前的ICC染色中，以間接法為常用，在此著重介紹間接法的染色程序。第二十七頁(yè)，共三十八頁(yè)。2染色程序1切片準(zhǔn)備：見第一章。石蠟切片經(jīng)二甲苯或Hemo-De脫蠟，下行酒精至水。固定/無(wú)固定新鮮組織冰凍切片，室溫枯燥2h以上。2未固定的新鮮組織切片，丙酮固定2030min(fretrieval )，簡(jiǎn)而言之，即用蛋白酶處理，去除固定劑交聯(lián)造成的空間遮蔽室溫，風(fēng)干1530min.;已固定的組織冰凍切片及石蠟切片，根據(jù)需要可進(jìn)行組織抗原的激活。第二十八頁(yè)，共三十八頁(yè)。3

21、用蠟筆沿切片周圍勾劃一道屏障，以防止孵育液流失及孵育過(guò)程中切片枯燥，同時(shí)也能節(jié)省抗體用量，保持切片與抗體的充分接觸，風(fēng)干。石蠟切片滴少量PBS，以防其枯燥直接進(jìn)行步驟6。4切片經(jīng)PBS或其它緩沖液漂洗3次，每次2min，溶解除去冰凍切片上的OCT包埋劑。但應(yīng)用ALP標(biāo)記抗體時(shí)，禁用二甲胂酸鈉緩沖液漂洗，因后者可使ALP失活。5根據(jù)需要，用甲醇+0.3%H2O2處理切片1530min室溫，封閉內(nèi)源性過(guò)氧化酶的活性。應(yīng)用ALP標(biāo)記抗體時(shí)，此步可省略。第二十九頁(yè)，共三十八頁(yè)。6PBS漂 洗2min共兩次，移至0.05%Tween-20/PBS(或0.221%Triton X-100)中5min室溫。

22、Tween-20為一種外表活性劑，除具有清潔作用外，還可增加組織的通透性，有利于組織細(xì)胞內(nèi)抗原的顯示。74%Block Ace或0.1%1%BSA濕盒內(nèi)孵育1525min室溫，然后；輕輕棄去孵育液不沖洗；以阻斷組織與抗體的非特異性結(jié)合，降低背景染色。8根據(jù)需要，可用1/51/30正常來(lái)活兔/羊血清孵育1520min室溫，以酶標(biāo)抗體相同種屬正常血清為宜，最好是同一動(dòng)物免疫前的血清?；蛘呤÷源瞬?，而在稀釋酶標(biāo)抗體時(shí)，參加1%2%的同一種屬正常血清。第三十頁(yè)，共三十八頁(yè)。9輕輕棄去孵育液， 滴加含0.2%BSA/0.05 NaN3/PBS稀釋的第一抗體抗體用量：每張切片一般為5080l，濕盒內(nèi)孵育1

23、2h2025；免疫電鏡用標(biāo)本，4過(guò)夜。10PBS充分沖洗3次2min，以去除切片上非特異吸附的抗體。應(yīng)用不同的第一抗體或同時(shí)進(jìn)行對(duì)照標(biāo)本染色時(shí)，需分別沖洗，以防相互污染。11經(jīng)0.05%Tween-20/PBs 2min后,滴加含0.2%BSA/1%正常血清/PBS稀釋的HRP酶標(biāo)記的第二抗體,濕盒內(nèi)孵育4560min(2025)。第三十一頁(yè)，共三十八頁(yè)。12PBS漂洗3次2min,此處不需分別漂洗，因所有切片均系同一酶標(biāo)抗體孵育。13未固定或固定較弱的冰凍切片，此處可輕微固定。首先將切片從PBS移至TBS中35min，去除PBS，以防其中的磷酸與后面使用的固定液中的CaCl2形成磷酸鈣而沉淀

24、后，然后用Baker氏固定液固定5min室溫此時(shí)輕微固定，既不影響抗原抗體結(jié)合，又較有利于保存第一抗體孵育前的組織抗原，尤其適用于單克隆抗體的ICC染色。第三十二頁(yè)，共三十八頁(yè)。14呈色：HRP標(biāo)記抗體的呈色液為0.01%0.1%H2O2 0.01%0.05% DAB 0.050.1mol/L Tris HCl(pH7.4)。切片經(jīng)PBS或Tris-HCl液漂洗后，置上述呈色液內(nèi)1015min室溫、暗處，亦可鏡下控制顯色速度。終產(chǎn)物為棕褐色沉淀。用于電鏡觀察的標(biāo)本，呈色35min即可，防止DAB終產(chǎn)物向周圍擴(kuò)散，影響超微結(jié)構(gòu)定位。另外，顯色液應(yīng)于用前新鮮配制，防止DAB本身氧化變質(zhì)。新配制的DAB為無(wú)色透明液體。假設(shè)DAB液已氧化變?yōu)樽霞t色，應(yīng)換新藥重新配制。15將切片置流水中僅光鏡觀察或PBS電鏡標(biāo)本內(nèi)，終止呈色反響。16未固定的冰凍切片，可用1%戊二醛-PBS液加強(qiáng)固定510min室溫，流水沖洗。第三十三頁(yè)，共三十八頁(yè)。17細(xì)胞核輕度染色，以甲基綠和蘇木精為常用。前者細(xì)胞核呈綠色，與HRP/ALP等終產(chǎn)物比照度尤佳，但不適于微波照射的標(biāo)本。蘇木精是組織學(xué)、病理學(xué)研究中普遍應(yīng)