高效液相色譜法測定杜仲愈傷組織和懸浮細(xì)胞中綠原酸

1、高效液相色譜法測定杜仲愈傷構(gòu)造和懸浮細(xì)胞中綠原酸張志斌，邱曉芳，顏日明，曾慶桂，游海朱篤【摘要】目的創(chuàng)立高效液相色譜法測定杜仲愈傷構(gòu)造和懸浮細(xì)胞中綠原酸含量。要領(lǐng)使用Hypersil18-DS柱(2504.6，5)色譜柱，乙腈-水-磷酸溶液(1287.90.1)為活動相，檢測波長為327n，流速1.0l/in，柱溫為25。結(jié)果綠原酸在2.21655.4g/l范疇內(nèi)線性干系精良，r=0.9981，愈傷構(gòu)造和懸浮細(xì)胞中綠原酸的均勻加樣接納率別離為100.69%和97.62%，RSD別離為2.42%和2.71%。結(jié)論該要領(lǐng)快速輕便，正確可靠。杜仲愈傷構(gòu)造和懸浮細(xì)胞中綠原酸含量別離為1.528g/g和

2、3.949g/g?！娟P(guān)鍵詞】杜仲愈傷構(gòu)造懸浮細(xì)胞綠原酸高效液相色譜法Keyrds：Euiaulidesliv;allus;Suspensinell;hlrgeniaid;HPL杜仲Euiaulidesliv為杜仲科杜仲屬植物，為我國珍貴中藥材，具有補肝腎、強筋骨、安胎、落血壓之成果1。比年來，我國的制藥產(chǎn)業(yè)、保健品消費以及產(chǎn)業(yè)質(zhì)料等方面臨杜仲的需求不竭增長2。人們?yōu)榱藢で蠖唐诮?jīng)濟(jì)效益，無籌劃人工砍伐開采杜仲資源，加之杜仲生長遲鈍，天然情況的粉碎等緣故原由，杜仲野生資源日趨枯竭，已經(jīng)不克不及滿意人們的必要。因此除充實使用現(xiàn)有野生杜仲資源外，使用杜仲愈傷構(gòu)造和細(xì)胞的大范圍造就來得到高含量藥用身分的

3、質(zhì)料提供應(yīng)杜仲產(chǎn)業(yè)市場已成為一種生長趨勢。綠原酸是杜仲中一種緊張的活性身分，具有抗菌、抗病毒、保肝、落壓等藥用成果，2022版?中國藥典?將其量的凹凸定為評價杜仲藥用代價的重要技能指標(biāo)之一3。使用HPL法測定杜仲綠原酸的研究已有大量報道4，5。為了共同杜仲愈傷構(gòu)造和細(xì)胞造就的研究，本研究創(chuàng)立了測定杜仲愈傷構(gòu)造和懸浮細(xì)胞中綠原酸的HPL要領(lǐng)，并使用HPL法對愈傷構(gòu)造和由杜仲疏松愈傷構(gòu)造創(chuàng)立的懸浮細(xì)胞系下造就所得的細(xì)胞中綠原酸舉行了含量測定，從而為使用細(xì)胞工程要領(lǐng)消費綠原酸提供必然的實行根據(jù)。1質(zhì)料與儀器Agilent1100高效液相色譜儀(裝備四元泵，VD檢測器，真空脫氣機(jī)，柱溫箱)，Hphe事

4、情站，KQ-500DB數(shù)控超聲洗濯器，Sartrius萬分之一電子天平，0.45過濾器，冷凍枯燥體系。綠原酸比擬品由中國藥品生物成品檢定所提供。杜仲愈傷構(gòu)造按文獻(xiàn)6要領(lǐng)舉行誘導(dǎo)和繼代造就，愈傷構(gòu)造2周繼代1次，繼代3次后，將愈傷構(gòu)造取出，真空冷凍枯燥后供樣品制備用。懸浮細(xì)胞是按考獻(xiàn)7要領(lǐng)挑選所得疏松愈傷構(gòu)造在本實行室優(yōu)化所得的液體造就基下，置于搖床中舉行懸浮造就所得。造就1周后，將其取出真空冷凍枯燥供樣品制備用。樣品提取所用甲醇為闡發(fā)純，HPL用乙腈、磷酸為色譜純，水為三蒸水。2要領(lǐng)2.1色譜條件色譜柱Hypersil18-DS柱(2504.6，5)，活動相為乙腈-水-磷酸溶液(1287.90

5、.1)；檢測波長為327n；流速1.0l/in；柱溫為25；進(jìn)樣量為10l，接納面積外標(biāo)法。3結(jié)果3.1綠原酸的色譜闡發(fā)在“2.1項色譜條件下，綠原酸尺度品、杜仲愈傷構(gòu)造及懸浮細(xì)胞溶液的色譜闡發(fā)見圖13。樣品中綠原酸峰與其他非被測身分峰可以或許到達(dá)基線分散，可按照尺度品洗脫峰所得保存時間確定樣品溶液中綠原酸的峰。圖1綠原酸尺度品HPL圖譜略圖2愈傷構(gòu)造中綠原酸HPL圖譜略圖3懸浮細(xì)胞中綠原酸HPL圖譜略3.2尺度曲線的制備取按“2.2項要領(lǐng)制備的儲藏液舉行尺度曲線的制備。每個比擬品儲藏液進(jìn)樣10l，測定峰面積。以峰面積值Y為縱坐標(biāo)，其對應(yīng)進(jìn)樣質(zhì)量濃度(X，g/l)為橫坐標(biāo)，舉行回歸盤算，得線性

6、方程為：Y=71.904X-40.479，r=0.9981。表白綠原酸濃度為2.21655.4g/l范疇內(nèi)具有精良的線性干系。3.3細(xì)密度實行細(xì)密汲取比擬品溶液重復(fù)進(jìn)樣5次，每次10l，別離測定峰面積，綠原酸峰面積的RSD(相對尺度缺點)為0.8%。表白儀器細(xì)密度和進(jìn)樣要領(lǐng)精良。3.4重復(fù)性實行正確稱取杜仲愈傷構(gòu)造和懸浮細(xì)胞樣品各5份，每份0.2g，按“2.3項下要領(lǐng)制備樣品溶液，進(jìn)樣闡發(fā)，測定綠原酸峰面積，外標(biāo)法盤算含量。杜仲愈傷構(gòu)造和懸浮細(xì)胞樣品中綠原酸含量的RSD別離為1.8%和2.4%。表白樣品處置懲罰要領(lǐng)重復(fù)性好。3.5加樣接納率實行正確稱取綠原酸含量的愈傷構(gòu)造和懸浮細(xì)胞樣品各5份，

7、每份0.2g，別離參加適量綠原酸比擬品，按“2.3項下操縱制備樣品溶液，進(jìn)樣10l，測定綠原酸含量，盤算加樣接納率。結(jié)果見表1和表2。表1愈傷構(gòu)造中綠原酸加樣接納實行結(jié)果略表2懸浮細(xì)胞中綠原酸加樣接納實行結(jié)果略3.6樣品測定結(jié)果按照上述條件對愈傷構(gòu)造和綠原酸樣品舉行含量測定，每樣品3份。結(jié)果見表3。綠原酸的含量在愈傷構(gòu)造和懸浮細(xì)胞中有較大的不同。懸浮細(xì)胞中綠原酸的均勻含量為愈傷構(gòu)造中的2.6倍，說明在懸浮細(xì)胞中綠原酸的積聚更有上風(fēng)。表3杜仲愈傷構(gòu)造和懸浮細(xì)胞綠原酸含量略4討論4.1提取要領(lǐng)的選擇如今提取杜仲中活性身分綠原酸重要包羅超聲、回流和冷浸等要領(lǐng)，提取相一樣平常為水和有機(jī)溶劑8。本文以杜

8、仲愈傷構(gòu)造為質(zhì)料對提取要領(lǐng)舉行觀察，比力了甲醇的含量及提取時間對提取服從的影響。以水、20%甲醇、50%甲醇、80%甲醇為溶劑，超聲提取60in，結(jié)果以50%甲醇為溶劑時，色譜峰分散結(jié)果最正確，并且提取完全；比力l5，30，60，90in的超聲提取結(jié)果，結(jié)果60in時提取服從最高。4.2綠原酸測定要領(lǐng)的創(chuàng)立實行接納HPL測定杜仲愈傷構(gòu)造和懸浮細(xì)胞中綠原酸的含量，結(jié)果正確，細(xì)密度高，重復(fù)性好，均勻加樣接納率別離為100.69%和97.62%，RSD為2.42%和2.71%。說明該要領(lǐng)可用于杜仲愈傷構(gòu)造和懸浮細(xì)胞范圍消費中活性身分的定量闡發(fā)。4.3杜仲的愈傷構(gòu)造和細(xì)胞造就由于野生資源的匱乏，通過愈

9、傷構(gòu)造和細(xì)胞造就消費所必要的目的產(chǎn)物愈來愈引起人們的器重與存眷。實行表白泉源于杜仲種子誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷構(gòu)造和懸浮細(xì)胞都可以或許產(chǎn)生綠原酸，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.528g/g和3.949g/g。同野生杜仲葉中報道的綠原酸比擬，愈傷構(gòu)造和懸浮細(xì)胞中含量另有待進(jìn)步9。我們將進(jìn)一步通過高產(chǎn)細(xì)胞株系的挑選和造就條件的探究與優(yōu)化，使其到達(dá)或超出天然泉源的含量10，11。使用杜仲細(xì)胞的大范圍懸浮造就消費有關(guān)活性代謝產(chǎn)物將具有遼闊的遠(yuǎn)景?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1管淑玉，蘇薇薇.杜仲化學(xué)身分與藥理研究希望J.中藥材，2022，26(2):124.2程光麗.杜仲有用身分闡發(fā)及藥理學(xué)研究希望J.中成藥，2022，28(5):723.3

10、國度藥典委員會.中國藥典，部S.北京:化學(xué)產(chǎn)業(yè)出書社，2022:114.4劉圣金，狄留慶，吳德康，等.高效液相色譜法測定杜仲中綠原酸的含量J.中國中醫(yī)藥信息雜志，2022，13(1):44.5石少瀾，王祝舉，邵愛娟，等.高效液相色譜法測定杜仲皮中綠原酸的含量J.中國中藥雜志，2022，30(9):715.6邱曉芳，朱篤，張志斌，等.杜仲愈傷構(gòu)造繼代造就基按捺褐化的研究J.食品科學(xué)，2022，28(8):307.7邱曉芳，朱篤，張志斌，等.杜仲疏松愈傷構(gòu)造誘導(dǎo)條件的優(yōu)化挑選J.食品科學(xué)，2022，27(11):375.8劉輝琳，唐明林，安蓮英，等.杜仲藥用有用身分提取要領(lǐng)研究J.天然產(chǎn)物研究與開拓，2002，12(6):47.9尉芹，景謙平，馬希漢.杜仲葉中綠原酸的提取工