03滅菌工藝驗證用生物指示劑的質(zhì)量控制-蘇州 王似錦

1、滅菌工藝用生物 示劑的質(zhì)量控王似中國食品藥 檢定研2019-04目錄1 生物指示劑概述2 生物指示劑耐受性檢查法3研究進展4 常見問題生物指示劑概述生物指示劑（Biological Indicator）-定義：生物指示劑被廣泛定義為一種對特定的滅菌程序有確定和穩(wěn)定的耐受性的特殊微生物制成品。-主要參數(shù)：菌種的鑒定，孢子數(shù)，D值，存活時間和殺滅時間，純度，Z值-用途：對滅菌工藝進 設(shè)定、確認和監(jiān)測。生物指示劑概述 歷史與起源1、生物指示劑出現(xiàn)之前 1804 ，法國人Nicolas Appert為因應(yīng)普法戰(zhàn)爭法國軍艦須在高溫長時間海上運 之需要，發(fā)明以廣口瓶裝食物，以軟木塞輕塞瓶口，煮沸3060分

2、鐘后，塞緊瓶口以達貯藏目的。經(jīng)試驗結(jié)果，達到預(yù)期的效果，于1810年獲法國拿破侖皇帝頒獎金一萬二千法朗。 18401870年 沸水浴制作罐頭逐漸成熟。（關(guān)鍵工藝參數(shù)：溫度和時間） 19世紀60年代，法國微生物學(xué)家路易斯巴斯德發(fā)明了低溫消毒法-巴氏消毒法。 1880年，在巴斯德實驗 工作的Charles Chamberland將原有的一種蒸煮鍋改造成為一種高壓滅菌鍋（au oclave）生物指示劑概述2、早期的生物指示劑 與加工罐頭食品的情況不同，早期的實驗室工作人員需要滅菌的器具，但 這種器具本身無法支持微生物生長，因此，他們需要一種能夠證明滅菌效果的東西-生物指示劑。 1880年前后，少量的

3、土壤（約5g）被用作醫(yī)療器具的滅菌。 1881年，Ko 和Wolffhugel使用含芽胞的濾紙、玻璃片、絲線等用作醫(yī)療器具的滅菌。 1897年，Kilmer使用 混合培養(yǎng)物的紗布填料做滅菌挑戰(zhàn)試驗。后人認為，這是生物指示劑的用于商業(yè)滅菌產(chǎn)品的滅菌驗證并放行的第一例。生物指示劑概述3、1920年1950年 在這一時期，隨著細菌學(xué)的發(fā)展，當今我們使用的生物指示劑的許多基礎(chǔ)性工作都已經(jīng)開展了。將細菌芽胞接種于紙載體或瓶中，并進行濕熱 菌，在精準控制蒸汽溫度和時間的前提下，根據(jù)其致死曲線來研究蒸汽滅菌原理。生物指示劑概述4、1950年至今 細菌學(xué)逐漸發(fā)展成為微生物學(xué)。隨著生物學(xué)逐漸從細胞形態(tài)向分子水平

4、， 子顯微鏡技術(shù)的發(fā)展，細菌的耐熱和滅活機理研究更加深入。 工業(yè)控制水平和計算機的發(fā)展，科學(xué)家和工程師發(fā)明了抗力檢測儀（BIER），從而能夠更精密的測定生物指示劑的質(zhì)量參數(shù)D值、Z值。 在微生物滅菌與控制領(lǐng)域，許多化學(xué)和物理的檢測技術(shù)愈加成熟和精準，但是，用生物指示劑來做滅菌驗證和監(jiān)控仍然不可取代。生物指示劑概述 自含式 紙片 芽胞懸液 生物指示劑概述生物指示劑的組成部分：1. 載 ：紙片、金屬、液體、棉線2. 微生物：一般為細菌的芽胞3. 包裝：防止污染，滅菌劑能夠穿透4. 培養(yǎng)基體系：能夠使受傷的芽孢萌發(fā)生長，易于觀察無菌藥品滅菌/無菌工藝驗證FPhysicalFBiological生物學(xué)

5、 認物理確認FPhysicalFBiological生物指示劑溫 、壓力F F ,SAL10-6sicalbiol gi alion o ist eat sterilization p oce e : cyclePDA Techonical Report2007. V ldesign,development,qualification and ongoing cont ol. 化學(xué)藥品滅菌/無菌工藝驗證指導(dǎo)原則 14征求意見稿生物指示劑概述中國藥典中的生物指示劑： 中國藥典20002010年版二部-附錄 滅菌法-生物指示劑 中國 典2015年版四部通則1421 滅菌法-生物指示劑典版本關(guān)于生物

6、指示劑的相關(guān)內(nèi)容定義，常用生物指示劑舉例2000年版二部 增訂2005年版二部 修訂2010年版二部 修訂基本要求、制備 明確D值定義）、應(yīng)用、常用生物指示劑舉例制備“應(yīng)測定D值和孢子總數(shù)”應(yīng)用“在生物指示劑驗證試驗中，需確定孢子在實際滅菌條件下的D值，并測定孢子的純度量”2015年版四部 通則基本無變化20209207 滅菌用生物指示劑指導(dǎo)原則9208 生物指示劑耐檢查法指導(dǎo)原則生物指示劑概述 中國藥典2015年版四部通則1421 滅菌法-生物指示劑生物指示劑概述制藥行業(yè)的需求：內(nèi)部：質(zhì)量管理意識的逐漸提高、新藥審批、工藝驗證、出口外部：各種GMP檢查與工藝核查中國藥典：1.關(guān)于生物指示劑的

7、通用性要求不完善2.缺乏生物指示劑相關(guān)參數(shù)的檢查法生物指示劑概述 中國食品藥品檢定研究院學(xué)科帶頭人培養(yǎng)基金2011X2 藥品質(zhì)量控制相關(guān)生物指示劑的研制及標準化研究123 中國藥典2015年版附錄科研課題-滅菌生物指示劑研究（2014年） 生物指示劑耐受性檢查法指導(dǎo)原則（藥典會網(wǎng)站第三次公示） 滅菌用 物指示劑指導(dǎo)原則（藥典會網(wǎng)站第三次公示） 芽胞計數(shù)的方法研究 矩形滅菌曲線的實現(xiàn)：抗力儀法與油浴儀法 生物指示劑耐受 檢查法的應(yīng)用陰性分數(shù)法和殘存曲線法生物指示劑概述芽胞（endospore,spore） 某些細菌在其生長發(fā)育的后期，可在 胞內(nèi)形成一個圓形或橢圓形的抗逆性休眠體，稱為芽胞（end

8、ospore, spo ）,該過程成為芽胞形成過程（sporulation）。1. 芽孢桿菌屬（Bacillus2. 梭菌屬（Clostridium）引自BROCK微生物生物學(xué)生物指示劑概述通過遺傳研究和顯微鏡分析方法確定的芽胞形成過程引自BROCK微生物生物學(xué)生物指示劑概述芽胞衣皮層孢外壁核壁巨大芽胞桿菌枯草芽胞桿菌吡啶二羧酸（DPA）芽胞結(jié)構(gòu)引自BROCK微生物生物學(xué)特征結(jié)構(gòu)營養(yǎng)體芽孢大部分革蘭氏陽性菌，少數(shù)革蘭氏陰性菌厚的芽胞皮層、芽孢衣、孢外壁顯微鏡外觀鈣無折光性折光性低高吡啶二羧酸酶活性無有高低代 （O2攝?。┐蠓肿雍细叩突驘o有無mRNA有少或無抗熱性低高高抗化學(xué)物質(zhì)或酸類對染料可染

9、性溶菌酶作用水含量低可染需要特殊方法可染有抗性敏感高，80%90%無低，核內(nèi)10%25%有小酸性蛋白（ssp基因產(chǎn)物）細胞質(zhì)pH約pH7pH5.56.0（核心）引自BROCK微生物生物學(xué)生物指示劑概述芽胞 營養(yǎng)體：1. 激活（activation）高溫 熱（熱休克，heat shock）2. 萌發(fā)（germinat on）DPA和皮層組 失，SASP降解3. 生長(outgrowth)菌體吸水，RNA、蛋白DNA開始合成，芽胞膨脹，營養(yǎng)體從裂開的芽孢衣中生長，開始分裂。引自BROCK微生物生物學(xué)生物指示劑概述芽胞的革蘭氏染色營養(yǎng)瓊脂 培養(yǎng)三營養(yǎng)瓊脂 培養(yǎng)七天嗜熱脂肪地芽胞桿菌（Geob cil

10、lus stearothermophilus）ATCC7953生物指示劑概述芽胞的革蘭氏染色孢肉培養(yǎng)基 培養(yǎng)二十孢肉培養(yǎng)基 培養(yǎng)二十天生孢梭菌（ ostridiu sporogenes）CMCC（B）64941生物指示劑概述芽胞染色營養(yǎng)瓊脂 培養(yǎng)七天嗜熱脂肪地芽胞桿菌（Geobacillus stearothermophilus）ATCC7953生物指示劑概述芽胞染色孢肉 養(yǎng)基 培養(yǎng)二十天生孢梭菌（Clostridium sporogenes）CMCC（B）64941生物指示劑概述濕熱滅菌用生物指示劑常用菌種及其D值與Z值微生物ATCCD 121（min） Z value（）Bacillus

11、atrophaeus(原B.subtilis var. n ger)93720.20.579Bacill subtilis, subtilis(原B.subtilis CCC5230,Kerns 15U）3502135840.30.50.51.00.82.0790Clostridiumgenes PA3679B cillus smithii(原B. oagulans FRR B666)51232710Geobacillus stearothermophilus o paper strips in795379531.02.02.56.710710glassine envelopeGeobacil

12、lus stearothermophion hardw e or insolution生物指示劑概述中國藥典2015年版四部通則1421 滅菌法-生物指示劑通則9206 無菌檢查用隔離器驗證指導(dǎo)原則中國藥典 020年版征求意見稿9207滅菌用生物指示劑指導(dǎo)原則9208生 示劑耐受性檢查法指導(dǎo)原則USP41 iological Indicators-R sist nce Performance Tests 生物指示劑抗性檢查法Biologica ndicators for St rilization滅菌用生物指示劑Biological Indicato for Sterilization 滅菌用

13、生物指示劑 Sterility Testi Sterilization-Calidation of Isolator Systems 無菌檢查用隔離器的驗證ical and Physicochem al Indicators and Integrators滅菌用 學(xué)與物理化 指示劑Sterilization and Sterility Assurances f Compendial Articles藥典物料的滅菌與無菌保Terminally Sterilized Pharmacal Products-Parametr Release終端滅菌藥品的參數(shù) 行PDA TR.1 Validation

14、of Moist Heat Sterilization Processes: cle Design, DevelopmeControlEU Guideline on the sterilisation of medicinal produve substance, excip ent an prim ry c nt er生物指示劑概述USP39 Official Monographs(USP40、41版中已經(jīng)刪除):I.Biological Indicator for Dry-Heat Sterilization, Paper CarrierII. Bi logical Ind cator f

15、or Ethylene Oxide sterilization, Pa er CarrierIII. Biological Indicat for Moist Heat, Dry Heat, and Gaseous Modes of Sterilization, Liquid Sp reSuspensionsIV. Biological Indicators for Moist Heat, Dry Heat, and Gasious Modes of SteV. Biological Indicator for Steam Sterilization, Paper CarrierVI. Bio

16、logical Indicator for Steam Sterilization, lf-Contained生物指示劑概述 參考標準： USP39、USP40，USP41 ISO 472:2006 Sterilization of health care products Biological andchem cal indicators Test equipment GB/T 24628-2009 醫(yī)療保健產(chǎn)品滅菌 生物與化學(xué)指示物 測試設(shè)備 ISO 11138-(1 ):2006=GB 18281.1-2015Part 1: Sterilization of health care pr

17、oducts-Biological indicators- Generalrequirement,Part 25: Biological icators for ethylene oxide sterilization procemoist heat, dry heat, low-temperature steam and formaldehyde sterprocesses生物指示劑概述 生物指示劑的分類 生物指示劑用微生物的基本要求 生物指示劑的 備第一次征求意見：2018.8.23第二次征求意見：2019.1.23 生物指示劑的應(yīng)用2019.4.3第三次征求意見：生物指示劑概述 總芽孢計

18、數(shù)第一次征求意見：2018.8.232019.1.23 D值測定（陰性分數(shù)法和殘存曲線法） 存活時間和殺滅時間的確認第二次征求意見：第三次征求意見：2019.4.3生物指示劑概述USP385、紙質(zhì)載體蒸汽滅菌用生物指示劑紙 載體蒸汽滅菌用生物指示劑是一類含嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillus stearothermophilus）的對于蒸汽滅菌具有特殊耐受性的以適宜紙材料為載體的生物指示劑，它也需要獨立包裝于可被蒸汽穿透的外 裝材料中。紙載體上的活孢子總數(shù)應(yīng)在104-109范圍內(nèi)。存活及殺滅時間與孢子總數(shù)以及D值關(guān)系 別為：存活時間（mi ）標示D值(log每載體標示芽胞數(shù) - 2)殺滅時間（m

19、in）標示D值(log每載體標示芽胞數(shù)4) 包裝與儲存 效期耐受性檢查D值：80%120%存活時間和殺滅時間總芽胞計數(shù)：lg值-0.3+0.48（50%300%） 標簽 鑒別：菌種編號、鑒定方法 純度 廢棄生物指示劑概述某品牌生物指示劑說明書物指示 的耐受性 查法4總芽胞計數(shù)物指示 的耐受性 查法 存活時間（Survival time）：將生物指示劑暴露于滅菌條件下一定時間（盡可能長時間）后，所有生物指示劑培養(yǎng)顯陽性。 存活 間（min）D值(lgN0-2) 殺滅時間(Kill time)：將所有生物指示劑暴露于滅菌條件下一定時間（盡可能短時 ）后，所有生物指示劑培養(yǎng)顯陰性。 殺滅時間（min

20、）D值(lgN0+4)N0為每載體標示芽胞數(shù)物指示 的耐受性 查法生物指示劑的耐受性（抗性）用D值來表示D值：使微生物數(shù)量下降一個對數(shù)單位（下降90%）所用的滅菌時間（分鐘）。直線的斜率KN N1K tan 2U U213 510 612 1D 2 minK物指示 的耐受性 查法SMC法陰性分數(shù)法Fraction negativemethodLSKP法D值殘存曲線法定義Survivor curvemethod劑的耐 性檢查 陰性分 N0=5.5105CFU，D121=1.5。121暴熱：時間0對數(shù)值1.534 43.742.741.740.74-0.26-1.26-2.26陽性區(qū)4.56陰陽并

21、存區(qū)7.59陰陽并存區(qū)10.512陽性區(qū)陰性區(qū)劑的耐 性檢查 殘存曲生物指示劑熱處理0246810（min孢子計數(shù)5.010611066.64.01053.2101.61031.3102取對數(shù)6.75.64.53.22.1以熱處理時間為橫坐標，孢子數(shù)的對數(shù)值為縱坐標，擬合直線，取斜率的負倒數(shù)為該生物指示劑的D值示劑的 受性檢 -抗力 抗力儀 （Resistometer）：設(shè)計用于在滅菌過程產(chǎn)生物理和/或化學(xué)變量組合的測試設(shè)備。(ISO 18472：2006 ；GB/T 24628-2009)4/25/2019示劑的 受性檢 -抗力濕熱滅菌用生物指示劑抗力儀重力式抗力儀Fedegari Resi

22、stometer小型滅菌艙式抗力儀Steris Resistometer示劑的 受性檢 -抗力小型滅菌艙式： 壓力蒸汽滅菌生物指示劑抗力檢測儀示劑的 受性檢 -抗力抗力儀參數(shù)關(guān)鍵點：1.試驗艙的密閉性2.蒸汽源的壓力穩(wěn)定性3.夾套的溫度控制2.升溫夾套樣品7.通入潔凈空氣4.通入蒸汽蒸汽源1.預(yù)熱升溫試驗艙4.試驗艙內(nèi)溫度和壓力的控制4.1 抽真空閥門的控制4.2 通入蒸汽閥門的控制4.3 排氣閥門的控制5.溫度壓力傳感器的靈敏度35排氣6抽真空抽真空6.電腦控制系統(tǒng)STERIS Biological Indicator-Evaluator Resistometer4/25/2019示劑的 受

23、性檢 -油浴 油浴法：含芽胞懸液兩端密閉的玻璃毛細管浸泡于恒溫油浴中，由于毛細管壁較薄，且容積微量（50l），因此能夠保證芽胞懸液瞬間升溫， 維持穩(wěn)定的高溫，待熱處理結(jié)束后，將毛細管置于冰水浴內(nèi)，使芽胞懸液瞬間降至低溫，再對毛細管內(nèi)芽胞懸液進行稀釋、培養(yǎng)計數(shù)，通過殘存曲線法，測定其D值。示劑的 受性檢 -油浴 油浴法：玻璃毛細管與油浴儀實現(xiàn)“矩形”滅菌曲線。1243示劑的 受性檢 -油浴油浴法的優(yōu)點： 不使用抗力儀（壓力容器），實驗室使用的安全性更高。 對于芽胞懸液形式的樣本，熱處理時間和溫度能夠精確控制，比抗力儀操作更方 。 后續(xù)芽胞計數(shù)試驗無需特殊儀器與設(shè)備，一般微生物實驗室均能夠具備實驗

24、條件。但是，使用油浴法 要注意的是： 玻璃毛細管的制備與熔封對操作者要求較高，需要反復(fù)練習(xí)，才能夠制備體積準確、熔封完全的毛細管。 毛細管的渦旋打碎有一 難度，需要一定技巧。建議加入若干無菌玻璃珠劇烈振搖。 每個樣品熱處理均需要進行微生物計數(shù)，因此，與陰性分數(shù)法的滅菌后培養(yǎng)觀察相比,油浴法的工作量較大。研究進展殘存曲線法測試點的取舍Equationdj. R-SquareEq uationAd j. R -Sq uarey = a + b *x0.98617y = a + b*xValue6.71986-0.7687Stand ard Error0.04196原包裝0.839M eanM ea

25、nIn ercep tSlop e654320.02811VeStandard Error0.01917MeanMeanInterceptSlope7.117530.33403D=3.0紙片7654320.00801012345文獻EquationAdj. R-Squara + b*0.98917alue94379-0.5240Standard rroMeanMeanInterceptSlope0.060280.01499D= 90268104（ISO11 38-1:2006）研究進展EquationAdj. R-Squarey = a + b*x0.986176Value6.71986-0.

26、7687Standard Error0.04196M eanM eanInterceptSlope0.028 1D=1.342012345Tim e抗力儀-自含式生物指示劑（取出紙片）在121下的殘存曲線4/25/2019研究進展D值的測定油浴法-ATCC7953芽胞懸液在121下的殘存曲線研究進展Z值的測定油浴法- TCC795 芽胞懸液的耐熱性曲線研究進展D值的測定油浴法-CMCC(B)64941芽胞懸液在95、100和105下的殘存曲線研究進展Z值的測定油浴法 CMCC(B) 4941芽胞懸液的耐熱性曲線研究進展兩種芽胞懸液的D值和Z值測定T/All p ints are include

27、d0 min point is not includedSlope-0.086-0.276-0.714/D11.633.621.40/R2SlopeDR2117121125Z0.82080.89150.6711/-0.1427.040.9982GeobacillusstearothermophilusATCC7953-0.4592.180.9888-1.530.650.9947-0.129Z=7.750.999995-0.088-0.351-2.206-0.14011.362.850.45Z=7 140.99680.99260.99090.9864/Clostridiumsporogenes

28、CMCC（B）64941100105Z研究進展抗力儀-兩種測定D值方法的比較試驗操作特 每次所需樣品數(shù)量/支標示D121/min測定值與標示值之比/%方法D121/min點試驗操作和結(jié)果判斷較為簡單陰性分數(shù)法-LHSKP法1602 220.101.7131實 操作較為復(fù)雜，殘存曲線法 個點均需要241.910.101.71.711278進行芽胞計數(shù)殘存曲線法（除去包裝）/1.33研究進展生孢梭菌芽胞懸液的D值與Z值測定（抗力儀和油浴儀）抗力儀油浴儀度/95斜率/D值/minR2斜率-0.08828-0.3506/D值/minR2/11.330.99680.9926/10-0.2931-0.70

29、20.81533.410.99940.99580.98092.85102.5105Z值420.36/-2.20570.450.9909Z=5.06，R2=0.9652Z=7.14，R2=0.9864研究進展 中檢院2017年8月通過CNAS認可 項目參數(shù)：生物指示劑 芽胞計數(shù) D值測定 存活時間和殺滅時間研究進展 合同服務(wù)-濕熱滅菌用生物指示劑的質(zhì)量研究1、芽胞數(shù)測定；2、D值測定；3、 時間/殺滅時間的確認4、所含菌種的鑒定：通 生理生化方法或分子生物學(xué)方法進行研究進展舉例： 某大體積注射液（500ml），通過前期研究表明，只能使用F0=8的滅菌工 如何選擇生物指示劑？ 如何證明無菌保障水平

30、（SAL）？ 微生物負載的限值？ 耐熱性的監(jiān)測策略？研究進展Validation of Moist Heat Sterilization Processes:CycleDesign, Development,Qualification and Ongoing Control PDA TR01研究進展 USP 41-1229.2 Moist heat sterilization of aqueous liquids研究進展歐盟醫(yī)療產(chǎn)品、原輔料和初級包裝的滅菌指導(dǎo)原則（替代原EMEA滅菌方法選擇決策樹1999年）研究進展常見問題 制藥企業(yè)日常使用的生物指示劑，應(yīng)該如何進行質(zhì)量控制？總體策略：根據(jù)自身技術(shù)能力，參考USP和ISO相關(guān)標準開展質(zhì)量控制1.定芽胞數(shù)：要求在標示值的50%300%。2 菌種的鑒定3. 驗證存活時間和殺滅時間4. 測定D值：參考標準在標示值的80%120% 滅菌工藝驗證和開發(fā)過程中使用的生物指示劑的質(zhì)量確認材料？根據(jù)國家藥品審評 心的要求，為了保證滅菌工藝驗證和開發(fā)資料完整性，建議應(yīng)參考USP、ISO等相關(guān)標準，提供完整的質(zhì)量評價報告（芽胞計數(shù)、D值測定、存活時間和殺滅時間、菌種的鑒定）。常見問題 Solution