藥監(jiān)系統(tǒng)官方培訓 王春仁-生物學評價

1、生物相容性評價的意義；GB/T16886.1解讀王春仁中國食品藥品檢定研究院生物學評價的歷史 1974年6月21日-30日在天津召開了醫(yī)用高分子材料制品與應用座談會，當時已經(jīng)采用高分子材料應用于氣管插管、輸血輸液袋、人工皮膚、避孕工具等醫(yī)療器械產(chǎn)品，并且開展了人工心臟、人工心臟瓣膜、人工血液、人工肛門、人工肌腱、人工角膜等產(chǎn)品的研究。生物學評價的歷史 1982年12月23日-26日在重慶召開了全國人工臟器和生物材料學術(shù)報告會，這次會議主要是對醫(yī)用高分子材料，特別是醫(yī)用硅橡膠材料和聚氨酯材料的研究和應用，并且采用浸提液進行了生物學試驗（急性毒性、皮內(nèi)刺激、致熱原）、溶血試驗、姐妹染色體互換試驗以

2、及血液相容性試驗，并且對硅橡膠材料采用美國醫(yī)藥局制定溶出物檢測方法對醫(yī)用硅橡膠材料進行檢測控制，檢測的指標有溶出物的透明性和外觀、pH、鉛，鉻，鋅，硫酸，磷酸，氨等離子含量、紫外吸光度、蒸發(fā)殘留物。生物學評價的歷史 1983年衛(wèi)生部藥品生物制品檢定所（現(xiàn)更名為中國食品藥品檢定研究院）按照國家科委和衛(wèi)生部的通知，承擔了全國醫(yī)用高分子材料、制品的標準制定和檢定，并負責組織與領(lǐng)導全國的專業(yè)科研工作，進行統(tǒng)一規(guī)劃和安排，并召集有關(guān)單位負責人和技術(shù)人員在北京召開了醫(yī)用高分子材料質(zhì)量標準和檢定專業(yè)座談會。生物學評價的歷史 1984年10月日本東京醫(yī)科齒科大學醫(yī)用器材研究所的今井庸二博士應衛(wèi)生部藥品生物制品

3、檢定所邀請，在所內(nèi)做了生物醫(yī)用材料（主要是高分子材料）生物相容性方面的學術(shù)報告，對高分子材料的溶出物試驗、溶血試驗、細胞培養(yǎng)試驗、致癌試驗等內(nèi)容進行了介紹生物學評價的歷史1983年在國家科委和衛(wèi)生部的醫(yī)用高分子材料、制品的標準制定和檢定課題以及醫(yī)用熱硫化硅橡膠質(zhì)量標準課題的支持下:有衛(wèi)生部藥品生物制品檢定所（學術(shù)帶頭人奚廷斐）;上海第二醫(yī)科大學生物材料研究室（學術(shù)帶頭人薛淼）;天津市醫(yī)藥科學研究所（學術(shù)帶頭人史弘道）;山東省醫(yī)療器械研究所（學術(shù)帶頭人王斌）;四川省勞動衛(wèi)生職業(yè)病研究所（學術(shù)帶頭人吳增樹）;組成的研究團隊參與下，對醫(yī)用生物材料的評價參照國際標準和美國藥典的醫(yī)用塑料生物學評價方法進

4、行了系統(tǒng)的研究，基本建立了我國生物材料的質(zhì)量和生物學評價方法體系。生物學評價的歷史（國外） 早在1976年美國國會立法授權(quán)食品藥品監(jiān)督管理局管理醫(yī)療器械實行售前審批制度。 隨后1979年美國國家標準局和口腔協(xié)會發(fā)布“口腔材料生物學評價標準”， 1980年英國標準局（BS）公布了牙科材料生物學評價的標準方法， 1982年美國材料試驗協(xié)會發(fā)布“生物材料和醫(yī)療器械的生物學評價項目選擇標準”， 1984年國際標準化組織（ISO）頒布“口腔材料生物學評價標準”，生物學評價的歷史（國外） 1986年美國、英國和加拿大的毒理學和生物學專家制定了“生物材料和醫(yī)療器械生物學評價指南”; 1987年美國藥典會發(fā)布

5、了“醫(yī)用塑料的生物學評價試驗方法（體外）”; 1988年又發(fā)布了“醫(yī)用塑料的生物學評價試驗方法（體內(nèi)）”; 1989年英國發(fā)布了“生物材料和醫(yī)療器械生物學評價標準”， 1990年西德發(fā)布了“生物材料生物學評價標準”; 1992年日本發(fā)布了“生物材料和醫(yī)療器械生物學評價指南”。生物學評價的歷史 國家標準化組織（ISO）在1989年制定了“生物材料和醫(yī)療器械生物學評價標準”，共17個ISO10993系列標準。我國也在1994年組團參加國際標準化組織并申請有觀察員國成為正式會員國，并在1997年開始將ISO10993醫(yī)療器械生物學評價系列標準轉(zhuǎn)化成我國的國家標準，既GB/T16886醫(yī)療器械生物學評

6、價系列標準，成為我國醫(yī)療器械生物學評價的基本標準，也是目前我國廣泛使用的生物材料和醫(yī)療器械生物學評價的標準體系。生物醫(yī)學材料評價的目的和意義 醫(yī)療器械的生物學評價屬于醫(yī)療器械風險管理的范疇。 生物學評價的目的在于：預測醫(yī)療器械與人體接觸中的潛在危害性，依據(jù)現(xiàn)有的科學技術(shù)能力和水平，盡可能多地提供醫(yī)療器械在人體應用時的安全性信息，將不安全的風險減少到最低程度。生物醫(yī)學材料評價的目的和意義 生物學評價具有以下幾個特征： 1）生物學評價是對生物材料或醫(yī)療器械的以往信息和現(xiàn)有信息的分析判斷，是綜合評價能力的應用，其中可以包含或不包含生物學試驗，獲得的是對該器械在未來應用時是否相對安全或者說其風險是否可

7、接受的結(jié)論； 2）生物學評價需要恰當而完善的選擇生物學試驗項目； 3）生物學試驗的質(zhì)量保證是取得良好生物學實驗數(shù)據(jù)的前提，也是獲得良好生物學評價的重要基礎(chǔ)； 4）生物學評價不僅僅只在醫(yī)療器械臨床應用前進行，還應貫穿于醫(yī)療器械的使用生命始終。 生物安全性評價保證 一般來講，實驗室的試驗結(jié)果都只對受試樣品負責。然而，人們更期望于實驗室動物試驗結(jié)果能對一個時期內(nèi)的器械/材料的生物安全性負責。這不僅要求實驗室的試驗方法可靠，還要求醫(yī)療器械制造商應建立良好的生產(chǎn)質(zhì)量體系，保證能持續(xù)提供質(zhì)量均一的器械/材料。生物學評價的原則 醫(yī)療器械的使用必然帶來某種程度的風險，而生物安全總是在保證器械的目標功能前提下才

8、具有意義。確定利用醫(yī)療器械來進行一項臨床治療或預防疾病的過程就要求剩余風險（residual risk，采取防護措施后余下的風險）和預期受益相平衡。這樣的判斷應考慮到醫(yī)療器械的預期使用（用途）、性能和風險，以及臨床過程或使用環(huán)境的風險和受益。生物學評價的原則1. 應由既掌握理論知識又具有經(jīng)驗的專業(yè)人員來策劃實施，評定各種候選材料的物理和化學特性、任何臨床使用或人體接觸數(shù)據(jù)、產(chǎn)品及其組成材料、裂解產(chǎn)物和代謝物的毒理學和其他生物安全性數(shù)據(jù)、試驗程序等，分析優(yōu)缺點和適宜性。生物學評價的原則2.在選擇制造器械所用材料時，應首先考慮材料特性對其用途的適宜性，包括化學、毒理學、物理學、電學、形態(tài)學和力學等

9、性能生物學評價的原則3.器械總體生物學評價應考慮以下方面：材料、添加劑、工藝污染物、殘留物、可瀝濾物質(zhì)、降解產(chǎn)物、其他組件及其在最終產(chǎn)品中的相互作用、最終產(chǎn)品的性能與特點、最終產(chǎn)品的物理特性等。生物學評價的原則4. 在選擇生物學評價所需的試驗和解釋相關(guān)數(shù)據(jù)時，應考慮材料的化學成分，包括接觸條件和器械及其組件與人體接觸的性質(zhì)、程度、頻次和時間，以便于根據(jù)器械的類別來選擇適宜的試驗。生物學評價的原則5. 對每種最終產(chǎn)品都應考慮包括材料在內(nèi)的所有潛在的生物學危害，但這并不意味著所有的潛在危害都必須要進行試驗，因為即使試驗結(jié)果為陰性也不能保證無生物學危害。因此，臨床前生物學評價后還要在器械臨床使用中對

10、非預期的人體不良反應或不良事件進行跟蹤觀察。生物學評價的原則6. 對每種最終產(chǎn)品都應考慮包括材料在內(nèi)的所有潛在的生物學危害，但這并不意味著所有的潛在危害都必須要進行試驗，因為即使試驗結(jié)果為陰性也不能保證無生物學危害。因此，臨床前生物學評價后還要在器械臨床使用中對非預期的人體不良反應或不良事件進行跟蹤觀察。生物學評價的原則7. 當出現(xiàn)以下（但不限于）情況時，材料或最終產(chǎn)品則需要重新進行生物學評價：a. 材料來源或技術(shù)規(guī)范改變時；b. 產(chǎn)品配方、工藝、初包裝或滅菌改變時；c. 使用說明書或要求改變時；d. 產(chǎn)品預期用途改變時；e. 有證據(jù)表明產(chǎn)品用于人體后出現(xiàn)不良反應時。生物學評價的原則8. 生物

11、學評價應結(jié)合制造器械所用材料成分的性質(zhì)及其變動情況、其他非臨床試驗、臨床研究以及上市后的使用情況等進行總體綜合評定。生物學評價的原則9. 生物學評價中采用的試驗方法應靈敏、精確并可靠。因此，要求實驗室應符合GLP或ISO/IEC17025的要求。10. 產(chǎn)品所用材料應保證持續(xù)可靠的生物安全性。醫(yī)療器械生產(chǎn)企業(yè)應能對其原材料供應商所提供材料的持續(xù)可靠性進行有效控制，應能針對各生產(chǎn)環(huán)節(jié)提供“器械的生物安全性持續(xù)得到有效控制”的保證。生物學評價的風險管理根據(jù)GB/T16886.1標準，應該在風險管理框架內(nèi)開展醫(yī)療器械的生物學評價。風險管理包括三部分內(nèi)容：評估醫(yī)療器械風險、識別潛在風險以及識別可用的信

12、息及降低風險。生物學評價的風險管理（1）評估醫(yī)療器械的風險風險評價應該適用于最終完成的醫(yī)療器械，所有被評價的對象都應該是處于“使用”狀態(tài)的醫(yī)療器械產(chǎn)品，即與臨床使用狀態(tài)保持一致（包括滅菌方式）的最終產(chǎn)品。風險評價可包括臨床前研究、臨床經(jīng)驗和生物學試驗生物學評價的風險管理 （2）識別醫(yī)療器械的潛在風險 潛在的生物學風險不僅應該包括化學毒性，還應該包括引起不可接受的生物反應的物理特性：包括表面性能、周圍組織的力學影響（如機械、熱以及電磁）、形貌以及顆粒物的存在等等。 生物相容性的潛在風險信息來源可包括：材料供應商提供的信息（材料或組分的化學配方和結(jié)構(gòu)及生產(chǎn)制造工藝）；器械在最終完成狀態(tài)的化學或表面

13、分析；文獻報道；批準上市后的臨床監(jiān)測信息。生物學評價的風險管理 （3）識別可用的信息及降低風險 為了減少不必要的試驗，尤其是動物試驗，在進行風險評價時應考慮所有可用的相關(guān)信息，如下： 1）文獻和其他公開信息：應關(guān)注所有可用的毒理學文獻和其他公開信息來確定用于制造其醫(yī)療器械的材料的毒理學風險。如果現(xiàn)有數(shù)據(jù)無法評估材料化合物的安全性，那么毒理學關(guān)注閾值（TTC）的概念可用于一些生物學終點評價考慮。當人體暴露劑量低于化學品的毒理學關(guān)注閾值時,該化學品對人體健康造成負面影響的可能性就很低。 通過文獻可能適合評估某些生物相容性終點，但豁免所有生物相容性試驗可能不合適。例如，利用全身毒性研究中的不良反應水

14、平（NOAEL）和最低觀察到的不良反應水平（LOAEL）數(shù)據(jù)可用于考慮豁免急性、亞慢性或慢性全身毒性試驗，但與遺傳毒性、局部反應、刺激或致敏、致癌或生殖毒性試驗無關(guān) 2）臨床經(jīng)驗：利用以往臨床經(jīng)驗的可用數(shù)據(jù)可能會提示是否需要進行更多的試驗，或者是否需要進行其他任何試驗，在某些特定情況下，臨床經(jīng)驗可能會識別某些確定的風險。 3）動物研究經(jīng)驗：醫(yī)療器械的體內(nèi)動物研究數(shù)據(jù)可以用于代替一些生物相容性試驗。如果動物研究數(shù)據(jù)（例如組織學，尸檢）提示不良生物學反應，則可能需要一些額外的生物相容性試驗。醫(yī)療器械風險的三個來源1、物理性能：物理和機械指標2、化學性能：化學表征指標3、生物性能：生物學評價指標生物

15、材料與機體相互作用示意圖生物生物理性質(zhì)變化大小、形狀、彈性、急性局部反應物 炎癥、壞死、排異機械相互作用運動、摩擦、沖擊物理化學作用慢性局部反應鈣化、潰瘍、炎癥急性全身反應過敏、溶血、發(fā)熱、神經(jīng)麻痹、毒性反應體方面的強度、硬度、 材蠕變、磨損、熱傳導等；化學性質(zhì)變料的變化溶出、滲透、降解產(chǎn)物慢性全身反應致畸、致突變、致化結(jié)構(gòu)、降解、親水、疏水、吸附等；變 癌、免疫反應生物化學作用水、酶、蛋白質(zhì)、氧化、生物電化生物穩(wěn)定性生物相容性生物材料引起生物反應的因素1、材料表面的特性(見下圖: 接觸角)2、材料的添加劑、粘合劑、交聯(lián)劑3、材料的熱效應4、材料的降解產(chǎn)物5、材料和體內(nèi)物質(zhì)的反應產(chǎn)物6、物理和

16、機械作用7、機械故障8、其他因素醫(yī)療器械生物學評價生物反應風險：局部反應和全身反應1、組織反應；2、血液反應；3、免疫反應；4、全身反應。生物反應1、組織反應 （1）炎癥（2）腫瘤影響因素: 表面狀態(tài), 可濾出的物質(zhì)/降解物質(zhì), 污染生物反應2、血液反應：血栓形成影響因素: 表面、血流速度、血液粘度生物反應3、免疫反應： 1）I型：速發(fā)型超敏反應 2）II型：細胞毒性超敏反應； 3）III型：免疫復合物型超敏反應 4）IV型：遲發(fā)型超敏反應生物反應4、全身反應：（1）呼吸系統(tǒng)：（2）神經(jīng)系統(tǒng)：（3）消化系統(tǒng)：（4）骨骼運動系統(tǒng)：（5）心血管系統(tǒng)：（6）其他人體組織的影響：生物學試驗的選擇依據(jù)最

17、新的IS0 10993.1-2018醫(yī)療器械生物學評價第1部分：風險管理過程總的評價與試驗，醫(yī)療器械生物學評價試驗項目選擇應包括：1）物理或/和化學信息以及一系列的生物學試驗，2）生物學試驗內(nèi)容包括：細胞毒性試驗、致敏試驗、刺激或皮內(nèi)反應試驗、材料介導的熱原試驗、急性全身毒性試驗、亞急性全身毒性試驗、亞慢性全身毒性試驗、慢性全身毒性試驗、植入試驗、血液相容性試驗、遺傳毒性試驗、致癌性試驗、生殖與發(fā)育毒性試驗、降解試驗、生物毒代動力學研究和免疫毒性試驗。醫(yī)療器械生物學評價試驗方法的選擇:1、接觸時間2、使用部位和用途試驗選擇的依據(jù)1、非接觸人體器械2、 接觸或進入人體器械1）按使用時限分為：暫時

18、使用（24h以內(nèi)）；短期使用（24h到30天）；長期使用（超過30天）。2）接觸人體的部位分為：A、表面接觸器械：皮膚、黏膜。B、外部接入器械： 血管、組織/骨/牙本質(zhì)、血液循環(huán)系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)。C、體內(nèi)植入醫(yī)療器械：骨、組織和血液接觸。（2）生物學終點的選擇一般來說，當需要為生物學試驗選擇合適的終點時，應考慮材料或器械的化學特性（例如成分、組分相互作用）、物理特性（例如，表面形貌，幾何形狀）、目標人群和/或與人體接觸的性質(zhì)、部位、程度、頻率和持續(xù)時間，生產(chǎn)加工過程和存儲條件等，并非每個生物相容性終點都需要測試。2）生物學試驗終點的選擇表中所列出的生物相容性終點可能還不足以證明某些材料或器械

19、（例如，包括亞微米或納米材料或器械）的安全性，而且有些生物相容性終點如神經(jīng)毒性和免疫毒性還應特別考慮預期臨床植入部位。 生物相容性試驗的國家標準發(fā)布或修改年份標準號標準名稱采標情況10993-110993-210993-310993-410993-510993-610993-710993-9風險管理過程中的評價和試驗動物福利要求20112011200320021999199720021999GB/T 16886.1-2011（采用2009版）GB/T 16886.2-2011（采用2006版）GB/T 16886.3-2008（采用1992版）GB/T 16886.4-2003（采用2002版

20、）GB/T 16886.5-2003（采用1999版）GB/T 16886.6-1997（采用1994版）GB/T 16886.7-2001（采用1995版）GB/T 16886.9-2001（采用1999版）遺傳毒性、致癌性和生殖毒性試驗和血液相互作用試驗選擇（DIS）細胞毒性試驗：體外法植入后局部反應試驗環(huán)氧乙烷滅菌殘留量潛在降解產(chǎn)物的定性和定量框架10993-1010993-11刺激和遲發(fā)型超敏試驗（DIS）20022011GB/T 16886.10-2005（采用2002版）GB/T 16886.11-2011（采用2006版）全身毒性試驗生物相容性試驗的國家標準10993-12109

21、93-1310993-1410993-1510993-1610993-1710993-1810993-1910993-2010993-21樣品制備與參照材料2002199820012000199720022005200620062000GB/T 16886.12-2005（采用1996版）GB/T 16886.13-2001（采用1998版）GB/T 16886.14-2003（采用2000版）GB/T 16886.15-2003（采用2000版）GB/T 16886.16-2003（采用1997版）GB/T 16886.17-2005（采用2002版）聚合物降解產(chǎn)物的定性與定量陶瓷制品降解產(chǎn)

22、物的定性和定量涂層和未涂層金屬和合金降解產(chǎn)物的定性與定量降解產(chǎn)物和可瀝濾物毒性動力學研究設(shè)計可瀝濾物允許限量的建立材料化學特性材料理化、形態(tài)學與拓補學特性醫(yī)療器械免疫毒理學試驗原則與方法醫(yī)療器械生物學評價標準編寫指南（CD） 生物相容性試驗評價流程作為風險管理組成部分的醫(yī)療器械生物學評價的系統(tǒng)方法框圖生物學評價中需要考慮的問題 （1）應采用最終產(chǎn)品或代表性樣品。如果最終產(chǎn)品不能作為測試樣品，應制作測試樣品。如果測試樣品和終產(chǎn)品有差異，應進行附加試驗證明測試樣品的合理性：例如測試樣品的可萃取物的成分和量應基本相同，也可以采用極限萃取和表面表征的方法。（2）原位聚合和生物降解材料測試樣品建議采用代

23、表性的終產(chǎn)物，毒性試驗采用終產(chǎn)物以及聚合或降解不同時間點如開始、中間和最終的降解產(chǎn)物。體內(nèi)試驗觀察點根據(jù)聚合和降解動力學，應觀察到聚合物消失或生物學反應趨于穩(wěn)定。（3） 機械性問題引起的生物學反應對于涂層或多種材料部件的器械，有潛在機械性損傷引起的生物學反應，例如涂層的脫落。（4）亞微米或納米成分ISO 10993對于這類材料有一定的局限性。生物學評價需要考慮：測試樣品的表征；浸提條件的選擇；確保樣品能代表臨床適用情況。試驗選擇：在參照文獻中驗證的試驗應盡量采用標準的生物學試驗；確保亞微米成分不會干擾試驗；考慮附加試驗：吸收、分布、蓄積，以及代謝和清除。（5）樣品的浸提采用ISO 10993-

24、12規(guī)定的方法：首選表面積和浸提介質(zhì)的比例的方法，如果無法計算表面積時采用重量的方法。采用極性和非極性浸提介質(zhì)。浸提條件：溫度和時間浸提液狀態(tài)：顏色，有無顆粒等浸提液是否處理：過濾、離心等浸提液的儲存：應盡快使用。（6）多部件或材料器械多部件器械并且接觸時間不同：應對每個部件單獨進行浸提并進行試驗。多材料制備器械并且接觸面積或接觸部位不同，應對新材料單獨進行浸提試驗。例如球囊導管中的球囊采用新材料，應對球囊和球囊導管分別浸提進行試驗。 （7）在進行生物學評價試驗時一般是先進行體外試驗，后進行動物試驗。如果體外試驗都通不過，就不必做動物試驗。 根據(jù)我們多年的經(jīng)驗，一般是先進行溶血試驗和細胞毒性試

25、驗。 （8）進行生物學試驗必須要在認可的專業(yè)實驗室并由經(jīng)過培訓且具有實踐經(jīng)驗的專業(yè)人員進行。在對最終產(chǎn)品作出評價結(jié)論時，也應考慮到產(chǎn)品的具體用途及有關(guān)文獻。 （9）當最終產(chǎn)品投放上市后，如果制造產(chǎn)品的材料來源或技術(shù)條件發(fā)生變化；產(chǎn)品的配方、工藝、滅菌條件改變；儲存期內(nèi)產(chǎn)品發(fā)生變化；產(chǎn)品用途發(fā)生變化；有情況表明產(chǎn)品用于人體時會產(chǎn)生副作用時，要對產(chǎn)品重新進行生物學評價。生物學試驗 （1）來源于藥物毒理學的試驗方法 a) 致敏試驗：用材料或其浸提液做試驗，評價生物材料和醫(yī)療器械的潛在過敏原。常用的方法有使用豚鼠最大劑量法；和局部淋巴結(jié)試驗。 無致敏判定標準：陽性對照至少6個月進行一次。 *對照組記分

26、小于1，實驗組記分大于等于1，提示致敏； *對照組記分大于等于1，試驗組的反應超過對照組最嚴重的反應，提示致敏； 局部淋巴結(jié)試驗： 適用于金屬材料（鎳和含鎳金屬除外） 適用于液體樣品。 不適用于新型材料、接觸深部組織或創(chuàng)傷表面。 目前只有LLNA放射標記方法是認可的。 b) 刺激試驗：用材料或其浸提液做試驗，評價生物材料和醫(yī)療器械的潛在刺激原。根據(jù)生物材料和醫(yī)療器械的具體使用部位，可選擇進行皮膚刺激試驗、皮內(nèi)刺激試驗等。常使用兔子做試驗。 無刺激判定標準：皮膚和皮內(nèi)刺激指數(shù)不超過0,4。c) 熱原試驗：直接或間接接觸心血管系統(tǒng)、淋巴系統(tǒng)、腦脊髓液、標示無熱原。兔法：檢測材料或其浸提液中是否有致

27、熱原物質(zhì)。將材料或其浸提液由靜脈注入兔體內(nèi)（10ml/Kg），在一定時間內(nèi)觀察兔體溫變化，以判斷在材料或浸提液中所含熱原量是否符合人體應用要求。 細菌內(nèi)毒素檢查法，是應用試樣與細菌內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應的機理，以判斷材料或其浸提液中細菌內(nèi)毒素的限量是否符合標準要求。 建議只要標示無熱原：熱原兔法和內(nèi)毒素法都做。 d) 遺傳毒性試驗：用哺乳動物或非哺乳動物細胞培養(yǎng)技術(shù)，測定生物材料和醫(yī)療器械或其浸提液引起的基因突變，染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)量變化，或其他遺傳毒性。為了預防出現(xiàn)假陽性或假陰性，一般要求同時進行Ames試驗、小鼠淋巴瘤基因突變試驗(微核試驗)和染色體畸變試驗三組試驗。微核試驗染色體畸變試驗 e)

28、致癌試驗：由單一途徑或多種途徑，在試驗動物整個壽命期（例如大鼠為2年），測定生物材料和醫(yī)療器械的潛在致癌作用。通常和慢性毒性實驗合并進行。 f) 生殖和發(fā)育毒性試驗：評價生物材料和醫(yī)療器械或其浸提液對生育、生殖功能、胎兒和早期發(fā)育的潛在有害作用。試驗包括一般生殖毒性試驗，致畸胎試驗和圍產(chǎn)期毒性試驗。（2）在方法學上類似藥物毒理學試驗的方法。 a) 全身急性毒性試驗：用材料或其浸提液，通過單一或多種途徑由動物模型做試驗，評價其急性有害作用。常對生理鹽水浸提液進行小鼠尾靜脈注射，對植物油浸提液進行小鼠腹腔注射。在注射后24、48和72小時觀察小鼠的體重變化，運動和呼吸狀態(tài)，以及死亡情況。 判定標準

29、：不應觀察到毒性反應，體重增加和對照比無明顯差異急性毒性試驗方法觀察指標程 度無癥狀未見毒性癥狀輕輕度癥狀但無運動減少，呼吸困難或腹部刺激癥狀。中重腹部刺激癥狀，呼吸困難，運動減少，眼瞼下垂，腹瀉體重通常下降至15g17g之間.衰竭，發(fā)紺，震顫，嚴重腹部刺激癥狀，眼瞼下垂，呼吸困難，體重下降至小于15g。死 亡 注射后死亡 b) 全身亞急性毒性試驗（14，28天）。 c）全身亞慢性毒性試驗（90天）。 d) 全身慢性毒性試驗（半年）。 通過多種途徑（靜脈、腹腔、皮下） ，測定生物材料和醫(yī)療器械的有害作用。 結(jié)果：統(tǒng)計分析（下圖：纖維素引起肝脾損傷）（3）醫(yī)療器械特殊的試驗方法 a) 細胞毒性試

30、驗：通過細胞培養(yǎng)技術(shù)，測定生物材料和醫(yī)療器械或浸提液（37度，24h)對細胞毒性作用。常用瓊脂擴散方法、濾過擴散方法、MTT法、克隆形成試驗。 一般體內(nèi)材料可接受的細胞毒性應不大于2級。細胞毒性試驗 b) 植入試驗：將生物材料和醫(yī)療器械和陰性對照植入動物的合適部位（例皮下、肌肉或骨）在觀察一定時期后（例短期為7、15、30、60、90天后，長期為180、360天后）評價對活體組織的局部毒性作用。主要是通過病理切片，觀察組織的變化。 結(jié)果判斷標準： 1) 材料周圍局部組織的炎癥反應和纖維包囊程度應不嚴重于陰性對照材料。 2) 包囊或反應區(qū)記分之差應不超過1.0。 3) 顯微記分：之差不超過2.9

31、。 c) 血液相容性試驗：通過生物材料和醫(yī)療器械與血液相接觸（體外、半體內(nèi)或體內(nèi)），評價其對血栓形成、血漿蛋白、血液有形成分和補體系統(tǒng)的作用。 其中溶血試驗是最常用的粗篩試驗。溶血率應不超過5%。溶血試驗 d) 降解試驗: 在體內(nèi)降解的生物材料和醫(yī)療器械（例如可吸收性縫合線、可吸收性腎固定材料等）必須進行體內(nèi)降解試驗、以評價其在體內(nèi)的吸收代謝過程、分布、生物轉(zhuǎn)化、降解產(chǎn)物以及其有害作用。常用同位素標記方法。降解材料體內(nèi)植入血液相互作用試驗的選擇 1、和循環(huán)血液接觸的醫(yī)療器械與血液相互作用試驗初步確定了指南，將試驗體系分成5類（凝血、血小板、血液學、補體系統(tǒng)），不同的醫(yī)療器械選擇不同的試驗體系。

32、3、血液相容試驗的基本要求 （1）應采用陰性和陽性對照。 （2）體內(nèi)植入器械盡量進行動物模型體內(nèi)試驗； （3）體外或與體內(nèi)相連的器械可進行離體試驗（體外、半體內(nèi)） （4）試驗所用設(shè)備應確保不會對試驗發(fā)生干擾，試驗中盡量不采用抗凝劑。4、常用的血液相容性試驗方法 1、溶血試驗 2、血漿復鈣試驗、PT、PTT、TT 3、血液成分指標試驗（WBC，RBC，HCT，HGB，PLT）： 4、補體活化試驗。 5、血栓形成試驗 6、血小板黏附、聚集和釋放試驗血栓形成試驗血栓形成試驗生物降解和生物穩(wěn)定性1、非吸收性材料：降解生物穩(wěn)定性。2、生物可吸收材料：體內(nèi)外降解性能研究。（1）高分子材料降解的因素 體液引

33、起水解導致聚合物鏈斷裂、交聯(lián)或相變，導致材料性能改變； 體內(nèi)自由基引起氧化降解，導致聚合物鏈斷裂或交聯(lián); 各種酶形成的催化降解，導致材料結(jié)構(gòu)和性能改變; 另外，材料的形態(tài)等物理因素也會影響在體內(nèi)的降解。（2）研究聚合物降解的試驗方法（a） 體外水解試驗：可采用模擬體液，人工唾液、人工血漿等溶液在371下進行，時間可持續(xù)1、3、6或12個月。若進 行 加 速 降 解 試 驗 時 ， 溫 度 一 般 為701，時間為2天和60天。.（b）體外氧化試驗：一般采用3%過氧化氫水溶液，由于含氧化劑溶液隨著溫度升高和時間延長，其氧化劑濃度也隨之變化，因此要求定期（一般為一周）更換含氧化劑溶液。. 體外酶解

34、試驗：常用胃蛋白酶，溶菌酶、尿素酶、糜蛋白酶、組織蛋白酶、胰蛋白酶、膠原蛋白酶等酶的溶液在37下進行體外酶解試驗。. 在試驗中或試驗結(jié)束后應對材料的理化性能分析，并且對降解后的產(chǎn)物進行定量和定性分析。降解試驗降解試驗降解試驗3、陶瓷降解 雖然許多陶瓷結(jié)構(gòu)在空氣中是很穩(wěn)定的，但在水中還是會緩慢發(fā)生降解。陶瓷降解速率與其化學成分和顯微結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。其中孔隙率對陶瓷降解有顯著影響?；瘜W降解、物理降解、細胞介導4、金屬材料的降解 臨床上常用的金屬和合金有鈦及鈦合金、鈷基合金和不銹鋼。金屬材料在體內(nèi)降解主要是腐蝕問題，常用電化學試驗進行研究。腐蝕： 點蝕、晶間腐蝕、應力腐蝕。 醫(yī)療器械的免疫原性檢測醫(yī)療

35、器械免疫原性檢測目標免疫原性檢測目標免疫原性即指抗原能刺激特定的免疫細胞，使免疫細胞活化、增殖、分化，最終產(chǎn)生免疫效應物質(zhì)抗體和致敏淋巴細胞的特性。免疫原性檢測目標也就是發(fā)現(xiàn)并評價抗原刺激機體后，機體免疫系統(tǒng)形成抗體或致敏T淋巴細胞的特異性免疫反應。是免疫毒理學評價的重要組成部分。94醫(yī)療器械相關(guān)抗原的來源和分類異種抗原(xenogenic)動物來源的膠原; 心臟瓣膜/血管/帶瓣管道/補片等.123同種異體抗原(allogenic)同種異體脫細胞骨、同種異體脫細胞皮膚等異嗜性抗原(heterophilic)乳膠產(chǎn)品中的植物蛋白、金屬植入物釋放的金屬離子作為半抗原95動物源性醫(yī)療器械 注射型整形

36、產(chǎn)品 膠原止血海綿膠原類 組織工程支架 心臟瓣膜、血管、補片、帶瓣經(jīng)處理管道后的組織 脫鈣骨（含BMP等生長因子）96膠原類產(chǎn)品醫(yī)用生物膜注射型膠原蛋白植入劑膠原蛋白海綿膠原蛋白海綿97主要成分：I型和少量III型膠原組織來源：豬、牛皮膚、肌腱、骨免疫原性：純膠原公認較低主要與非螺旋區(qū)的端肽有關(guān)；酶切去除端肽或戊二醛交聯(lián)可使膠原免疫原性降低。98雜蛋白的種類及含量影響免疫原性 內(nèi)源性：伴隨I型膠原的III型膠原、彈性蛋白等； 外源性：微生物污染、蛋白酶等。99經(jīng)處理的結(jié)締組織 心臟瓣膜、帶瓣管道、血管、角膜、補片等： 組織來源：牛或豬 固定劑和交聯(lián)劑：常用戊二醛。 免疫原性：臨床長期應用證實較

37、低 主要成分：膠原100醫(yī)療器械免疫毒性評價相關(guān)標準及指南101醫(yī)療器械免疫毒性評價相關(guān)標準及指南ISO/TS 10993-20Biological evaluation of medical devicesPart 20: Principles and methods forimmunotoxicicology testing of medical devices醫(yī)療器械免疫毒性評價原則和方法102醫(yī)療器械免疫毒性評價指 南解讀103免疫毒理學 免疫毒理學是毒理學中一門重要的分支學科，它與免疫學，藥理學，分子生物學，臨床醫(yī)學等學科有密切聯(lián)系，研究目的是探討外源化合物、物理因素及生物因素對機體

38、免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的有害影響及機制。醫(yī)療器械免疫毒性評價基本原則一般采用一組免疫毒性試驗方法由于免疫系統(tǒng)組成和功能的高度復雜性，以及免疫毒物作用的靶細胞和靶分子的多樣性，多數(shù)免疫毒理學家認為沒有一種試驗方法能完全檢測大多數(shù)免疫毒性物質(zhì)引起的免疫功能的改變。醫(yī)療器械免疫毒性評價基本原則體外法體內(nèi)法價值：為臨床研究或臨床應用提供參考數(shù)據(jù)。若將結(jié)果外推到人，需慎重考慮。醫(yī)療器械免疫毒性評價流程ISO10993-207醫(yī)療器械應用免疫毒性風險醫(yī)療器械免疫毒性相關(guān)風險免疫反應超敏反應109醫(yī)療器械應用接觸方式皮膚、粘膜：I型和IV型反應；其他部位：包括I型和IV型反應在內(nèi)的系統(tǒng)反應。通常情況下， 接觸時間越長

39、，免疫應答物質(zhì)形成的可能性越大。有些化學物質(zhì)作用迅速，在24小時之內(nèi)就可激發(fā)免疫應答。醫(yī)療器械免疫毒性風險與接觸方式的關(guān)系p：塑料及其它高分子；m：金屬；c：陶瓷、玻璃及復合材料b：生物源性材料；x：其它特殊材料11醫(yī)療器械免疫毒性評價試驗方法選擇ISO10993-20（反應類型）C:重要；NC:不重要；NA:不適用或不需醫(yī)療器械免疫毒性評價試驗方法選擇ASTM F1905-98（2003 ）ASTM F1906-98（2003 ） 體液免疫 細胞免疫 炎性因子 補體113體液免疫細胞免疫 免疫球蛋白總量 特異性免疫應答1. 特異性抗體檢測2. 空斑形成淋巴細胞分類淋巴細胞總數(shù)淋巴細胞亞型1.

40、2.(CD4+、CD8+)3. T細胞反應3. B細胞計數(shù)淋巴細胞增殖試驗114炎性細胞因子: IL-1 / IL-2補體 經(jīng)典途徑： C2或C4裂解產(chǎn)物 旁路途徑：B因子等 總補體系統(tǒng)： C3a、C5a 補體系統(tǒng)活性1. 終末復合物Sc5b-92. CH50115動物源性醫(yī)療器械免疫原性檢測方案的確定樣品處理 注射型直接用于注射致敏； 其他劑型1. 可溶于生理鹽水或PBS溶解；2. 不溶解， 但可分散懸?。w粒型）適量生理鹽水或PBS或羧甲基纖維素將其分散懸?。?. 不溶解，但可勻漿處理組織勻漿；4. 不溶解，且不可勻漿處理直接用于皮下埋植致敏。試驗動物選擇 首選小鼠C57BL/6, BAL

41、B/c 免疫毒理學數(shù)據(jù)豐富； 商品化抗體易得； 經(jīng)濟。30元/只 大鼠 Wistar, SD 免疫毒理學數(shù)據(jù)較豐富； 商品化抗體較易得； 較經(jīng)濟。35元/只 豚鼠 Harley 可將試驗與GPMT合并，減少試驗動用量注：當GPMT以浸提液致敏時不 適用118試驗動物分組 陰性對照組溶劑/手術(shù)對照組（埋植） 陽性對照組BSA 材料對照組適用時 試驗組 根據(jù)實際情況 數(shù)量：符合統(tǒng)計學要求。 體重： 小鼠：20-22g， 大鼠 150-200g119試驗劑量的確定 根據(jù)產(chǎn)品說明書； 根據(jù)一般毒理學數(shù)據(jù)： 通過皮內(nèi)刺激試驗，選擇不產(chǎn)生紅斑反應的最大濃度作為致敏或激發(fā)的最高濃度。免疫方式選擇 根據(jù)不同產(chǎn)

42、品的臨床使用特點來制定不同的免疫方案皮下注射：首次免疫加強免疫激發(fā)免疫如膠原蛋白植入劑等皮下植入如角膜基質(zhì)等取材時間及采血方式 取材時間個案處理，參照材料在體內(nèi)的降解； 采血方式： 尾靜脈 眼眶靜脈叢 心臟 采血量：小鼠0.1mL /次（連續(xù)采血時）122檢測指標的選擇體重體液免疫細胞免疫免疫器官免疫學參數(shù)血液學123檢測方法免疫前、免疫后稱重；免疫后處死動物， 取脾臟和胸腺稱重，計算系數(shù)免疫后處死動物， 取胸腺病理切片（WBC/ LYM/ MON/ NEUT/ BOS/ EOS）血細胞分析儀（脾臟T、B細胞計數(shù)，淋巴細胞亞群分析，NK細胞，巨噬細胞）FCMMTT/MTS124檢 測 案 例A

43、膠原植入劑（豬源）126實驗系統(tǒng)信息品系性別Balb/C小鼠級別體重SPF雌性202g年齡6-8周中國藥品生物制品檢定所實驗動物中心動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(京）2005-0004動物使用許可證號：SYXK(京)2006-0004來源飼養(yǎng)室溫度20-2540-70%1周飼養(yǎng)籠具尺寸 29.518.712.5(LWH) cm相對濕度檢疫時間飼養(yǎng)密度6只/盒*實驗系統(tǒng)選擇說明：（1）Balb/C小鼠為免疫學研究的常用動物；（2）近交系，遺傳背景清楚；（3）檢測試劑選擇余地較大；（4）委托單位同意；（5）本實驗室有前期的預試驗數(shù)據(jù)。127分組與劑量 膠原植入劑分三個劑量組，低、中、高劑量分別為0.

44、015ml/只；0.03ml/只；0.12ml/只，相當于人體臨床一次最大擬用劑量（7mL/體重55kg,身高165cm）的0.5倍、1倍、和4倍。 陰性對照為PBS組，陽性對照為牛血清白蛋白（BSA）免疫組 各組分別免疫三次，間隔兩周；三個取材時間點：二次免疫后兩周；三次免疫后兩周；三次免疫后四周。樣品處理陰性對照組 陽性對照組低劑量組中劑量組高劑量組分組及編號配制方法NPLMH原液20倍稀 原液10倍稀釋，0.3ml/ 釋，0.3ml/原液2.5倍稀釋，0.3ml/針BSA+福氏佐劑PBS針針植入劑量（ml；相當于原液）0.30.10.0150.030.12相當于人體單次最大用量（倍）0.

45、51014動物數(shù)量（只/組）10101010129試驗過程示意圖130檢測指標匯總 體重及體重變化 臟器系數(shù) 胸腺病理 脾臟病理 血液學參數(shù)（RBC,HGB,PLT,WBC,LYM,MON,NEUT,EOS,BOS） 血清IgG 血清IgM 血清小鼠抗豬I型膠原抗體 脾臟淋巴細胞及亞群表型分析（T,B,NK，巨噬） 混合淋巴細胞反應試驗X數(shù)據(jù)分析方法 統(tǒng)計學分析：分析軟件：SPSS1 試驗材料組與陰性對照組比較單因素方差分析（Oneway ANOVA）流程：1.1 方差齊性分析（Test of Homogeneity of Variances）1.2 方差分析根據(jù)方差齊性檢驗結(jié)果選擇適用的方法

46、滿足方差齊性的變量采用ANOVA進行多個樣本均數(shù)比較；不滿足方差齊性的變量采用Welch法進行多個樣本均數(shù)比較。數(shù)據(jù)分析方法1.3 對方差分析顯著的變量進行不同劑量組與陰性對照組的多重比較滿足方差齊性的變量，采用Dunnettt法；不滿足方差齊性的變量，采用games-howell法1.4 以a=0.05為檢驗的顯著性水準。2 陽性對照組與陰性對照組比較獨立樣本T檢驗（Independent Sample Test） 生物學分析： 以陰性對照組均值2SD定義為生物學參考范圍，各劑量組與之進行比較。檢測結(jié)果匯總表格范例WBC分類計數(shù)EOS LYM%組別WBCRBCHGBPLTLYM2.80.910MON0.00.0100.20.1100.00010+10+0.00.010/NEUT1.70.610MON%0.5NEUT%37.16.2EOS%0.00.110均值標準差N4.51.31011.00.5156.65.1781.4145.1100.00.0100.00.010/61.96.