精選蛋白質酶工程

1、蛋白質工程：2.結構根底少量，選擇題，填空題蛋白質空間結構的根本組件：螺旋，層，環(huán)肽鏈，疏水內核。蛋白質結構的共同特征：疏水內核，疏水相互作用是指非極性基團在任何極性環(huán)境中強烈趨于彼此聚集的擇優(yōu)效應。穩(wěn)定-螺旋的因素:-螺旋具有極性，所有氫鍵都沿螺旋軸指向同一方向-螺旋的中心沒有空腔氨基酸的旋光性：除甘氨酸外，都具有旋光性。氨基酸的光吸收：酪氨酸Tyr、278nm、色氨酸(Trp、279)和苯丙氨酸(Phe、259)能夠吸收紫外光共軛雙鍵。蛋白質一級結構:多肽鏈中的氨基酸的排列順序，包括二硫鍵的位置數量和鏈內共價連接的方式。穩(wěn)定因素，肽 鍵、二硫鍵都屬于共價鍵蛋白質二級結構:主要有螺旋，平行層

2、，反平行層，轉折、310 螺旋穩(wěn)定因素，主要由其內部形成的主鏈氫鍵所穩(wěn)定，氫鍵的排布方式為二級結構重要特征。 蛋白質三級結構：在二級和超二級結構及結構域的根底上進一步卷曲形成復雜球狀分子結構。蛋白質四級結構：蛋白質分子的亞基結構，1，2，1，2。無亞基并只有單結構域的蛋白質:三級結構就是它的完整的三維結構。蛋白質在體內的形成分為兩個階段：多肽鏈的生物合成，新生肽鏈折疊。蛋白質折疊：由多肽鏈的一維線性氨基酸序列轉化為具有特征三維結構的活性天然蛋白質的過程。結構模體：一級順序上相鄰的二級結構在三維折疊中也靠近，彼此按特定的幾何排布形成簡單的組合。結構域：二級結構和結構模體以特定的方式組合連接，在空

3、間上可以明顯區(qū)分的三級折疊實體，稱為結構域。結構域水平劃分蛋白質：1型結構2型結構 3/型結構 4+型 5無規(guī)型/富含二硫鍵和金屬離子型。，/為主要結構。增加蛋白質穩(wěn)定性的途徑：1引進二硫鍵，替換甘氨酸，增加脯氨酸。2穩(wěn)定螺旋。3填充疏水內核。幫助折疊的蛋白質和酶：1分子伴侶。2幫助正確二硫鍵形成的酶。3催化脯氨酸殘基 cis-trans 異構化的酶。目前較為系統(tǒng)和廣泛使用的數據庫: SCOP、CATH、DALI、FSSD 和 DDD。3.蛋白質分子設計多，大題重點 蛋白質設計的目的：為蛋白質工程提供指導性信息，探索蛋白質的折疊機理。 蛋白質分子設計層次:序列分析、二級結構預測、同源蛋白質結構

4、預測、蛋白質突變體結構預測、蛋白質的性能預測和蛋白質分子設計六個局部。 分子設計的5個步驟： 1. 建立所研究蛋白質的結構模型?？赏ㄟ^X射線晶體學、二維核磁共振等測定。2. 找出對所要求的性質有重要影響的位置。利用同一家族中的蛋白質的序列比對、分析，找出重要位點，這是分子設計工作的關鍵。3. 選擇一系列的在2中所選出位點上改變殘基所得到的突變體，一方面使蛋白質可能具有所要求的性質，另一方面又盡量維持原有結構。盡量在同源結構中此位點已有的氨基酸殘基序列中進行選擇，也要考慮殘基的體積、疏水性等性質的變化所帶來的影響。4. 預測突變體的結構。5. 定性或定量計算優(yōu)化所得到的突變體結構是否具有所要求的

5、性質。蛋白質分子設計流程：蛋白質分子設計的分類：按照改造部位的多寡分為三類，第一類為“小改，少數殘基的替換，通過定位突變或化學修飾來實現。主要通過定點突變技術或盒式替換技術。例，核糖核酸酶，T4噬菌體溶菌酶。第二類為“中改，對來源于不同蛋白的結構域進行拼接組裝。例抗體分子改造第三類為“大改，即完全從頭設計全新的蛋白質。蛋白質的功能設計：通過反向擬合天然蛋白質設計新的功能鍵合及催化的從頭設計在全新蛋白質中引入結合位點催化活性蛋白質的設計 膜蛋白及離子通道的設計 新材料的設計蛋白質分子設計的意義:1.是我們深入全面理解蛋白質的結構規(guī)律功能的一個過程，目的在于是人工創(chuàng)造出自然界中不存在的蛋白質分子，

6、使其具有特定的特殊結構和功能，為人類所利用。2.人類已經邁進蛋白質設計的時代，蛋白質分子設計有助于進一步揭示蛋白質的結構原理以及結構與功能的關系，也有助于指導藥物合成以及工業(yè)產品的設計。篩選以及純化蛋白質：需要測定它們的序列、三維結構、穩(wěn)定性、催化活性等。3.蛋白質的修飾和表達名詞解釋，填空重點易錯PCR技術原理：改變正常PCR反響體系中某些組分的數量或者質量，隨即引入錯誤堿基創(chuàng)造序列多樣性的DNA文庫。DNA改組技術原理：靶基因酶切產生隨機DNA片段，以3-末端的片端為引物和模板，隨機互補結合并延伸。蛋白質側鏈基團的化學修飾：修飾部位：蛋白質的側鏈基團。修飾機制：選擇性的試劑或者親和標記試劑

7、與側鏈上的特定功能團發(fā)生化學反響。修飾類型：巰基、氨基、羧基、二硫鍵常見的克隆載體填空：質粒載體噬菌體載體黏粒載體病毒載體人工染色體載體等表達載體的構建:1、復制的起始點2、選擇性基因3、啟動子4、核糖體結合位點5、多克隆位點6、轉錄終止序列核糖體展示技術定向進化篩選中的方法:該技術是基于一種穩(wěn)定的抗體-核糖體-mRNA復合物的構象根底?？贵w蛋白與它的編碼序列物理連接。抗體基因轉錄，產生許多mRNA分子，每一個代表著不同抗體基因。mRNA分子與細菌的核糖體孵育，然后mRNA翻譯成蛋白質。每個復合體展示一種不同的抗體，當經過一個含有靶標抗原的親和柱子后，一些能結合上去的復合體不會被洗去，該展示技

8、術完全在體外完成，并且不需要克隆就能完成大規(guī)?？贵w庫的構建。5.蛋白質的物理化學性質穩(wěn)定蛋白質三維結構的作用力：氫鍵、范德華力、疏水作用力和鹽鍵離子鍵及共價二硫鍵。靜電作用。6.蛋白質結構解析蛋白質三維結構測定的方法選擇填空：X-Ray晶體衍射是主要的方法。優(yōu)點：分辨率高，能精確確定生物大分子中各原子的坐標、鍵長、鍵角,給出生物大分子的分子結構和構型,確定活性中心的位置和結構 。缺點：只能測定單晶，反映靜態(tài)結構信息，無法測定溶液中的信息。核磁共振技術。優(yōu)點：可以在水溶液或有機相中研究生物大分子結構，研究溶液條件的改變對生物大分子三維結構的影響以及生物大分子內部動力學的特點。分辨率不高。目前，N

9、MR只能用于測定小分子和中型蛋白質的結構。其他重要方法：圓二色譜法，通過圓二色譜測定和計算能夠了解生物大分子在溶液狀態(tài)下的二級結構。質譜，將樣品轉化為運動的氣態(tài)帶電離子，于磁場中按質荷比(m/z)大小別離并記錄的分析方法。高靈敏度易操作性準確性快速性很好的普適性。7.別離純化與鑒定名詞解釋，填空無大題鹽析：蛋白質在高濃度中性鹽溶液中會沉淀析出。透析：利用半透膜對溶液中不同分子的選擇性透過作用，可以將蛋白質與其他小分子物質分開。鹽溶：蛋白質溶液中參加低濃度中性鹽后，可使蛋白質溶液濃度增加。純化步驟：1.選擇實驗材料，實驗材料預處理2.蛋白質的提取3.蛋白質的粗分級4.蛋白質的細分級5.蛋白質的鑒

10、定常用技術及原理:離子交換層析，蛋白質是兩性分子，利用蛋白質所帶電荷種類數量不同和帶電凝膠的作用力的差異從而把蛋白質分開的層析方法。分子篩層析，也稱為凝膠過濾、分子排阻層析。是以多孔性凝膠材料為支持物，當蛋白質溶液流經此支持物時，分子大小不同的蛋白質所受到的阻滯作用不同而先后流出，從而到達別離純化的目的。親和層析，親合層析是利用蛋白質與配體專一性識別并結合的特性而別離蛋白質的一種層析方法。羥基磷灰石層析，主要成分是磷酸鈣。電泳，蛋白質為兩性電解質，在一定PH的條件下，不同的蛋白質帶有不同種類和數量的電荷，因此其在電場中的移動速度不同，從而把蛋白質分開，這種技術即為電泳。8.蛋白質工程的應用(很

11、少)基因工程2.動植物細胞培養(yǎng)產酶很少2.微生物發(fā)酵產酶多 酶生物合成的四種模式：比擬細胞生長與酶產生的關系，1.同步合成型，酶的生物合成與細胞生長同步進行的一種酶生物合成模式，又稱為生長偶聯(lián)型。2.延續(xù)合成型，酶的生物合成在細胞的生長階段開始，在細胞生長進入平衡期后，酶還可以延續(xù)合成一段較長時間。3.中期合成型，該類型的酶在細胞生長一段時間以后才開始，而在細胞生長進入平衡期以后，酶的生物合成也隨著停止4.滯后合成型，此類型酶是在細胞生長一段時間或者進入平衡期以后才開始其生物合成并大量積累。又稱為非生長偶聯(lián)型。酶的提取別離與純化細胞破碎:許多酶存在于細胞內。為了提取這些胞內酶，首先需要對細胞進

12、行破碎處理。酶的提取:是指在一定的條件下，用適當的溶劑或溶液處理含酶原料，使酶充分溶解到溶劑或溶液中的過程。沉淀別離:是通過改變某些條件或添加某種物質，使酶的溶解度降低，而從溶液中沉淀析出，與其它溶質別離的技術過程。酶的提取方法大題：層析的方法大題：酶分子修飾很少，無大題酶分子修飾：通過各種方法使酶分子的結構發(fā)生某些改變，從而改變酶的某些特性和功能的技術過程。酶分子修飾方法：金屬離子置換修飾,大分子結合修飾(共價/非共價)，側鏈基團修飾，肽鏈有限水解修飾，氨基酸置換修飾，酶分子的物理修飾共價修飾：有些酶,在細胞內其他酶的作用下,其結構中某些特殊基團進行可逆的共價修飾,從而快速改變該酶活性,調節(jié)

13、某一多酶體系的代謝通路,稱為共價修飾調節(jié)。酶，細胞，原生質固定化。(大題小題都有)固定化酶：是指固定在載體上并且在一定的空間范圍內進行催化反響的酶。固定化酶優(yōu)缺點：優(yōu)點:不溶于水，易于與產物別離；可反復使用；可連續(xù)化生產；穩(wěn)定性好。缺點:固定化過程中往往會引起酶的失活。固定化酶的應用：酶經過固定化后,比擬能耐受溫度及pH值的變化,可制成顆粒裝成酶柱用于連續(xù)生產,也可以制成酶膜、酶管等酶反響器.固定化酶作為生物催化劑主要用于生產精細的特殊化學品、藥品,在食品工業(yè)中由于生物催化劑較平安,也將得到廣泛使用.同時,固定化酶用于各種疾病的診斷、治療及人工臟器；氨基酰化酶是世界上第一種用于工業(yè)生產的固定化酶。例，高果糖漿生產，青霉素酰化酶轉化。與能量轉換器密切結合而成酶傳感器，廣泛應用于臨床診斷，工業(yè)發(fā)酵過程中控制和環(huán)境監(jiān)測等。例，酶電極。酶的定向進化名詞解釋定向進化技術：模擬自然進化的過程，進行人工隨機突變，并在特定的環(huán)境條件下進行選擇，使進化朝著人們所需要方向開展的技術過程。酶分子定向進化：在模擬自然進化過程，在體外進行酶基因的人工隨機突變，建立突變基因文庫，在特殊環(huán)境下，定向選擇得到具有優(yōu)良催化特性的酶的突變體的技術。酶的非水相催化(少量名詞解釋)必須水:維持酶分子完整的空間構象所必需的