單細(xì)胞全基因組測序

1、單細(xì)胞全基因組測序單細(xì)胞全基因組測序技術(shù)是在單細(xì)胞水平對(duì)全基因組進(jìn)行擴(kuò)增與測序的一項(xiàng)新技術(shù)。其原理是將分離的單個(gè)細(xì)胞的微量全基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，獲得高覆蓋率的完整的基因組后進(jìn)行高通量測序用于揭示細(xì)胞群體差異和細(xì)胞進(jìn)化關(guān)系。從方法學(xué)角度來看，獲得高覆蓋率高保真性的全基因組擴(kuò)增產(chǎn)物是準(zhǔn)確全面的測序結(jié)果的保障。多重置換擴(kuò)增(multipledisplacementamplification，MDA)利用隨機(jī)引物和等溫?cái)U(kuò)增可以獲得高保真的DNA大片段,但該方法的主要缺陷在于非平衡的基因組覆蓋率、擴(kuò)增偏倚、嵌合序列及非特異擴(kuò)增等1。盡管各種改進(jìn)的策略正在逐步減少這些缺陷，高覆蓋率、高保真性及高特異性的

2、擴(kuò)增仍然是亟待解決的問題。另外，還有科研人員利用DOP-PCR進(jìn)行全基因組擴(kuò)增(whole-genomeamplification，WGA)及DNA測序?qū)蝹€(gè)乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行了拷貝數(shù)變異的分析，進(jìn)而推斷出細(xì)胞的群體結(jié)構(gòu)和腫瘤的進(jìn)化過程。但是由于該方法的基因覆蓋率較低，而且不能在單個(gè)核苷酸的分辨率上評(píng)價(jià)單個(gè)腫瘤細(xì)胞的遺傳學(xué)特征，故并不能檢測在腫瘤發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用的單個(gè)核苷酸的改變。2012年，哈佛大學(xué)謝曉亮院士在Science發(fā)表了單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增新技術(shù)MALBAC(MultipleAnnealingandLoopingBasedAmplificationCycles，簡稱MALBAC),

3、即多次退火環(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)23。不同于以往的非線性或指數(shù)型擴(kuò)增方法，MALBAC技術(shù)利用特殊引物，使得擴(kuò)增子的結(jié)尾互補(bǔ)而成環(huán)，從而很大程度上防止了DNA的指數(shù)性擴(kuò)增，從而解決了基因組擴(kuò)增對(duì)微量初始模板過大的擴(kuò)增偏倚，并使基因組測序的模板需求量從口g級(jí)降至單細(xì)胞水平。MALBAC技術(shù)原理如下：353553polymeraseMALBACprimerPrimersannealonTemplatesDenaturationMALBACPrimershavinga27-ntcommonsequencefollowedbyeightrandomnucleotidesareannealedtothegen

4、omicDNAtemplate.Strand-displacementsynthesisgeneratespartialamplicons,whicharesubsequentlydenaturedfromthetemplateat94C.PrimingtonewpositionsonthegenomicDNAtemplategeneratesmorepartialamplicons,whichincreasescoverageofthegenomewitharesultingreductioninamplificationbias.Primingnadextensiononthepartia

5、lampliconsyieldcompleteampliconshavingtheMALBACprimersequenceat5endanditscomplementarysequenceatthe3end.Denaturationat94Cregeneratestheoriginaltemplateandanowlargerandmorediversepoolofpartialamplicoms.Fullampliconsformloops,whichmayberesistanttosubsequentamplificationandhybirdization.Fullampliconsar

6、egeneratedforeightcyclesandtheexponentiallyamplifiedbyabout14-21cyclesusingprimerscomplementarytothecommonregionoftheMALBACprimers.常見的全基因組擴(kuò)增方法(whole-genomeamplification,WGA)比較如下：表：常見方法比較WGA方法MALBACMDADOP-PCRPEP最低DNA模板量0.5pg，單細(xì)胞或單染色體1000pg1000pg1000pg基因組覆蓋度90%2170%40%50%Alleledropout概率10%高達(dá)50%擴(kuò)增前后的偏倚

7、倍數(shù)219.861.8220.5適宜的下游應(yīng)用二代測序，芯片檢測，常規(guī)PCR，二代測序常規(guī)PCR常規(guī)PCRqPCR,CNV分析，SNP分析，常規(guī)PCR不適宜的下游應(yīng)用無CNV分析CNV分析，二代測序，CNV分析，二代測序，芯片檢測，qPCR芯片檢測，qPCR通過比較我們發(fā)現(xiàn)，MALBAC技術(shù)具有如下優(yōu)勢:1）降低擴(kuò)增偏倚，使得單細(xì)胞中的基因組能夠被測序。這種方法使得檢測單細(xì)胞中較小的序列變異變得更容易，因此能夠發(fā)現(xiàn)個(gè)別細(xì)胞之間的遺傳差異。這樣的差異可以幫助解釋癌癥惡化的機(jī)制，生殖細(xì)胞形成機(jī)制，甚至是個(gè)別神經(jīng)元的差異機(jī)制。2）靈敏度高：單細(xì)胞、單染色體或的基因組即可進(jìn)行擴(kuò)增。分析，用于三體等染色

8、體變異檢測。、基因克隆。3）擴(kuò)增均勻性顯著優(yōu)于其它技術(shù)，測序數(shù)據(jù)可進(jìn)行4）擴(kuò)增產(chǎn)物用途廣泛：可用于二代測序、微陣列、目前，MALBAC技術(shù)現(xiàn)在已經(jīng)成功應(yīng)用于人類單精子、植入前產(chǎn)前篩查的囊胚和極體、早期發(fā)育胚胎、腫瘤細(xì)胞、刑偵現(xiàn)場痕量物證和部分微生物。參考文獻(xiàn)YilmazS,SinghAK.Singlecellgenomesequencing.CurrOpinBiotechnol2012;23(3):437-43.ZongCZ,LuSJ,ChapmanAR,XieXS.Genome-WideDetectionofSingleNucleotideandCopyNumberVariationsofa

9、SingleHumanCell.Science2012;338(6114):1622-6.LuSJ,ZongCZ,XieXS,etal.ProbingMeioticRecombinationandAneuploidyofSingleSpermCellsbyWholeGenomeSequencingusingMALBAC.Science2012;338(6114):1627-30.BaloghMK.Applicationofwholegenomeamplificationforforensicanalysis.Elsevier2006;1288:725-727.PinardR,deWinterA,SarkisGJ,e