分子生物學(xué)檢驗(yàn)：胚胎植入前的分子生物學(xué)檢驗(yàn)

1、胚胎植入前的分子生物學(xué)檢驗(yàn)胚胎植入1、前處理及排卵監(jiān)測(cè)2、采卵3、卵子培養(yǎng)4、體外授精5、胚胎移植產(chǎn)前診斷技術(shù)是預(yù)防遺傳病發(fā)生的主要途徑先天性心臟病神經(jīng)管畸形血紅蛋白病、地中海貧血和鐮狀紅細(xì)胞病唐氏綜合征G6PD缺乏遺傳性或部分遺傳性出生缺陷絨毛膜取樣技術(shù) 選擇性流產(chǎn)-身心傷害、金錢、倫理-被動(dòng)的不得已的方式？植入前遺傳學(xué)診斷輔助生育技術(shù)與分子生物學(xué)的結(jié)合第一節(jié)：試管嬰兒及植入前遺傳學(xué)診斷的誕生PGD技術(shù)是由于輔助生育技術(shù)（assisted reproductive technique, ART）的成熟應(yīng)用而產(chǎn)生的輔助生育技術(shù)（assisted reproductive technique,

2、ART）目前在我國(guó)，由于各種原因?qū)е碌牟辉胁挥臄?shù)量正在逐年增長(zhǎng)，ART應(yīng)運(yùn)而生人工授精（artificial insemination, AT）體外受精-胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer, IVF-ET）.一、試管嬰兒Robert G. Edwards, The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2010 As early as the 1950s, Edwards had the vision that IVF could be useful as a treatment for inf

3、ertility. He worked systematically to realize his goal, discovered important principles for human fertilization, and succeeded in accomplishing fertilization of human egg cells in test tubes (or more precisely, cell culture dishes). His efforts were finally crowned by success on 25 July, 1978, when

4、the worlds first test tube baby - Louise Brown was born. During the following years, Edwards and his co-workers refined IVF technology and shared it with colleagues around the world.試管嬰兒第一代試管嬰兒技術(shù)：體外受精-胚胎移植, 輸卵管堵塞、子宮內(nèi)膜異位癥等引起的不孕癥第二代試管嬰兒技術(shù)：?jiǎn)尉影麧{內(nèi)注射, 男性不育癥患者第三代試管嬰兒技術(shù)：胚胎植入前的遺傳學(xué)診斷，解決遺傳病及優(yōu)生問(wèn)題第四代試管嬰兒技術(shù)：卵細(xì)胞核

5、移植技術(shù)，大齡患者; 未成熟卵的體外成熟技術(shù)，卵細(xì)胞發(fā)育障礙者二、植入前遺傳學(xué)診斷的誕生PGD就是針對(duì)父母本身具有遺傳學(xué)異常，其子代也有遺傳學(xué)異常的高度風(fēng)險(xiǎn)，但不愿意在發(fā)現(xiàn)胎兒異常再進(jìn)行選擇性流產(chǎn)而發(fā)展起來(lái)的新輔助生殖技術(shù)，它結(jié)合了輔助生殖技術(shù)與遺傳學(xué)診斷技術(shù)。它的應(yīng)用可以說(shuō)是從根本上解決了優(yōu)生優(yōu)育的問(wèn)題，應(yīng)用前景廣植入前遺傳學(xué)PGD：將精、卵體外受精，當(dāng)胚胎發(fā)育到6-8個(gè)細(xì)胞時(shí)，取1-2個(gè)細(xì)胞進(jìn)行遺傳學(xué)分析，剔除具有遺傳缺陷的胚胎，選擇沒(méi)有疾病表型、正常的胚胎植入母體子宮，阻斷遺傳病的發(fā)生 避免遺傳病胎兒減少患者父母的痛苦降低手術(shù)并發(fā)癥達(dá)到源頭優(yōu)生PGD發(fā)展史1965年Edwards最早提出

6、，1968年兔囊胚活檢，取出少量滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞分析染色體來(lái)選擇雌性胚胎1989年，英國(guó)Handyside等對(duì)性連鎖性疾病攜帶者實(shí)驗(yàn)體外受精后卵裂期胚胎活檢，選擇女性 胚胎植入，健康的女嬰1994年，Monne用熒光原位雜交技術(shù)，染色體的非整倍體及性別PCR及相關(guān)技術(shù)，多色FISH，全基因組擴(kuò)增以及基因芯片廣泛應(yīng)用第二節(jié) 胚胎植入前診斷的技術(shù)與方法PGD最早適用于性別診斷、某些單基因性遺傳疾病、染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目異常。近年P(guān)GD也可應(yīng)用于對(duì)人類腫瘤易感基因的分析及一些遲發(fā)性疾病的基因檢測(cè)。嚴(yán)格的適用人群和適應(yīng)證：父母本身具有遺傳學(xué)異常，其子代也有遺傳學(xué)異常的高度風(fēng)險(xiǎn)（如X-連鎖疾病的檢測(cè)、常染色體

7、的隱性異常），但不愿意進(jìn)行選擇性流產(chǎn)染色體易位導(dǎo)致的反復(fù)自然流產(chǎn)者非整倍體性的體外受精者，尤其F 37 Y一、胚胎取材途徑第一和第二極體活檢卵裂球活檢囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢（一）第一和第二極體活檢極體是由卵母細(xì)胞減數(shù)產(chǎn)生的小的細(xì)胞，與卵母細(xì)胞相同的遺傳物質(zhì)優(yōu)點(diǎn)：活檢后卵子繼續(xù)成熟與受精，不影響受精、胚胎的發(fā)育非胚胎操作，心理和倫理易接受取材早，分析時(shí)間較多缺點(diǎn)：無(wú)父方相關(guān)的基因組或染色體異常信息，不能確定性別不能提供受精后胚胎的染色體異常的信息（二）卵裂球活檢最初的PGD進(jìn)行性別鑒定，用于X-連鎖疾病的檢測(cè) 胚胎達(dá)6-8個(gè)細(xì)胞時(shí)，活檢1-2個(gè)卵裂球優(yōu)點(diǎn)：此階段活檢1-2個(gè)細(xì)胞不影響胚胎的進(jìn)一步發(fā)育

8、，可檢出來(lái)自父方的異常。目前最常用缺點(diǎn)：材料少，胚胎嵌合體發(fā)生率很高，漏診和誤診（三）囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢取囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行PGD活檢優(yōu)點(diǎn)：囊胚期活檢量多，提高PGD準(zhǔn)確性，且不影響胚胎的發(fā)育潛能缺點(diǎn)：為滋養(yǎng)層細(xì)胞，存在多倍體現(xiàn)象，不能完全代表內(nèi)細(xì)胞團(tuán)二、常用的分子生物學(xué)技術(shù)單細(xì)胞PCR技術(shù)熒光原位雜交技術(shù)其他PGD技術(shù)（一）單細(xì)胞PCR技術(shù)單細(xì)胞PCR技術(shù)主要實(shí)驗(yàn)步驟模板制備單細(xì)胞基因擴(kuò)增產(chǎn)物分析 1.模板制備模板核酸制備：凍融法、蛋白酶K/SDS消化法注意事項(xiàng)：DNA模板量極低，樣本的采集和處理各個(gè)環(huán)節(jié)注意模板DNA的丟失和降解，DNA擴(kuò)增失敗或效率低，出現(xiàn)假陰性避免采樣時(shí)的精子或其它細(xì)胞

9、的DNA污染,出現(xiàn)假陽(yáng)性2.單細(xì)胞基因擴(kuò)增單細(xì)胞DNA模板量極低，采用巢式PCR擴(kuò)增，增加敏感性和特異性3.產(chǎn)物分析瓊脂糖凝膠電泳，EB（Gel red）染色觀察目的條帶多態(tài)性分析等位基因寡核苷酸特異探針斑點(diǎn)雜交雞反向斑點(diǎn)雜交單鏈構(gòu)象多態(tài)性變性梯度凝膠電泳單細(xì)胞PCR技術(shù)的問(wèn)題問(wèn)題：模板少、擴(kuò)增效率低、污染及等位基因脫扣(Allele Drop-Out, ADO)現(xiàn)象ADO:兩個(gè)等位基因中只有一個(gè)被成功擴(kuò)增的現(xiàn)象，為單細(xì)胞特有，只發(fā)生在雜合等位基因中，隨意性解決方法：模板的充分變性優(yōu)化PCR條件（首輪PCR）熒光PCR檢測(cè) （二）熒光原位雜交技術(shù)熒光原位雜交技術(shù)應(yīng)用：可以判斷特定染色體的數(shù)目或

10、其存在和缺失的情況，中期染色體和間期核分析優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高和特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)適用范圍：高齡育婦女、反復(fù)IVF失敗、習(xí)慣性流產(chǎn)、男性不育（三）其他PGD技術(shù)植入前遺傳學(xué)單倍型分析(preimplantation gentic haplotyping,PGH)非整倍體篩選(preimplantation gentic screening,PGS)1.植入前遺傳學(xué)單倍型分析(PGH)植入前遺傳學(xué)單倍型分析(PGH)應(yīng)用：如X染色體長(zhǎng)臂端粒區(qū)域Xq28集中了多種疾病的致病基因，包括血友病A、色素失調(diào)癥和X-連鎖的腦積水等，通過(guò)檢測(cè)該區(qū)域的6個(gè)STR位點(diǎn)即可優(yōu)點(diǎn)：范圍廣、技術(shù)的重復(fù)利用率高等優(yōu)點(diǎn)注意：基因和STR位點(diǎn)之間可能有基因重組，同時(shí)分析疾病基因兩側(cè)的STR2.非整倍體篩選(PGS)借助于FISH技術(shù)，對(duì)高齡婦女、反復(fù)IVF種植失敗以及反復(fù)自然流產(chǎn)婦女的胚胎進(jìn)行非整倍體篩選，即胚胎進(jìn)行染色體的非整倍體篩查，非針對(duì)遺傳病基因，有助于提高IVF成功率15%的錯(cuò)誤率，有一定的爭(zhēng)議第三節(jié)：胚胎植入前診斷的應(yīng)用評(píng)價(jià)PGD應(yīng)用主要集中在以下類型：常染色體隱性遺傳性疾病：b-地中海貧血.常染色體顯性遺傳性疾?。汉嗤㈩D病.性連鎖性疾?。篨染色體綜合征某些遺傳病：乳腺癌一些遲發(fā)性