胚胎實(shí)驗(yàn)室操作手冊(cè)

1、 44/44 胚胎實(shí)驗(yàn)室操作手冊(cè)胚胎實(shí)驗(yàn)室每日工作流程胚胎實(shí)驗(yàn)室安全與質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)室安全與感染控制實(shí)驗(yàn)室必須有完善的安全制度和防患措施，必須有關(guān)于火、電意外引起緊急情況時(shí)的應(yīng)急方案，實(shí)驗(yàn)室人員必須了解災(zāi)情中的救援措施。為避免停電影響設(shè)備正常運(yùn)轉(zhuǎn)，應(yīng)備有雙重供電系統(tǒng)，或不間斷電源（UPS），以確保二氧化碳培養(yǎng)箱和顯微鏡等關(guān)鍵設(shè)備在意外停電時(shí)滿足正常工作。所有體液樣本（精液、血液、卵泡液等）必須視同潛在污染源，所有的供體組織和體液應(yīng)有適當(dāng)?shù)膫魅静”O(jiān)測(cè)。實(shí)驗(yàn)室工作人員應(yīng)清楚乙肝疫苗的必要性并接受乙肝疫苗接種。特別小心不要被那些受體液污染的儀器或設(shè)備意外損傷。避免將體液濺到眼中。當(dāng)接觸體液或盛放體液的

2、容器時(shí)，應(yīng)帶一次性無粉橡膠或塑料手套。離開實(shí)驗(yàn)室時(shí)，將手套脫下丟掉，決不可重復(fù)使用。離開實(shí)驗(yàn)室時(shí)，脫掉實(shí)驗(yàn)室衣服，不能穿著出入公開場(chǎng)所或餐廳。被體液沾染時(shí)，必須馬上用消毒液或肥皂清洗。接觸配子和胚胎的耗材必須使用一次性用品。因體液溢出污染實(shí)驗(yàn)室設(shè)備時(shí)，應(yīng)在操作完成后用75%酒精消毒。在實(shí)驗(yàn)室體液操作中必須使用機(jī)械抽吸裝置，禁止用口吸。所有操作步驟和體液處理應(yīng)小心，盡量減少浮滴和煙霧生成。例如離心時(shí)必須用帶蓋的試管。實(shí)驗(yàn)室中嚴(yán)禁吃東西、吸煙等。所有丟棄的體液和用后的一次性物品必須按污染物品處理。實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制培養(yǎng)箱的質(zhì)量控制專人管理，每日確認(rèn)以下各項(xiàng)容并予以記錄：CO2的控制：6%0.2%；溫度

3、的控制：370.2；濕度：大于80%RH，水盤水的深度始終保持在大約1cm 以上。培養(yǎng)箱的水盤使用超純水，根據(jù)不同培養(yǎng)箱要求定期更換，換水當(dāng)天培養(yǎng)箱不放卵子或胚胎；培養(yǎng)箱顯示器溫度與培養(yǎng)箱溫度計(jì)的溫度應(yīng)一致。不一致時(shí)應(yīng)及時(shí)調(diào)整校正。消毒清潔：每隔3個(gè)月消毒培養(yǎng)箱。消毒時(shí)拆卸培養(yǎng)箱所有鋼架，以75%酒精和超純水分別擦拭消毒，再送高壓消毒。培養(yǎng)箱壁以75%酒精和超純水分別擦拭。消毒清潔完成后，需開機(jī)運(yùn)行穩(wěn)定后方可使用。培養(yǎng)用氣體的質(zhì)量控制使用有合法資格的氣體供應(yīng)廠家，氣瓶使用前需檢查是否有合格證標(biāo)簽。使用醫(yī)用高純度CO2（99.995%以上）培養(yǎng)胚胎。每天記錄氣瓶的壓力，定期檢查氣瓶有無漏氣并更換

4、培養(yǎng)箱外氣體過濾器。CO2進(jìn)入培養(yǎng)箱之前，必須經(jīng)過CODA過濾器對(duì)CO2進(jìn)行過濾。CODA過濾器應(yīng)定期更換，根據(jù)供氣量，每3-6個(gè)月更換一次。CO2分壓應(yīng)與培養(yǎng)箱要求的壓力相符，當(dāng)氣瓶CO2氣體接近用完時(shí)，應(yīng)及時(shí)更換新的氣瓶，記錄更換氣瓶時(shí)間。UPS的質(zhì)量控制重要儀器如培養(yǎng)箱、顯微鏡、冰箱等必須連接到UPS上，每日觀察UPS工作狀態(tài)，如有異常及時(shí)找工程師維修。液氮罐的質(zhì)量控制胚胎冷凍液氮罐需每天查看外觀，每周至少兩次檢測(cè)剩余量，按時(shí)添加液氮，使液氮深度保持在25cm以上。液氮運(yùn)輸罐需專人更換。液氮罐應(yīng)存放于固定位置。液氮罐應(yīng)每3年進(jìn)行一次校驗(yàn)。超凈工作臺(tái)的質(zhì)量控制超凈工作臺(tái)層流系統(tǒng)提供潔凈環(huán)境

5、，用于胚胎培養(yǎng)的準(zhǔn)備工作，如培養(yǎng)液配制、培養(yǎng)皿準(zhǔn)備、胚胎操作等，不能進(jìn)行其它存有污染性的操作。超凈工作臺(tái)應(yīng)于每天工作前提前30分鐘開啟，臺(tái)面溫度應(yīng)穩(wěn)定于設(shè)定的溫度。超凈臺(tái)每年應(yīng)至少檢測(cè)一次潔凈度。實(shí)驗(yàn)室層流系統(tǒng)的質(zhì)量控制體外受精實(shí)驗(yàn)室溫度維持在242之間，濕度在40%以上，每日觀察并記錄溫度和濕度，如果波動(dòng)過大及時(shí)進(jìn)行調(diào)整，若有異常，盡快維護(hù)和處理。在有胚胎的情況下不能關(guān)閉實(shí)驗(yàn)室凈化空調(diào)系統(tǒng)。實(shí)驗(yàn)室凈化空調(diào)系統(tǒng)由專業(yè)人士檢測(cè)維護(hù)，新風(fēng)口濾網(wǎng)每2-4周更換一次，回風(fēng)口濾網(wǎng)每月更換一次，初效過濾器每1-3個(gè)月更換一次，中效過濾器每3-6個(gè)月更換一次，高效過濾器每1-2年更換一次，并做好維護(hù)檢測(cè)記錄

6、。如遇特殊情況，及時(shí)更換。每日觀察并記錄胚胎實(shí)驗(yàn)室與冷凍間、緩沖間、移植手術(shù)室及取卵手術(shù)室之間的壓差。如果壓差5Pa，應(yīng)查找原因，及時(shí)檢修和維護(hù)。每月進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室空氣細(xì)菌培養(yǎng)。冰箱的質(zhì)量控制專人管理，每天檢測(cè)并予以記錄。1.冷藏層：28；2.冷凍層：-15-20。熱臺(tái)的質(zhì)量控制專人管理，每天操作前檢測(cè)并予以記錄。要求：380.5。實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備的使用和維護(hù)建立設(shè)備常規(guī)操作程序，并嚴(yán)格按照操作程序執(zhí)行。保存各種設(shè)備的使用說明文件。儀器設(shè)備的維修保養(yǎng)應(yīng)嚴(yán)格按照規(guī)定的程序進(jìn)行，有關(guān)人員在進(jìn)行保養(yǎng)、調(diào)校和維修工作以前，應(yīng)首先熟悉儀器的性能、結(jié)構(gòu)、使用方法和保養(yǎng)、調(diào)校方法，以及維修程序。儀器設(shè)備一旦出現(xiàn)異

7、?；虬l(fā)生故障，使用人員應(yīng)立即關(guān)機(jī)觀察，防止事故擴(kuò)大，及時(shí)向?qū)嶒?yàn)室負(fù)責(zé)人或中心負(fù)責(zé)人匯報(bào)，然后通知修理人員組織維修。定期由專業(yè)技術(shù)人員對(duì)儀器、設(shè)備進(jìn)行校驗(yàn)，建立設(shè)備使用檔案。培養(yǎng)基、耗材管理試劑和耗材的訂購應(yīng)選擇國同行公認(rèn)的有資質(zhì)的公司和品牌。培養(yǎng)基管理登記：培養(yǎng)基到貨時(shí)需立即清點(diǎn)、核對(duì)、記錄到貨時(shí)間、試劑名稱、編號(hào)、批號(hào)、數(shù)量、收貨人等，并注明冷藏品到貨時(shí)，包裝和儲(chǔ)存條件是否達(dá)到要求。保存：所有培養(yǎng)液在規(guī)定條件下保存至有效期。試劑分裝后在各分裝容器上做明顯標(biāo)志，標(biāo)明名稱、有效期、分裝時(shí)間，并用封口膜密封容器口。使用前準(zhǔn)備：培養(yǎng)液使用前必須過夜平衡。平衡方法：使用前一天下午根據(jù)需要放入37、6%

8、 CO2培養(yǎng)箱平衡備用；含MOPS的培養(yǎng)基放入不通CO2氣體的37培養(yǎng)箱平衡備用。保質(zhì)期：礦物油及培養(yǎng)基在有效期使用。耗材管理耗材到貨時(shí)需立即清點(diǎn)、核對(duì)，記錄到貨時(shí)間、名稱、編號(hào)、批號(hào)、數(shù)量、收貨人等。使用前必須檢查有效期和包裝是否完好無損，不使用過期用品及包裝破損用品。所有耗材送至實(shí)驗(yàn)室之前，必須用75%乙醇擦拭外包裝，待75%乙醇揮發(fā)后放入物品柜。對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量有疑問時(shí)，立即停止使用并報(bào)告質(zhì)控科。每季度清點(diǎn)各種耗材，及時(shí)補(bǔ)充并合理安排使用。不同批號(hào)的耗材需要通過精子存活試驗(yàn)后方可使用。人精子存活試驗(yàn)使用上游法處理精液，獲得活動(dòng)良好的精子，調(diào)整精子濃度為5106/ml，取0.5ml精子混懸液，在

9、待測(cè)物品中放置一段時(shí)間（35分鐘），如吸管、移液管、針管等在精子混懸液中反復(fù)抽吸后，再放入5ml試管，作為實(shí)驗(yàn)管。另取0.5ml精子混懸液置于另一試管中，作為對(duì)照管。將實(shí)驗(yàn)管和對(duì)照管置于室溫，每24小時(shí)用Makler計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)管及對(duì)照管的活動(dòng)精子比率，并計(jì)算48小時(shí)的生存指數(shù)。生存指數(shù)實(shí)驗(yàn)管精子活動(dòng)率/對(duì)照管精子活動(dòng)率。正常生存指數(shù)應(yīng)大于85%。如果小于85%，應(yīng)考慮可能有細(xì)胞毒素的存在。接觸配子與胚胎的一次性耗材應(yīng)經(jīng)過人精子存活試驗(yàn)，證明無毒方可使用。實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)指標(biāo)的定期回顧總結(jié)每月統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)室的各種數(shù)據(jù)，進(jìn)行分析和檢查。實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量達(dá)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)：受精率：IVF65；ICSI70；卵裂率：90；

10、優(yōu)質(zhì)胚胎形成率：50；冷凍周期率：30-50；卵裂期胚胎冷凍后的復(fù)存活率：90。如沒有達(dá)到上述正常標(biāo)準(zhǔn)，須查找原因，及時(shí)改正。實(shí)驗(yàn)室組織管理和質(zhì)量監(jiān)督實(shí)驗(yàn)室工作人員除進(jìn)行配子的處理和培養(yǎng)外，還要進(jìn)行一系列的常規(guī)質(zhì)控監(jiān)測(cè)，意外事件的詳細(xì)記錄和相應(yīng)對(duì)策的結(jié)果評(píng)估。實(shí)驗(yàn)室管理人員必須按實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量保障體系執(zhí)行，明確實(shí)驗(yàn)室的各個(gè)環(huán)節(jié)，嚴(yán)格遵循質(zhì)量安全程序、標(biāo)準(zhǔn)化的操作方法。應(yīng)定期對(duì)實(shí)驗(yàn)室每位成員進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)督，避免由于儀器、試劑、個(gè)人操作引起的偏差。對(duì)于受主觀因素影響較大項(xiàng)目，應(yīng)該進(jìn)行部質(zhì)量控制檢查，對(duì)實(shí)驗(yàn)室工作人員的操作的準(zhǔn)確性和精確性進(jìn)行評(píng)價(jià)。此外，每個(gè)實(shí)驗(yàn)室工作人員應(yīng)接受醫(yī)學(xué)繼續(xù)教育，學(xué)習(xí)最新的生

11、殖醫(yī)學(xué)知識(shí)。中心常用試劑、耗材一覽表本生殖醫(yī)學(xué)科目前鼠胚實(shí)驗(yàn)常規(guī)使用Vitrolife G5系列培養(yǎng)基。試劑名稱作用貨號(hào)Vitrolife G5系列G-MOPSTMG-MOPSTMPLUS非CO2依賴型培養(yǎng)液在室溫、大氣環(huán)境中處理、操作卵子和胚胎K021893G-IVFTMPLUS洗精、受精液上游、受精K022245G-1TMPLUS卵裂胚培養(yǎng)液原核期、D2、D3胚胎培養(yǎng)K022244G-2TMPLUS囊胚培養(yǎng)液囊胚培養(yǎng)K021890HYASETM，透明質(zhì)酸酶消化、移除卵丘細(xì)胞K000627ICSITM，PVP精子制動(dòng)K043116OVOILTM，培養(yǎng)用石蠟油避免液體揮發(fā)和污染K991351S

12、permRinseTM洗精液精子處理：洗精K000621SpermGradTM梯度離心液精子處理：梯度離心K023403其它試劑Quinns精子冷凍液精子冷凍保護(hù)劑ART-8022SIGMA EBSS緩沖液取卵、移植沖洗液E2888KITAZATO玻璃化冷凍液胚胎冷凍VT101KITAZATO玻璃化解凍液胚胎解凍VT102耗材耗材名稱規(guī)格貨號(hào)Falcon 35mm 培養(yǎng)皿500/case353001Falcon中心井培養(yǎng)皿500/case353037Falcon ICSI皿500/case351006Falcon 5ml試管500/case352003Falcon 14ml試管500/case

13、352001Falcon 15ml離心管500/case352095Falcon 取精杯（樣品杯）100/case354013Falcon 1ml移液管1000/case357521Falcon 2ml移液管1000/case357507Falcon 10ml移液管200/case357551Falcon四孔板100/case353654NUNC四孔板120/case176740SIGMA巴氏吸管25/caseS6143德國HIGENBERG吸管26/caseParafilm封口膜1/case13-374-16Millipore針頭濾器0.22um加藤冷凍葉片10個(gè)/包玻璃化冷凍載桿冷凍用鋁支

14、架MTG16965/6000冷凍套管MTG16912/0133PALL氣瓶濾器0.20m 4251HUMAGEN injection針10/盒MIC-35-30HUMAGEN holding 針10/盒MPH-MED-30COOK ICSI 針10/盒COOK holding 針10/盒BD 1ml注射器100/case300771實(shí)驗(yàn)室應(yīng)急預(yù)案實(shí)驗(yàn)室火、電應(yīng)急預(yù)案實(shí)驗(yàn)室應(yīng)配置滅火器。實(shí)驗(yàn)室的主要設(shè)備，如顯微鏡、培養(yǎng)箱、冰箱等均連接UPS，保證電壓穩(wěn)定，并且在意外斷電情況下可提供68小時(shí)的電力供應(yīng)。設(shè)備緊急故障CO2培養(yǎng)箱：至少三臺(tái)備用，每日監(jiān)測(cè)，一旦出現(xiàn)故障，立即報(bào)修，并暫時(shí)以正常運(yùn)行的培養(yǎng)

15、箱替代故障培養(yǎng)箱。熱臺(tái)：定期檢測(cè)，一旦出現(xiàn)故障，立即報(bào)修。顯微鏡：準(zhǔn)備燈泡與保險(xiǎn)絲的備件，出現(xiàn)故障時(shí)及時(shí)更換。其它故障立即報(bào)修。液氮罐：應(yīng)始終備有狀態(tài)良好的備用液氮罐。對(duì)現(xiàn)用液氮罐進(jìn)行定期檢測(cè)，一旦發(fā)現(xiàn)異常泄漏，立即轉(zhuǎn)移故障罐的胚胎或精子。CO2鋼瓶：定期檢測(cè)氣壓，及時(shí)更換。常備至少一瓶CO2。冰箱：每日監(jiān)測(cè)，一旦出現(xiàn)故障，立即報(bào)修，并立即轉(zhuǎn)移冰箱物品。實(shí)驗(yàn)室環(huán)境按常規(guī)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，溫度由層流空調(diào)機(jī)組調(diào)控，發(fā)生故障立即報(bào)修；若空氣細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果超標(biāo)，立即清潔實(shí)驗(yàn)室，并重新進(jìn)行空氣培養(yǎng)。一次性耗材按常規(guī)進(jìn)行質(zhì)控，一旦出現(xiàn)異常，立即更換批號(hào)。實(shí)驗(yàn)室新人培訓(xùn)計(jì)劃實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員必須具備醫(yī)學(xué)或生物學(xué)專業(yè)本科以

16、上學(xué)歷，并掌握系統(tǒng)的臨床胚胎學(xué)知識(shí)和細(xì)胞培養(yǎng)技能。實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員應(yīng)在衛(wèi)生部批準(zhǔn)的人類輔助生殖技術(shù)培訓(xùn)基地進(jìn)修至少3個(gè)月。理論學(xué)習(xí)：衛(wèi)生部【176】號(hào)文件，人類輔助生殖倫理原則，實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控，基礎(chǔ)分泌、遺傳學(xué)理論，人類卵子、精子發(fā)生生理，精子獲能，IVF、ICSI適應(yīng)癥，卵子形態(tài)與成熟度，胚胎序貫培養(yǎng)系統(tǒng)，精子、胚胎凍融原理，ICSI安全性等。實(shí)踐練習(xí)：練習(xí)拉管、裝針、模擬拾卵、吹打去除顆粒細(xì)胞、少弱精子的分離處理。練習(xí)ICSI 精子制動(dòng)、吸打、定點(diǎn)停位，模擬卵子注射。獨(dú)立工作：在本中心上級(jí)技師督導(dǎo)下完成新人培訓(xùn)計(jì)劃，上級(jí)技師考核達(dá)標(biāo)，方可獨(dú)立工作。胚胎實(shí)驗(yàn)室操作常規(guī)精液處理操作常規(guī)精液樣本采集射

17、出精液標(biāo)本的采集給患者一個(gè)明確的書面或口頭有關(guān)精液采集的指導(dǎo)說明，標(biāo)本采集時(shí)間應(yīng)為禁欲至少兩天，最長不超過七天。精液需經(jīng)手淫法收集到一次性無菌無毒的干燥容器，強(qiáng)調(diào)樣本收集必須完整，確認(rèn)是否取精困難，并告訴患者如何運(yùn)送精液標(biāo)本。護(hù)士核對(duì)患者夫婦、有效證件后，在取精杯杯身及杯蓋上標(biāo)記患者夫婦及病歷號(hào)。待患者取好精液后，護(hù)士與患者丈夫當(dāng)面留取精斑樣本于基因卡上，并填好相關(guān)信息，患者丈夫按指模并在接受助孕夫婦取精認(rèn)證書簽名確認(rèn)后，護(hù)士把標(biāo)本、基因卡及接受助孕夫婦取精認(rèn)證書交給實(shí)驗(yàn)室人員。待精斑晾干后編號(hào)保存兩年，在精液處理記錄本上記錄患者信息，編號(hào)和保存位置。中心任何工作人員發(fā)現(xiàn)患者身份可疑，必須停止

18、接收，重新核實(shí)患者身份，不能同時(shí)接收2份或以上標(biāo)本，如懷疑標(biāo)本混亂，必須停止接收。家中精液樣本的采集對(duì)于除了在自家以外的環(huán)境下取精的確困難者，必須提出書面申請(qǐng)并簽名確認(rèn)，可以在家中進(jìn)行樣本采集。給患者以明確的書面或口頭形式的有關(guān)精液樣本采集和轉(zhuǎn)運(yùn)指導(dǎo)說明，應(yīng)強(qiáng)調(diào)采集樣本必須完整，將已標(biāo)記患者和病歷號(hào)的容器交給患者，應(yīng)在采集后1小時(shí)送到實(shí)驗(yàn)室。精液標(biāo)本不能暴露在過高或過低的溫度中，運(yùn)送途中樣本應(yīng)該保持在2037的環(huán)境中。用避孕套采集樣本對(duì)于通過手淫法采集精液困難者，則采用特制的避孕套通過性交法獲取精液。告知患者使用避孕套方法以及如何將樣本轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，應(yīng)記錄樣本采集的時(shí)間，應(yīng)在采集后1小時(shí)送到實(shí)

19、驗(yàn)室。精液標(biāo)本不能暴露在過高或過低的溫度中，運(yùn)送途中樣本應(yīng)該保持在2037的環(huán)境中。報(bào)告中應(yīng)注明樣本的采集是在利用避孕套通過性交法獲取的及采集地點(diǎn)一定不可以使用普通避孕套收集精液，應(yīng)為它一般含有干擾精子活力的成分（Jones 等，1986）精液標(biāo)本分析精液液化精液取出后室溫液化15分鐘到30分鐘，用吸管或者在顯微鏡中觀察檢查精液是否完全液化，在家中或利用避孕套采集的樣本通常在送達(dá)實(shí)驗(yàn)室時(shí)已液化。精液液化延遲的處理，如果60分鐘精液仍未液化，加入等量的含有蛋白的G-IVF再機(jī)械吹打以幫助液化，至精液完全液化再進(jìn)行常規(guī)分析和處理。精液外觀正常精液液化后呈均質(zhì)，灰白，精子密度非常低者可顯得透明。如有

20、紅細(xì)胞，精液可呈現(xiàn)紅褐色，病人如有黃疸或服用某些維生素，精液可呈現(xiàn)黃色。精液體積采用直接測(cè)量法測(cè)量精液的體積，精確到0.1ml顯微鏡鏡下精液的分析完全液化的精液，取10ul滴于Makler計(jì)數(shù)板停留1分鐘，顯微鏡評(píng)價(jià)精子的相關(guān)指標(biāo)。觀察精液的粘液絲，精子的凝集及非精子細(xì)胞（包括上皮細(xì)胞，圓形細(xì)胞及斷裂的精子頭或尾部）評(píng)估精子的密度評(píng)估精子的活力和活率（WHO第5版SOP）精液處理操作常規(guī)精液的參數(shù)和來源決定應(yīng)該選擇何種精子制備方法精子特征處理方法射出精液濃度5106/ml且PR精子15%雙層梯度離心+洗滌后上游法1106/ml濃度5106/ml濃度5106/ml且PR精子15%雙層梯度離心法附

21、睪取出精，精子數(shù)1106/ml且PR精子15%微量梯度離心法射出精液濃度1106/ml附睪取出精1106/ml睪丸精子標(biāo)本直接離心洗滌法密度梯度法參數(shù)可以根據(jù)不同標(biāo)本的特征來修改是方法發(fā)到最優(yōu)化，如：減少梯度體液體體積即減少精子需要移動(dòng)的距離從而可以提高獲得正常精子的數(shù)量；對(duì)于高粘度的標(biāo)本，可以增加離心和和離心時(shí)間。每一患者準(zhǔn)備洗精培養(yǎng)基G-IVF Plus兩管，每管3ml，提前一天配制好，置37、6% CO2培養(yǎng)箱平衡。準(zhǔn)備90%密度梯度離心液、45%密度梯度離心液各1ml，使用前配好并在1小時(shí)使用。巴斯德吸管在火焰上滅菌，再把吸管尖燒成圓鈍，冷卻后待用；15ml 錐形離心管（配置梯度離心液

22、）和5ml的圓底試管（上游法）上標(biāo)上患者夫婦的。根據(jù)選擇的方法，準(zhǔn)備試劑和耗材進(jìn)行精液樣本處理。4.1雙層梯度離心法加1.0ml 45%密度梯度離心液于15ml無菌的圓錐底試管中。緩慢加1.0ml90%密度梯度離心液于45%密度梯度離心液底部，保持兩種液體的界面。將已液化的精液輕輕加于梯度離心液之上，300g離心15分鐘。去上清，剩余精子沉淀約0.5ml，將其加入3ml G-IVF Plus中吹打混勻。200g離心5分鐘。棄上清，剩余約0.2ml沉淀。加入適量G-IVF Plus重懸沉淀，計(jì)數(shù)精子濃度、活力等情況，并記錄。置37、6% CO2培養(yǎng)箱待用。雙層梯度離心法+上游法雙層梯度離心法同前

23、面的步驟（1）-（5）。去上清，留下最下層的精子沉淀約0.5ml，打散混勻。0.5mlG-IVF Plus加入5ml的圓底試管中，將精子沉淀物打散混勻后緩慢加入圓底試管的底部，松開蓋子，45度傾斜放置在試管架上，置37、6% CO2培養(yǎng)箱中孵育上游30分鐘。取上層液體，顯微鏡下觀察并記錄處理后的精子濃度、活力，松開蓋子，置37、6% CO2培養(yǎng)箱待用。微量梯度離心法加0.5ml 45%密度梯度離心液于15ml無菌的圓錐底試管中。緩慢加0.5ml90%密度梯度離心液于45%密度梯度離心液底部，保持兩種液體的界面。加入已液化好的精液，如果精液體積較多而精子數(shù)較少時(shí)再多加一管梯度離心液分離精子。加精

24、液時(shí)應(yīng)慢慢沿著管壁滴入，精液避免與梯度離心液混合，和梯度液之間要有明顯分層。后續(xù)步驟同雙層梯度離心法的步驟（3）-（5）。去上層液體，加入適量G-IVF Plus重懸沉淀，顯微鏡下觀察并記錄處理后的精子濃度、活力，松開蓋子，置37、6% CO2培養(yǎng)箱待用。直接離心洗滌法精液標(biāo)本充分液化。以1：2（精液：培養(yǎng)液）的體積比例，稀釋精液標(biāo)本。把稀釋的精液標(biāo)本放入離心管，每管不超過4ml。300g，離心10分鐘。棄去上層液體。把精子混懸液分散在1ml的培養(yǎng)液中。200g，離心5分鐘。再次棄去上層液體。輕輕吹打，把精子沉淀重新懸浮在適量培養(yǎng)液中。顯微鏡下觀察并記錄處理后的精子濃度、活力，松開蓋子，置37

25、、6% CO2培養(yǎng)箱待用。（四）精液冷凍操作常規(guī)對(duì)于部分取精困難，或者因其他原因未能在取卵當(dāng)日取得精液患者，可采取提前冷凍精液于液氮中的方法將標(biāo)本保存以作為取卵日備用，以免耽誤取卵日授精時(shí)機(jī)。1. 試劑和耗材準(zhǔn)備 QUEENS精液冷凍保護(hù)劑復(fù)溫至室溫，精液冷凍支架，巴斯德吸管在火焰上滅菌，再把吸管尖燒成圓鈍，冷卻后待用；2. 步驟患者按照精液樣本的采集方法留取精液后，置37培養(yǎng)箱中液化。待精液充分液化后，按照WHO標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行精液檢查，包括精液量、顏色、氣味、pH值、液化情況、精子密度、活動(dòng)率、精子動(dòng)力以及細(xì)胞等情況，并認(rèn)真做好實(shí)驗(yàn)室記錄。將精液加入試管中，按照1：1的比例緩慢加入復(fù)溫的冷凍保護(hù)劑

26、，邊加邊混勻，充分混勻精液與冷凍保護(hù)劑。將混勻后的液體分裝至冷凍管，在冷凍管上做好標(biāo)記并將冷凍管裝上已編號(hào)的冷凍支架。將冷凍支架放置在距離液氮面15cm的液氮蒸氣中，保持1020分鐘。將冷凍支架投入液氮，凍存。將精液冷凍患者的信息，精液分析結(jié)果，及冷凍位置及編號(hào)詳細(xì)記錄于精液冷凍登記本。精液復(fù)操作常規(guī)試劑和耗材準(zhǔn)備精液處理的常規(guī)試劑盒耗材，37攝氏度水浴鍋，溫度計(jì)等步驟查找需要復(fù)的精液標(biāo)本，從液氮罐中取出標(biāo)本，核對(duì)凍存管上的信息。將精液標(biāo)本放置于提前加熱的37攝氏度水浴鍋中15分鐘左右。將標(biāo)本管打開，取10l樣本涂片，生物顯微鏡觀察并記錄。根據(jù)復(fù)后精子的活動(dòng)力和精子密度，選擇相應(yīng)的處理方法。復(fù)

27、后的精液信息需在精液冷凍登記本中進(jìn)行標(biāo)記，包括復(fù)時(shí)間，精子的活力，密度及用途。（六）逆行射精病人的尿液處理操作常規(guī)一些患者在射精過程中精子會(huì)逆行到膀胱里，從而導(dǎo)致了無精子癥或者沒有明顯射精現(xiàn)象。射精后尿液檢查中發(fā)現(xiàn)精子就可以確診逆行射精。當(dāng)藥物治療不能達(dá)到目的時(shí)，有必要從尿液中提取精子。患者在取精24小時(shí)之前服用小打片。常用劑量是每天4次，每次4片（1g/片）。其作用使尿液呈堿性，精子更易存活。在取卵的當(dāng)天早上，患者應(yīng)該在起床排空尿后，在取精的前2-3小時(shí)，再服用小打片2片（1g/片）喝500-1000ml水，如此能夠最大限度降低尿液的滲透壓。標(biāo)本采集和接收按照精液標(biāo)本采集與接收操作規(guī)程執(zhí)行。

28、用手淫的方法往精液杯子射精。射精后，患者及時(shí)排尿于無菌的取精杯中，并將射出的精液和尿液同時(shí)送精液處理室。精液和尿液樣本都需要進(jìn)行分析。由于尿量很多，所以需要500g離心10分鐘。離心后的逆行射精樣本若有精子，按照射出精液處理操作規(guī)程進(jìn)行。PESA精子處理操作常規(guī)每一患者準(zhǔn)備洗精培養(yǎng)基 G-IVF Plus兩管，每管3ml，提前一天配制好，置37、6% CO2培養(yǎng)箱平衡。準(zhǔn)備90%密度梯度離心液、45%密度梯度離心液各1ml，使用前配好并在1小時(shí)使用。術(shù)前，實(shí)驗(yàn)室為男醫(yī)科生準(zhǔn)備1管預(yù)平衡的G-IVF Plus和2-4支5ml圓底試管。把巴斯德吸管在酒精燈上滅菌，再把吸管尖燒成圓鈍，冷卻后待用，并

29、連同15ml錐形離心管、5ml圓底試管一起標(biāo)上患者的。實(shí)驗(yàn)室人員和臨床醫(yī)生同時(shí)核對(duì)患者及其妻子，在附睪、睪丸取精/活檢手術(shù)記錄上簽名。附睪穿刺手術(shù)中，實(shí)驗(yàn)室人員用移液器吸取少量送檢的附睪抽吸液涂于無菌Falcon3001培養(yǎng)皿，在顯微鏡下觀察是否有精子；如發(fā)現(xiàn)有活精子，精子數(shù)目足夠ICSI，通知男科醫(yī)生結(jié)束手術(shù)；如未見足量精子，重復(fù)上述操作。反復(fù)穿刺未果，由臨床醫(yī)生決定是否改行TESA。精子數(shù)目1106，PR精子15%的附睪穿刺液，可以用微量梯度離心法進(jìn)行處理。精子數(shù)目少的附睪穿刺液可以用直接離心洗滌法進(jìn)行處理，處理好的精子在鏡下觀察并記錄，松開蓋子，置37、6% CO2培養(yǎng)箱待用。完成相應(yīng)的

30、實(shí)驗(yàn)室記錄和病歷。TESA精子處理操作常規(guī)術(shù)前一天準(zhǔn)備4管G-IVF Plus，每管3ml，置37、6% CO2培養(yǎng)箱平衡。術(shù)前，為臨床醫(yī)生準(zhǔn)備2個(gè)加3ml G-IVF Plus 的Falcon3001皿，2個(gè)1ml的注射器。實(shí)驗(yàn)室人員和臨床醫(yī)生同時(shí)核對(duì)患者及其妻子，在附睪、睪丸取精/活檢手術(shù)記錄上簽名。用無菌巴斯德吸管在火焰上滅菌，再把吸管尖燒成圓燉，冷卻后待用，并連同15ml、5ml的圓底試管標(biāo)上患者的。睪丸穿刺前準(zhǔn)備一個(gè)小皿，加入2ml G-IVF Plus給醫(yī)生。準(zhǔn)備兩個(gè)1ml的注射器和兩個(gè)小皿，加入2ml的G-IVF Plus。臨床醫(yī)生從睪丸中抽吸出曲細(xì)精管放于盛有G-IVF Plu

31、s的Falcon3001皿中，送實(shí)驗(yàn)室。用平衡好的G-IVF Plus至少洗滌一次后，將曲細(xì)精管移在另一有G-IVF Plus的Falcon3001皿中，在體視鏡下，用兩個(gè)注射器針頭，劃開曲細(xì)精管，在倒置顯微鏡下觀察是否有精子。若精子數(shù)量能夠滿足臨床應(yīng)用，通知男科醫(yī)生結(jié)束手術(shù)。將有精子標(biāo)本的Falcon3001皿置室溫培養(yǎng)箱孵育2h。將睪丸組織混懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，靜置2分鐘，用巴斯德吸管將大塊組織移走，300g離心5分鐘，去上清，留取0.10.2ml沉渣，混勻松蓋后置37、6%CO2培養(yǎng)箱，備用。完成相應(yīng)實(shí)驗(yàn)室記錄和病歷。撿卵操作常規(guī)撿卵前配液準(zhǔn)備配液在取卵前一天進(jìn)行。卵泡沖洗培養(yǎng)液（G-M

32、OPSTM）：取G-MOPSTM10ml放入圓底試管（Falcon 2001）中，加入肝素300IU/100ml，緊蓋后置37培養(yǎng)箱中平衡過夜，備用。撿卵皿的準(zhǔn)備：吸取G-MOPS Plus3ml培養(yǎng)液加入培養(yǎng)皿（Falcon 3001）蓋礦物油2ml，每個(gè)患者準(zhǔn)備2個(gè)，放在不通CO2氣體、37培養(yǎng)箱過夜平衡。洗卵液的準(zhǔn)備：吸取3mlG-IVF Plus培養(yǎng)基放入圓底試管（Falcon 2001）中，每個(gè)患者準(zhǔn)備2管，置37、6% CO2培養(yǎng)箱平衡。受精皿的準(zhǔn)備：準(zhǔn)備四孔板，每孔加入受精培養(yǎng)液（G-IVF Plus）800l，蓋礦物油0.5ml，準(zhǔn)備的四孔板個(gè)數(shù)依據(jù)各個(gè)患者的卵泡數(shù)估算，8個(gè)準(zhǔn)

33、備一塊四孔板，8-16個(gè)準(zhǔn)備2塊四孔板，依此類推，放置37、6% CO2培養(yǎng)箱平衡。如為ICSI授精方式，準(zhǔn)備卵裂液培養(yǎng)皿：用G1 Plus做成10個(gè)微滴，每滴25l，蓋礦物油3.0ml，每個(gè)患者準(zhǔn)備數(shù)目參照四孔板數(shù)，置于37、6% CO2培養(yǎng)箱平衡。撿卵根據(jù)患者卵泡數(shù)目，在IVF工作站臺(tái)面上預(yù)熱一定數(shù)量Falcon 3003培養(yǎng)皿。檢查實(shí)驗(yàn)室記錄單上患者的，并與患者和臨床醫(yī)生當(dāng)面核對(duì)，確保無誤。檢查已平衡好的培養(yǎng)液，包括沖管液，洗卵培養(yǎng)液和受精培養(yǎng)液。收集在試管的卵泡液倒入Falcon 3003培養(yǎng)皿，形成一薄層液體，輕輕振蕩，迅速掃描卵冠丘復(fù)合物（OCCC）的存在，用巴斯德吸管吸起后在解剖

34、顯微鏡下確認(rèn)。典型的OCCC用肉眼可看到，為灰色透亮的粘液團(tuán)，中央見到的小的白點(diǎn)為卵母細(xì)胞和放射冠，通常直徑在2-4mm大小。在體視鏡下（20-50倍）觀察，確診粘液團(tuán)是否有卵母細(xì)胞存在，如有OCCC附于血凝塊上，可直接用巴斯德吸管分離。將選出的卵子先置于撿卵皿中暫存。取出平衡好的洗卵液加入已預(yù)溫的小培養(yǎng)皿中（Falcon 3001）；更換巴氏吸管，將撿卵皿中的卵子轉(zhuǎn)入洗卵皿中洗滌2次，再轉(zhuǎn)移至受精皿中，每孔不超過3枚卵子，立即將受精皿置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)。在記錄表上記錄取卵情況及卵子所放置培養(yǎng)箱編號(hào)，并在培養(yǎng)箱貼上標(biāo)簽。為保持卵母細(xì)胞的活性，應(yīng)盡可能縮短卵子暴露在培養(yǎng)箱外的時(shí)間，要求整個(gè)操作過程必

35、須無菌、快速，并注意避光，溫度維持于37，以盡量減少培養(yǎng)液的pH值和滲透壓變化。取卵過程如發(fā)現(xiàn)異常，如未見卵母細(xì)胞，獲取數(shù)明顯少于卵泡數(shù)，及時(shí)與醫(yī)生溝通。撿卵結(jié)束后，粗略評(píng)估卵母細(xì)胞的質(zhì)量和成熟度，確定合適的授精時(shí)間，通常需培養(yǎng)3-6小時(shí)。體外授精操作常規(guī)體外授精授精前提前30分鐘打開恒溫操作臺(tái)進(jìn)行預(yù)熱，將圓底加熱試管架放置于臺(tái)面同時(shí)加熱，使溫度穩(wěn)定在37左右。hCG后39-40小時(shí)，取卵后4-6小時(shí)進(jìn)行IVF授精。從培養(yǎng)箱中拿出處理后孵育的精子懸液的小圓底試管，輕輕搖晃混勻，放置于圓底加熱試管架上，用移液器取10l滴于Marker計(jì)數(shù)板，生物顯微鏡下觀察精子的濃度、活動(dòng)力。根據(jù)受精前的精子活

36、力和精子形態(tài)決定是否增加或減少所加精子的量。通常用于授精的精子終濃度為1105/ml。從培養(yǎng)箱拿出受精皿，雙人核對(duì)皿上標(biāo)記的和小圓底試管上所標(biāo)記的名字是否一致，在顯微鏡下觀察卵子的情況和核對(duì)卵子的數(shù)目。用移液器吸出適量精子，在遠(yuǎn)離卵子處將精子懸液加入受精皿。將受精皿置37、6% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。及時(shí)完善實(shí)驗(yàn)室記錄。IVF受精卵脫顆粒細(xì)胞卵子脫顆粒細(xì)胞的前一日，根據(jù)取卵數(shù)目準(zhǔn)備卵裂液培養(yǎng)皿。卵裂液培養(yǎng)皿：用G1 Plus在Falcon 300l小皿中做10個(gè)液滴，中間兩滴用于清洗，每滴25l，蓋上礦物油3.0ml，置于37、6% CO2培養(yǎng)箱平衡過夜。提前30分鐘打開恒溫操作臺(tái)預(yù)熱，將圓

37、底加熱試管架放置于臺(tái)面同時(shí)加熱，使溫度穩(wěn)定在37左右。脫顆粒針的拉制：取兩根巴期德吸管煅燒拉細(xì)成微吸管，一根稍粗，口徑約為200m；另一根稍細(xì)，口徑約為140m。要求端口平齊并鈍化。用稍粗的巴斯德吸管將卵子轉(zhuǎn)移到剝卵皿液滴，再用稍細(xì)的巴斯德吸管吹吸受精卵數(shù)次，盡量除去顆粒細(xì)胞直至可清晰觀察受精卵。把卵子轉(zhuǎn)移到剝卵皿液滴，先用微吸管吹吸受精卵2-3次，盡量除去顆粒細(xì)胞直至可清晰觀察受精卵。從培養(yǎng)箱取出準(zhǔn)備好的卵裂培養(yǎng)液微滴的皿，標(biāo)記患者和皿號(hào)，和另一個(gè)工作人員核對(duì)無誤。用另一根微吸管將所有已脫顆粒的受精卵轉(zhuǎn)移到卵裂皿中央液滴洗滌2-3次后轉(zhuǎn)移至周圍的液滴中。受精觀察：將裝有受精卵的培養(yǎng)皿放在倒置

38、顯微鏡下，觀察原核。卵胞漿單精子注射（ICSI）ICSI實(shí)驗(yàn)室指征嚴(yán)重的少、弱、畸形精子癥重度少精子癥：1106/ml射出的精液中精子密度5106/ml；重度弱精子癥：1%前向運(yùn)動(dòng)精子（PR）10%；重度畸形精子癥：1%正常形態(tài)精子2%；極度少精子癥：精子密度1106/ml；極度弱精子癥：前向運(yùn)動(dòng)精子（PR）1%；極度畸形精子癥：正常形態(tài)精子1%。PESA/TESA獲得的精子；常規(guī)IVF受精失?。ǔ墒炻炎邮芫实陀?0%）。培養(yǎng)液準(zhǔn)備：按每個(gè)剝卵用培養(yǎng)皿處理8個(gè)左右卵子，每個(gè)培養(yǎng)皿需要4mlG-MOPS Plus。取卵前一天下午根據(jù)卵泡數(shù)量準(zhǔn)備剝卵用培養(yǎng)液G-MOPS Plus，加入Falco

39、n 2001圓底試管中，蓋緊蓋子，放在37培養(yǎng)箱平衡。另準(zhǔn)備2個(gè)卵裂液培養(yǎng)皿：用G1 Plus做成10個(gè)微滴，每滴25l，中間兩個(gè)滴用于清洗，蓋礦物油，置37、6% CO2培養(yǎng)箱平衡。提前30分鐘打開恒溫操作臺(tái)，將圓底加熱試管架放置于臺(tái)面同時(shí)加熱，使溫度穩(wěn)定在37左右。取卵后2-4小時(shí)對(duì)卵子進(jìn)行脫顆粒細(xì)胞操作。準(zhǔn)備一個(gè)四孔皿，在第一孔中加入配制好的透明質(zhì)酸酶0.5ml，其余三孔加入平衡好的G-MOPS Plus各1ml，在37培養(yǎng)箱孵育15分鐘。脫顆粒針的拉制：取1根巴斯德吸管，保持原口徑，煅燒鈍化端口。再取3根巴期德吸管煅燒拉細(xì)成微吸管，2根稍粗，口徑約為200m；第3根稍細(xì)，口徑約為140

40、m。要求端口平齊并鈍化。用原口徑巴斯德吸管將不多于8個(gè)OCCC移入含透明質(zhì)酸酶的孔中沖洗吸打30-60秒，至外層顆粒細(xì)胞脫去后，用稍粗口徑吸管將卵子移入G-MOPS Plus中。換稍細(xì)口徑吸管繼續(xù)吹打，以去除剩余的顆粒細(xì)胞層，再改換新的稍粗口徑吸管將卵子移入G-MOPS Plus中洗滌，再轉(zhuǎn)移至已預(yù)平衡過的G-1 Plus微滴皿中，置37、6% CO2培養(yǎng)箱中備用。準(zhǔn)備ICSI操作皿（Falcon 1006）：在皿底和皿蓋標(biāo)記好患者。中間做三個(gè)圓形的PVP滴，每滴7l；左方用7l PVP劃寫一個(gè)橢圓；右方用平衡后的G-MOPSTM Plus做數(shù)個(gè)7l的液滴；如下圖所示。在雙人核對(duì)下，在橢圓的P

41、VP邊緣加入微量處理過的精子，覆蓋已平衡過的礦物油，置37培養(yǎng)箱備用。安裝、調(diào)節(jié)顯微注射系統(tǒng)：打開顯微鏡、顯微操作系統(tǒng)及載物臺(tái)熱臺(tái)，確保所有操作控制都恢復(fù)至原有的可控操作，可以平穩(wěn)、舒適地進(jìn)行操作。安裝持卵針和注射針時(shí)，應(yīng)避免注射針管道系統(tǒng)中有氣泡。在4物鏡下調(diào)整持卵針和注射針，依次調(diào)節(jié)其角度與位置，使兩者針頭相對(duì)并與載物臺(tái)平行，前后左右移動(dòng)操作針，10、20物鏡下檢查所操作針的移動(dòng)圍。將持卵針和注射針升高，確保操作臺(tái)與熱臺(tái)之間的高度能夠輕松放置操作皿而不碰及操作針。在雙人核對(duì)下，將已選好的M卵轉(zhuǎn)入ICSI操作皿的G-MOPSTM Plus微滴，每滴1個(gè)。將盛有卵子的操作皿放置于調(diào)好的顯微鏡操

42、作儀的熱臺(tái)上；10物鏡下調(diào)節(jié)顯微鏡焦距使操作皿微滴的邊緣清晰可見。將注射針降入ICSI操作皿的PVP液滴中，調(diào)節(jié)顯微鏡使注射針清晰可見，同時(shí)吸入少量PVP進(jìn)入注射針。精子制動(dòng)：將注射針移入含有精子的條形PVP液滴中，在微滴上端選擇形態(tài)、活力正常的精子吸入注射針，轉(zhuǎn)入另一PVP微滴，將精子放置于操作皿底部。將注射針在精子尾部中段或下段輕壓，迅速回拉注射針，劃過精子，使其制動(dòng)。將精子先尾后頭吸入注射針，然后將注射針轉(zhuǎn)入卵子的G-MOPSTM Plus微滴中。卵胞漿單精子注射：降下持卵針，并輕撥動(dòng)卵子，使第一極體位于12點(diǎn)或6點(diǎn)位置，固定卵子。調(diào)節(jié)顯微操作針和卵膜至同一水平面，將精子推至注射針尖處，

43、于3點(diǎn)鐘處垂直穿過透明帶并繼續(xù)進(jìn)針，至卵中心或越過中心位置（卵母細(xì)胞直徑的50-75%），輕微回吸注射針，當(dāng)胞漿和精子出現(xiàn)快速返流的過程，指示卵膜已破，停止回吸，將精子緩慢注入卵子胞質(zhì)，緩慢退出注射針。退出注射針后，調(diào)節(jié)持卵針負(fù)壓，釋放卵子。重復(fù)上述步驟至所有的成熟卵子都注射完畢，將ICSI皿從顯微鏡熱板轉(zhuǎn)移至解剖鏡下，從培養(yǎng)箱取出卵裂培養(yǎng)皿，每個(gè)卵子在培養(yǎng)皿中央兩個(gè)液滴中漂洗數(shù)次，再轉(zhuǎn)移至旁邊微滴中放回培養(yǎng)箱。注意事項(xiàng)將精子和卵子加入操作皿中都必須雙人核對(duì)皿上的患者、精子、卵子的標(biāo)記，并簽名確認(rèn)。ICSI操作皿制備要快速，同一時(shí)間只能準(zhǔn)備1個(gè)皿，要避免微滴蒸發(fā)脫水，臨近ICSI操作時(shí)準(zhǔn)備。盡

44、量減少PVP注射入卵子中。用注射針制動(dòng)精子要避開其頸部。精子注射進(jìn)入胞漿的深度約為卵子直徑的50-75%。ICSI操作時(shí)動(dòng)作要輕柔快速，從制動(dòng)精子至精子被注入一枚卵子胞質(zhì)中的時(shí)間宜控制在3分鐘。卵子與胚胎評(píng)分系統(tǒng)卵子評(píng)分卵冠丘復(fù)合物評(píng)分：級(jí)：這級(jí)卵子通常為不成熟或退化的卵子，有的是異常卵子。卵細(xì)胞呈淺透明狀，放射冠完全沒有分開，卵丘細(xì)胞緊密排列，顏色偏淺或卵丘細(xì)胞團(tuán)很小。級(jí)：這級(jí)卵子通常為接近成熟的卵子。卵細(xì)胞外觀顏色較深，放射冠已呈不同程度的分散，卵丘細(xì)胞排列變稀松，顏色變淺。級(jí)：這級(jí)卵子通常為成熟卵。卵細(xì)胞外觀顏色偏深，形態(tài)為規(guī)則的圓形，放射冠呈完全分散狀，卵丘細(xì)胞團(tuán)通常較大，排列松散，顏

45、色很淡。級(jí)：這級(jí)卵子通常為過熟卵子。卵細(xì)胞顏色變深，放射冠分散，但外周的卵丘細(xì)胞團(tuán)很小或缺失。卵細(xì)胞成熟度的判斷MII期卵子：細(xì)胞核的結(jié)構(gòu)消失，第一極體已排出。此時(shí)胞漿中看不到細(xì)胞核的結(jié)構(gòu)，在卵黃間隙中可見第一極體。MI期卵子：細(xì)胞核的結(jié)構(gòu)消失，但第一極體尚未排出。在此階段的卵子中既看不到細(xì)胞核也看不到第一極體。GV期卵子：外觀顏色清淡，細(xì)胞核的結(jié)構(gòu)尚未消失，在此階段的卵子胞漿中可看見細(xì)胞核結(jié)構(gòu)。ICSI破膜方式A：破膜順利。胞質(zhì)回吸后在透明帶附近破膜。B：破膜困難。胞質(zhì)回吸后明顯超過透明帶才發(fā)生破膜。C：無彈性。注射針刺入卵子后，卵子無明顯變形，破膜感覺不明顯。受精卵評(píng)分正常受精卵（2PN）

46、：表現(xiàn)為胞質(zhì)有兩個(gè)原核，可見第二極體。根據(jù)兩原核的大小、形態(tài)、核仁數(shù)目、大小和分布等，分為Z1-Z4級(jí)。Z1級(jí)：每個(gè)原核核仁數(shù)3-7個(gè)，核仁在原核相交處排列成線；Z2級(jí)：原核大小相等，但核仁不成線排列在原核相交處；Z3級(jí)：兩原核特征不同，核仁的大小、數(shù)目不等，不排列在原核相接處；Z4級(jí)：原核大小明顯不等，原核相離。異常受精卵多PN、1PN或者卵質(zhì)沒有原核，此類受精卵不適合進(jìn)行移植。原核的出現(xiàn)和消失是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程，不同的時(shí)間評(píng)估可能會(huì)有不同的結(jié)果。應(yīng)在相對(duì)固定的時(shí)間授精（取卵后3-6小時(shí)），相對(duì)固定的時(shí)間觀察原核（授精后16-20小時(shí)），并記錄好這兩個(gè)時(shí)間。卵裂期胚胎評(píng)分I級(jí)：細(xì)胞大小均勻，形狀

47、規(guī)則；胞質(zhì)均勻清晰，沒有顆?，F(xiàn)象；碎片在05之間。II級(jí)：細(xì)胞大小略不均勻，形狀略不規(guī)則；胞質(zhì)可有顆?，F(xiàn)象；碎片在620之間。III級(jí)：細(xì)胞大小明顯不均勻，可有形狀的明顯不規(guī)則；胞質(zhì)可有明顯顆?，F(xiàn)象；碎片在2150之間。IV級(jí)：細(xì)胞大小嚴(yán)重不均勻，胞質(zhì)可有嚴(yán)重顆?，F(xiàn)象；碎片在50以上。囊胚的評(píng)分分期1期：早期囊胚，囊胚腔不到整個(gè)胚胎的1/2。2期：囊胚腔超過了胚胎體積的1/2。3期：擴(kuò)囊胚，囊胚腔完全占據(jù)胚胎的總體積。4期：囊胚腔完全充滿胚胎，胚胎總體積變大。5期：正在孵出囊胚，滋養(yǎng)外胚層通過透明帶向外凸出。6期：孵出囊胚完全從透明帶孵出。3-6期囊胚再評(píng)估項(xiàng)目細(xì)胞團(tuán)：A：包裹緊密，大量細(xì)胞B

48、：結(jié)構(gòu)松散，少量細(xì)胞C：極少量細(xì)胞滋養(yǎng)外胚層：A：許多細(xì)胞形成緊密結(jié)合的上皮B：少量細(xì)胞形成結(jié)構(gòu)松散的上皮C：極少量細(xì)胞解凍胚胎的評(píng)分解凍后所有卵裂球存活的胚胎，按新鮮胚胎的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分；解凍后如有卵裂球死亡，則僅記錄存活的卵裂球數(shù)，不再進(jìn)行評(píng)分；凍融胚胎一半以上卵裂球存活，胚胎可判斷為存活，可用于移植。注意事項(xiàng)觀察過程應(yīng)迅速，盡量減少胚胎在培養(yǎng)箱外暴露的時(shí)間。在實(shí)驗(yàn)室記錄上記錄每個(gè)胚胎的情況。原核的觀察在受精后的16-20小時(shí)進(jìn)行，D2胚胎觀察在受精后的40-44小時(shí)進(jìn)行，D3胚胎觀察在受精后的64-68小時(shí)進(jìn)行，D5胚胎觀察在受精后112-116小時(shí)進(jìn)行。優(yōu)質(zhì)胚胎定義Day1為2pn；

49、Day2（授精后40-44小時(shí)）：25細(xì)胞，碎片 20，大小比較均勻；Day3（授精后64-68小時(shí)）：6-10細(xì)胞，碎片 20，大小比較均勻；Day5-6（授精后112-140小時(shí)）：3BB及以上。胚胎移植實(shí)驗(yàn)室操作常規(guī)移植前一天根據(jù)需要進(jìn)行胚胎移植的患者個(gè)數(shù)準(zhǔn)備移植皿，在Falcon 3037胚胎移植皿外圈加入G1 Plus或G2 Plus 3ml，置37、6% CO2培養(yǎng)箱過夜平衡。將移植液根據(jù)每例移植500l的量加入Falcon 2001圓底試管中，置37、6% CO2培養(yǎng)箱過夜平衡。在使用的當(dāng)天早上，準(zhǔn)備當(dāng)天移植用的皿（Falcon 3037），將移植皿寫上患者的，皿中孔加500l已

50、平衡好的G1 Plus或G2 Plus培養(yǎng)液，置37、6% CO2培養(yǎng)箱平衡30分鐘后才能移入胚胎。選擇移植胚胎的原則移植胚胎的數(shù)量嚴(yán)格執(zhí)行衛(wèi)生部規(guī)定，35歲以下患者不超過2個(gè)，35歲及以上患者以及多次IVF失敗的患者可以一次移植3個(gè)胚胎。移植囊胚不超過2個(gè)。胚胎移植后若有剩余胚胎，應(yīng)征求患者對(duì)剩余胚胎的處理意見并簽署配子與胚胎去向知情同意書。對(duì)于適合冷凍的剩余胚胎，鼓勵(lì)患者作胚胎冷凍保存。采用連續(xù)評(píng)分法挑選，即綜合原核評(píng)分和胚胎形態(tài)評(píng)分，挑選形原核評(píng)分高、形態(tài)好、碎片少、無空泡的優(yōu)質(zhì)胚胎進(jìn)行移植。通常D2選擇2-5細(xì)胞，D3選擇6-10細(xì)胞。在D5-6，選擇囊腔擴(kuò)充滿，細(xì)胞團(tuán)致密、細(xì)胞數(shù)多，

51、滋養(yǎng)層細(xì)胞數(shù)目多的胚胎。卵裂球數(shù)和質(zhì)量相同的胚胎中，選擇透明帶薄、色澤正常的胚胎進(jìn)行移植。ET操作步驟核對(duì)好患者，將待移植胚胎轉(zhuǎn)入已準(zhǔn)備好的ET皿中。從培養(yǎng)箱中取出ET皿，將ET管接上1ml注射器，來回抽吸空氣，潤滑注射器，然后回吸至注射器0.03ml整刻度處吸取0.5cm 長的移植液，再將移植管抬出液面，再吸取0.5cm長的空氣，然后在顯微鏡下將移植管伸入移植皿胚胎旁邊，吸取少量移植液后再吸取胚胎，此段約長2cm（約10l）,確認(rèn)胚胎裝入移植管中，再吸取0.2cm長的空氣，最后把移植管頭在移植液中輕點(diǎn)封管，即裝管完畢。將裝好胚胎的移植管平穩(wěn)的拿到臨床手術(shù)室，再次核對(duì)患者夫婦，確認(rèn)無誤后緩慢的

52、插入外管，配合臨床醫(yī)生在B超引導(dǎo)下調(diào)整管尖位置使之距離宮底1-1.5 cm處，調(diào)整好后，緩慢平穩(wěn)的推動(dòng)注射器，將管胚胎及移植液注入患者子宮，注射器推至末端，停留30秒后退出外管。a：0.1cm培養(yǎng)基；b：0.2cm空氣；c：約2cm含胚胎的培養(yǎng)基；d：0.5cm空氣； f：0.5cm 培養(yǎng)基在顯微鏡下檢查胚胎殘留情況，若無胚胎殘留，盡快通知臨床醫(yī)生，同時(shí)告知護(hù)士移植管黏液和血塊情況。如果有胚胎殘留，必須用一根干凈的移植管重新裝入，重新移植。填寫移植單的移植情況，移植者和核對(duì)者簽名。注意事項(xiàng)如果在移植過程出現(xiàn)困難移植導(dǎo)致時(shí)間過長，需將胚胎重新放回移植皿中，直至臨床醫(yī)生確認(rèn)能夠安全的將胚胎移入子宮后再行移植。實(shí)驗(yàn)室胚胎移植者和核對(duì)者必須雙人核對(duì)，認(rèn)真檢查胚胎、培養(yǎng)皿的標(biāo)記、記錄情況和移植患者的一致性。囊胚培養(yǎng)囊胚培養(yǎng)皿準(zhǔn)備：受精后第2天準(zhǔn)備囊胚培養(yǎng)皿，使用G-2 Plus在培養(yǎng)皿（Falcon300l）中制作10個(gè)微滴，每個(gè)微滴25l，蓋礦物油3ml。D3當(dāng)天，提前30分鐘打開恒溫操作臺(tái)，將圓底加熱試管架放置于臺(tái)面同時(shí)加熱，使溫度穩(wěn)定在37左右。拉針：取一根巴斯德吸管煅燒拉細(xì)成微吸管。用微吸管將