鎘脅迫下白楊抗壞血酸和谷胱甘肽循環(huán)代謝的

1、畢業(yè)論毀設計）題目鎘脅迫下白楊抗壞血酸和谷胱甘肽循環(huán)代謝的研究學生姓名學號所在院（系）生物科學與工程學院專業(yè)班級指導教師2015年5月25日陜西理工學院畢業(yè)論文（設計）陜西理工學院畢業(yè)論文（設計）鎘脅迫下白楊抗壞血酸和谷胱甘肽循環(huán)代謝的研究（陜西理工學院生物科學與工程學院，陜西漢中723000）指導教師：摘要本研究以白楊組培苗為材料，采用土培方法，研究了白楊在Cd2+脅迫下，不同器官中丙二醛（MDA）、過氧化氫（H0）含量顯著增加，導致膜脂過氧化加劇。白楊能夠通過增強超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、22抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性，增加總抗壞血酸（AsA）、抗壞血酸（AsA

2、）、抗壞血酸/脫氫抗壞血酸（AsA/DHA）含量來減少膜脂過氧化傷害。但高濃度、較長時間的Cd2+脅迫也會造成CAT、SOD、APX酶受損，酶活性降低，導致脫氫抗壞血酸（DHA）、還原型谷胱苷肽（GSH）、還原型谷胱苷肽/氧化型谷胱苷肽（GSH/GSSG）與總谷胱苷肽（GSH+GSSG）含量下降。進一步表明白楊對Cd2+的耐受性及其解毒機理，以期為其在植物修復技術改良與優(yōu)化中的應用提供科學依據(jù)。關鍵詞鎘；白楊；抗壞血酸；谷胱甘肽；MetabolismofascorbateandglutathionecycleinwhitepoplarunderCd2+stress（ShaanxiInstitu

3、teof,Hanzhong,Shaanxi723000）Tutor:AbstractInthisstudy,whitepoplarwasusedastheexperimentalmaterialandsoilexperimentwasconductedunderfourCd2+concentrations（10,30,50,and70L-1）for7,14,21and28dbyusingnon-Cdasthecontrol,inordertoinvestigatetheeffectsofCd2+onpoplarphotosynthesis,antioxidantiveabilityandthe

4、relationbetweenCd2+chelationandabilityofCd2+toleranceinplant.TheresultshowedthatthecontentsofMDAandH2O2amongdifferenttissuesinwhitepoplarsignificantlyincreased,whichindiatedthatthelipidperoxidationwasaggravated.WhitepoplarcouldreducethelipidperoxidationbyincreasingtheactivitiesofSOD,CAT,andAPXandtot

5、alAsA,AsA,AsA/DHAcontents.While,underhighconcentrationCd2+stress,theactivitiesofCAT,SOD,APXandthecontentsofDHA,GSH,GSH/GSSG,GSH+GSSGbothdecreasedgradually.GSHandAsAcontentsinwhitepoplarwasdecreasedwiththeincreasedofCd2+concentration,thisresultsindicatedancrucialroleplayedbyGSHandAsAinCd2+tolerancean

6、ddetoxificationinwhitepoplar.Thus,ourstudyisdedicatedtoelucidatethemechanismofCd2+accumulationandtoleanceinwhitepoplarandprovideevidenceforitsapplicationinphytoremediation.KeywordsCadmium;whitepoplar;ascorbicacid;Glutathione;目錄TOC o 1-5 h z HYPERLINK l bookmark14 o Current Document 引言1 HYPERLINK l b

7、ookmark16 o Current Document 重金屬污染土壤的研究現(xiàn)狀1鎘對人與植物的毒害效應1 HYPERLINK l bookmark18 o Current Document 鎘對人體的毒害1Cd2+對植物的毒害1 HYPERLINK l bookmark20 o Current Document Cd2+污染對植物生長發(fā)育的影響1 HYPERLINK l bookmark32 o Current Document 1.3重金屬在植物體內的轉運機制6 HYPERLINK l bookmark34 o Current Document 植物對鎘的排外和富集6 HYPERLINK

8、 l bookmark36 o Current Document Cd2+在植物體內吸收轉運7 HYPERLINK l bookmark42 o Current Document 螯合作用8 HYPERLINK l bookmark44 o Current Document 1.3.4重金屬轉運蛋白101.3.5根系分泌物111.3.6抗氧化系統(tǒng)的增強11植物對重金屬污染土壤的修復12研究目的及創(chuàng)新12 HYPERLINK l bookmark54 o Current Document 實驗內容與實驗方法1321實驗內容13 HYPERLINK l bookmark56 o Current D

9、ocument 實驗材料13 HYPERLINK l bookmark58 o Current Document 試劑與儀器13 HYPERLINK l bookmark60 o Current Document 實驗方法13實驗處理13 HYPERLINK l bookmark62 o Current Document 收獲的具體方法和注意事項13 HYPERLINK l bookmark64 o Current Document Cd2+元素的測定13生物量測定13 HYPERLINK l bookmark68 o Current Document 重要抗氧化酶的活性測定13 HYPERL

10、INK l bookmark72 o Current Document 非酶抗氧化物質含量分析1423.數(shù)據(jù)分析14 HYPERLINK l bookmark78 o Current Document 實驗結果與分析14生物量的測量14重要抗氧化酶的活性測定15CAT酶活性測定16APX酶活性測定16非酶抗氧化物質含量分析17 HYPERLINK l bookmark74 o Current Document 3.3.2還原型谷胱苷肽（GSH）含量測定173.3.3過氧化氫（H0）、超氧自由基（0）和丙二醛（MDA）含量測定222分析183.4Cd2+元素的測定193.5總RNA的提取和半定量

11、RT-PCR20 HYPERLINK l bookmark107 o Current Document 結論與討論22參考文獻23 HYPERLINK l bookmark115 o Current Document 附錄A縮略詞25附錄B英文論文26附錄C中文論文35陜西理工學院畢業(yè)論文（設計）陜西理工學院畢業(yè)論文（設計）第 頁共39頁第 頁共39頁1引言1.1重金屬污染土壤的研究現(xiàn)狀近年隨著采礦業(yè)、工業(yè)生產(chǎn)及高強度的農業(yè)活動將大量的重金屬帶入土壤環(huán)境，破壞土壤生態(tài)系統(tǒng)。重金屬通過植物吸收進人食物鏈，進而在人體內長期累積，嚴重危害人們的健康。而植物修復技術以其操作簡便、環(huán)境友好、修復成本低廉

12、性和工程處理簡易等優(yōu)點日倍受到人們重視。環(huán)境污染是當今全球面臨的一個重要問題。尤其是工業(yè)和農業(yè)所使用以及排放的化學物質種類、數(shù)量逐漸增加，重金屬污染的土壤面積日益擴大。人類賴以生存的自然資源，越來越暴露出不堪重負的跡象1。土壤重金屬污染主要來源于采礦、冶煉、金屬加工、化工、廢電池處理、電子、制革和染料等工業(yè)排放的三廢及汽車尾氣排放、農藥和化肥的施用等。重金屬元素一般是指對生物有顯著毒性的元素，如汞（Hg）、鎘（Cd）鉛（Pb）鉻（Cr）鋅（Zn）銅（Cu）錳（Mn）鎳（Ni）等，通常也把砷（As）、鈹（Be）、鋰（Li）、硒（Se）、鋁（Al）等包括在內。據(jù)統(tǒng)計，全世界每年平均排放Hg約1.5

13、萬t、Pb約500萬t、Cu約340萬t、Ni約100萬t、Mn約1500萬心引。近年的統(tǒng)計資料表明，我國耕地受污染面積2667萬hm2,其中，工業(yè)三廢污染1000萬hm2,農藥殘留施肥污染1000萬hm2,受Cd、As、Cr、Pb等重金屬污染的耕地面積已近2000萬hm2,約占全國耕地總面積的近1/5。其中鎘污染耕地1.33萬hm2,涉及11個省25個地區(qū)；被Hg污染3.2萬hm2,涉及15個省21個地區(qū)，每年因重金屬污染減產(chǎn)糧食1000萬t,被重金屬污染糧食1200萬，尤其是我國耕地受Cd重金屬污染最為突出，造成的經(jīng)濟損失至少200億元。農業(yè)部環(huán)境監(jiān)測系統(tǒng)表明，全國污水灌溉區(qū)面積約140萬

14、hm2,遭受重金屬污染的土地面積占污染總面積的64.8%,其中輕度污染占46.8%，中度污染占9.7%，嚴重污染占8.4%，在這些污染中，以Hg和Cd的污染面積最大、也最嚴重。目前，全球的土壤都存在不同程度的重金屬污染。土壤中的重金屬對農作物、農產(chǎn)品及地下水會產(chǎn)生不良影響，并通過食物鏈危及人類健康。由于鎘污染是一種不可逆的累積過程，同時鎘是生物遷移性較強、易被植物吸收累積的重金屬，因而污染土壤的治理變得較為困難。近年來全球很重視土壤污染和修復技術的研究，有關修復重金屬污染土壤治理一直是全球生態(tài)恢復研究的難點和熱點4。鎘對人與植物的毒害效應鎘對人體的毒害鎘（Cadmium）是生物毒性最強的重金屬

15、之一，被列為五大毒物（Cd、Hg、As、Cr、Pb）之首。近年來，由于工業(yè)三廢排放、不合理的農業(yè)管理措施等，導致土壤Cd污染日趨嚴重。Cd2+對人與動物具有很強的毒性，且移動性強，中毒臨界濃度低，具積累效應，被聯(lián)合國環(huán)境規(guī)劃局和國際勞動衛(wèi)生重金屬委員會認定的重點環(huán)境污染物，被美國毒物管理委員列為第六位危害人體健康的有毒物質。在1922至1965年間，在日本由于鎘中毒死亡的人數(shù)就超過了100人。鎘在生物圈中對健康和經(jīng)濟都造成了嚴重的后果。累積在動物體內（特別是在腎、肝、生殖器官中）的鎘最終被人類食用。高濃度的鎘累積在人體內會嚴重損害腎臟，而食物中低濃度鎘的攝入也會導致腎功能障礙。鎘暴露也可以導致

16、肺氣腫和著名的痛痛病。鎘在人體內的生物半衰期長達1030年，很難被機體降解和排泄。且其主要積累于人體的肝、腎、胰腺、甲狀腺和骨骼等部位，可引起慢性中毒，造成機體器官一系列損傷反應。嚴重時，還可引起細胞癌變和突變。己知人體攝入過量鎘會導致蛋白尿、氨基酸尿和糖尿，影響磷、鈣的吸收和代謝，造成骨骼疏松、萎縮、變形、斷裂等，增加致癌和致畸機率，甚至導致死亡。Cd2+對植物的毒害Cd2+污染對植物生長發(fā)育的影響Cd2+是對農田受污染最普遍的重金屬之一。對植物而言，Cd2+是非必需元素，土壤中過量的Cd2+,被植物吸收后積累在體內，會對植物產(chǎn)生一系列毒害作用。Cd2+可通過與金屬敏感性基團，如巰基或組氨酞

17、基作用而使酶失活，引起植物細胞死亡。正常條件下，植物體內鎘含量很低，一般不超過1.0Mg/kg。當Cd2+進入植物并積累到一定程度，就會影響植物的生長、細胞分裂和結構及多種代謝活動，造成生物量和品質下降。研究表明，大麥受Cd2+污染后，會導致其種子萌發(fā)率、根生長率下降，且這種影響會隨著Cd2+污染濃度的增大與污染時間的延長而加劇。當Cd2+濃度為0.01M時，種子萌發(fā)率小于45%,根系生長停止刀。同時，Cd2+毒害引起根的損傷和根尖細胞老化加速，抑制RNA的合成及RNAase、核糖核酸酶及質子泵的活性；抑制硝酸還原酶的活性，減少根部對硝酸鹽的吸收及向地上部轉運；抑制根部Fe3+還原酶活性，引起

18、Fe2+虧缺&io】。然而，一些植物地上部分Cd2+含量遠低于根系，其葉片等器官對Cd2+的敏感度要遠遠高過根系，因此，當Cd2+通過根系吸收轉運到地上部時，其毒害效應也相當嚴重。研究表明，當植物組織中Cd2+濃度超過一定水平后，在形態(tài)上主要表現(xiàn)為根、莖生長遲緩和葉片失綠、卷曲、掉落、生物量下降。生理生化方面多表現(xiàn)為光合作用和蒸騰作用受到抑制，引起氧化脅迫和膜的損傷，從而影響植物的生長發(fā)育。Cd2+對光合作用的影響許多研究表明，鎘（Cd2+）脅迫可抑制植物的光合作用，且抑制的程度與脅迫程度呈正相關。隨Cd2+濃度增加，龍葵幼苗葉片凈光合速率均比對照下降6.01%-61.71%、氣孔導度下降17

19、.94%-55.32%和蒸騰速率17.68%-68.10%。Cd2+對光合作用的抑制是通過影響植物細胞內酶活性、干擾呼吸和光合過程中的電子傳遞、破壞葉綠體的完整性而實現(xiàn)的。葉綠體是植物進行光合作用的場所，充足的葉綠素和完整的葉綠體是光合作用得以順利進行的保證。Cd脅迫會降低植物葉片中葉綠素的含量和葉綠體的數(shù)量，破壞葉綠體結構，產(chǎn)生失綠癥11。變黃或出現(xiàn)黃褐色斑點，葉綠體含量減少，影響光合作用的正常進行。Cd2+可破壞葉綠體膜系統(tǒng)，在低濃度脅迫下，葉綠體的基粒片層稀疏，層次減少，分布不均。隨著重金屬脅迫的濃度增加，基粒片層消失，類囊體出現(xiàn)空泡，基粒垛疊混亂。在高濃度條件下，膜系統(tǒng)開始崩潰，葉綠體

20、球形皺縮，出現(xiàn)大而多的脂類小球，導致葉綠體功能遭到破壞。而這種破壞可能是由于Cd2+沉積在類囊體上，并與膜上蛋白體結合，進而破壞了葉綠體酶系統(tǒng)和阻礙了葉綠體合成。Cd2+能破壞植物細胞內酶及代謝作用的原有區(qū)域性，導致根系脫氫酶、淀粉酶等呼吸作用、碳水化合物代謝相關酶的活性下降研究發(fā)現(xiàn)，Cd2+污染后的番茄的葉綠素a和b含量均隨Cd2+濃度增大而減少，a/b值隨Cd2+濃度增大而增大，表明Cd2+對番茄葉綠素b的影響比a大。導致葉綠素含量下降的原因是Cd2+抑制原葉綠素酸酷還原酶的活性，并影響了氨基-Y酮戊二酸的合成。前者都是葉綠素生物合成所必須的酶，后者是合成葉綠素的中間體I12】。另外，Cd

21、2+還可通過干擾呼吸和光合中的電子傳遞，導致能量狀態(tài)降低，減少礦質營養(yǎng)吸收和抑制生長。經(jīng)過Cd2+脅迫的楊樹，其植株的葉綠素含量、光合作用、PSII原初光化學反應量子效率均顯著降低Cd2+對光系統(tǒng)I和光系統(tǒng)II均有影響，但對后者的影響更顯著。Cd2+脅迫不但會破壞水分平衡、降低光合速率、破壞光合器官及色素，抑制RuBP梭化酶活性，影響碳固定及葉綠素Hill反應、損傷光合系統(tǒng)I和II、增加非光化學碎滅等。對細胞滲透調節(jié)平衡的影響在非生物脅迫下，細胞膜作為植物調節(jié)和控制細胞內外物質運輸和交換的重要結構，是植物細胞和外界環(huán)境進行物質交換和信息交流的界面和屏障13，在細胞滲透調節(jié)、維持細胞正常的生理代

22、謝方面發(fā)揮著重要作用。細胞膜的穩(wěn)定性是細胞進行正常生理功能的基礎，其透性是評價植物對污染物反應的常用指標之一。在重金屬脅迫下，植物葉片細胞質膜的組成遭到破壞，細胞內的離子和有機物大量外滲，導致植物體內一系列生理生化過程失調。細胞外滲液電導度與污染物濃度成正相關。細胞外滲液電導度與污染物濃度成正相關。細胞中常見的滲透調節(jié)物質主要有可溶性糖、可溶性蛋白、游離脯氨酸、丙二醛、無機離子等，保持體內細胞與組織的水平衡，穩(wěn)定生物大分子結構以提高植物的抗性和對逆境的適應性14。脯氨酸作為一個重要的滲透調節(jié)物質，能夠減少重金屬對細胞膜和蛋白質造成的損傷，穩(wěn)定和保護大分子化合物。在逆境條件下，植物為了防御傷害，

23、維持正常的生理生化功能，植物體內必然相應地產(chǎn)生一系列的物質代謝變化，促進游離脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白和丙二醛含量的積累15。近年來研究表明，丙二醛是表達細胞膜損傷程度的重要標志，其可與膜上蛋白質結合，引起蛋白質分子間和分子內的交聯(lián)，形成不溶性的化合物沉積，干擾細胞的正常生命活動I。五種樹木（香樟、女貞、海桐、銀杏、鵝掌揪）在Cd2+污染脅迫下，葉片的游離脯氨酸含量變化呈先上升、后降低再上升趨勢。Cd2+對植物離子吸收的影響重金屬對植物的毒害機理之一是干擾植物對養(yǎng)分的吸收，導致植物體內營養(yǎng)元素失調，相應地陜西理工學院畢業(yè)論文(設計)陜西理工學院畢業(yè)論文(設計)第 頁共39頁第 頁共39頁代謝

24、活動不能正常進行，使植物的生長發(fā)育間接地受到影響。Cd2+能抑制植物對N,K,Mg,Mn的吸收，而對植物吸收P、S、Ca、Zn、Fe的影響比較復雜。在Cd2+的脅迫下，紫茉莉礦質元素Fe,K和Mg含量均明顯降低。鎘脅迫能顯著地降低水稻籽粒中K，P，Mg,Mn和Zn元素的含量。Cd2+可干擾旱柳對P的吸收和運輸。Cd脅迫可使龍葵植株營養(yǎng)元素吸收紊亂，并促進龍葵葉片和根系對K的吸收。Cd2+脅迫強烈抑制煙草營養(yǎng)器官的生長發(fā)育，明顯減少煙草植株體內的K、P、Ca等大量元素的含量，且含量隨Cd2+脅迫濃度的增高而減少，同時鎘脅迫增加Zn、Fe、Cu、Al等微量元素的含量。Cd2對植物活性氧代謝的影響從

25、圖1-1表明，植物遭受非生物脅迫均會產(chǎn)生活性氧(ROS,reactiveoxygenspecies)，包括超氧自由基(superoxide,O2-),羥自由基(hydroxylradicals,0H)、單線態(tài)氧(singletoxide,1。2),過氧化氫(hydrogenperoxide,H2O2)等。活性氧的產(chǎn)生與植物抗氧化能力之間的不平衡是重金屬產(chǎn)生毒害的原因之一。Cd2+可能還誘導NADPH氧化酶活性的提高，促進NADPH氧化，導致O2-大量生成和植物體內活性氧清除系統(tǒng)功能失調，活性氧的過量存在會使生物大分子，例如膜脂、蛋白質、核酸等被氧化，從而導致細胞氧化損傷。西瓜葉片中ROS(主要

26、包括O2-、H2O2等)濃度以及膜脂過氧化程度(即丙二醛含量)是衡量植物體氧化脅迫程度的重要指標。MDHA-1DHAR2AsAH+2H2t-Cu-ZnSODt-APXFNIR2HNADiPfNAD(P)HALUMENDHAMDHAm2GSHDHADHARGSSGSTROMAc-Cui-ZnSODDHA2MDHAAsANAD(P)+2H+NADP+2NAD(P)H圖1-1植物葉綠體抗氧化系統(tǒng)。類囊體抗氧化系統(tǒng)包括t-Cu/Zn-SOD,其位于類囊體表面(在很多植物中，t-Cu-Zn-SOD被替換為t-Fe-SOD),類囊體抗壞血酸過氧化物酶(t-APX)以及鐵氧還蛋白(Fd)。Fd直接將單脫氫抗

27、壞血酸(MDHA)還原為抗壞血酸(AsA)。基質抗氧化系統(tǒng)由基質Cu-Zn-SOD(t-Cu/Zn-SOD)、基質抗壞血酸過氧化物酶(s-APX)、單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)、脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)以及谷胱甘肽還原酶構成。NAD(P)H負責還原MDHA,而DHA則是由鐵氧還蛋白-NADP+還原酶(FNR)光激發(fā)產(chǎn)生的。MDHA也在葉綠體內腔中由紫黃質脫環(huán)氧化酶催化產(chǎn)生或者在抗壞血酸釋放出電子到兩個光系統(tǒng)中時(PSI或PSII)。MDHA迅速被轉化為AsA和DHA。后者跨過內囊體膜進入葉綠體內腔并隨后被還原為抗壞血酸。Fig.1-1.Antioxidantsystemofplan

28、tchloroplasts.ThethylakoidalantioxidantsystemincludesCu-Zn-superoxidedismutase(t-Cu/Zn-SOD),presentonthethylakoidalsurfaces(inmanyplantspecies,t-Cu-Zn-SODissubstitutedbyt-Fe-SOD),thylakoidalascorbateperoxidase(t-APX)andferredoxin(Fd).Fdreducesmonodehydroascorbate(MDHA)directlytoascorbate(AsA).Thestr

29、omaticantioxidantsystemiscomposedbystromaticCu-Zn-superoxidedismutase(t-Cu/Zn-SOD),stromaticAPX(s-APX),monodehydroascorbatereductase(MDHAR),dehydroascor-batereductase(DHAR)andglutathionereductase(GR).NAD(P)Hisusedforthereductionofmonodehydroascorbate(MDHA),whereasdehydroascorbate(DHA)isphoto-generat

30、edbyferredoxin-NADP+-oxidoreductase(FNR).MDHAisalsoproducedinchloroplastlumenbyvio-laxantinde-epoxidaseorwhenAsAreleaseselectrontothetwophotosystems(PSIorPSII).MDHAisrapidlytransformedinAsAandDHA.ThislatterentersthelumenbythylakoidalmembranesandisreducedtoAsA.Cd2+是一種非氧化還原金屬(anon-redoxmetal),Cd2+可通過結

31、合酶活性中心或蛋白巰基，取代蛋白反應中心的必需金屬Ca、Fe、Zn等，釋放自由離子，誘發(fā)氧化脅迫，引起膜脂的過氧化，導致膜的損傷，在高濃度Cd2+脅迫條件下，抗氧化酶活性明顯受到抑制，加劇活性氧的釋放，導致植物生長嚴重受抑制18。在Cd2+脅迫下，大麥功能葉的丙二醛含量急劇增加，并隨Cd2+脅迫時間延長而加居0,超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)活性降低。Cd脅迫引起的膜脂過氧化在其他植物中也都有報道。植物活性氧代謝是一個十分復雜的系統(tǒng)，目前對植物非生物脅迫條件下活性氧代謝過程的有了較多的研究，目前由于植物活性氧代謝是一個十分復雜的過程，利用其信號轉到途徑中，如信號的感受、作用位點

32、等一系列問題仍有待進一步解決。Cd2+對植物保護系統(tǒng)的影響當植物受到逆境脅迫時，細胞內活性氧的產(chǎn)生與清除系統(tǒng)的平衡遭到破壞，自由基產(chǎn)生和積累超過一定的閥值時，就會發(fā)生膜傷害，甚至導致植物死亡19。盡管逆境可在植體內引起氧化脅迫，但植物本身也具有通過復雜的抗氧化系統(tǒng)來保護自身免受過氧化傷害的機制，這個系統(tǒng)包括酶，如超氧化物歧化酶(SOD,EC)、過氧化氫酶(CAT,EC)、過氧化物酶(Peroxidase,POD,EC)、抗壞血酸過氧化物酶(APX,EC1)、和谷胱甘肽還原酶(GR,EC)、單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR,EC165.4)、脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR,EC)等和非酶抗壞血酸(

33、AsA)、谷胱甘肽(GSH)等兩個系統(tǒng)。Cd2+可誘導活性氧產(chǎn)生，從而導致細胞內酶及非酶保護系統(tǒng)的抗氧化反應，并使細胞發(fā)生膜脂過氧化。Cd2+能抑制(有時是促進)一些抗氧化酶的活性。在煙草中，Cd2+促進膜脂過氧化，降低SOD、CAT、APX、GR等酶的活性。在玉米中研究表明，隨著Cd離子濃度的增加和Cd2+脅迫時間的延長，玉米幼苗SOD和CAT活性降低，POD活性增強，蛋白質含量下降，膜脂過氧化作用加劇，質膜透性增大，幼苗的生長受到抑制20。鎘脅迫導致大麥細胞膜過氧化產(chǎn)物MDA累積，加劇膜脂過氧化，但同時伴隨著SOD、POD和CAT活性提高，對Cd2+毒害產(chǎn)生適應性保護反應。Cd2+脅迫使小

34、麥體內活性氧自由基清除系統(tǒng)的功能降低的，造成細胞內H2O2積累，APX和GR活性下降，內源抗氧化劑AsA和GSH含量減少。細胞內MDA的積累表明，膜脂過氧化發(fā)生和膜系統(tǒng)受到損傷。Cd2+進入細胞溶質后首先引起細胞抗氧化能力瞬時缺失，如引起AsA-GSH循環(huán)兩個關鍵酶GR和APX的瞬時失活，啟動H2O2的積累(從圖1-2)，進而誘導抗氧化系統(tǒng)的二次防御作用(孫濤等.2011)。陜西理工學院畢業(yè)論文(設計)陜西理工學院畢業(yè)論文（設計）第 頁共39頁第 頁共39頁NAD：P）81NAEkTiGranumFdIhylnkuidIChenCyIfP：NADPtuDMBQDCPJP/rLaMVUhcJcc

35、hiainrateCilLOROPLAIsyslicim:入、MllI匕應口曲甬U-in.tKMllItAml?uZn.SOOIThvUikoiclslNcuvtnging即y就Fin2GSI1NADP*vQjRNADPMesseStromalACJ3E1AdhajO圖1-2葉綠體中電子轉移以及抗氧化防御系統(tǒng)示意圖。由圖可以知道，氧氣的光還原產(chǎn)生超氧物質，超氧化物歧化為H2O2,H2O2還原為水，氧化的ASCs還原為ASC以及參與反應酶類的微區(qū)隔化。電子轉移鏈元件：酪氨酸、P682反應中心、Pheopheophytin、QA質體醌（緊密結合到PSII）、QB（另外一種松散結合到PSII的質體醌

36、）、PQ質體醌、Cytf細胞色素、PC質體藍素、PSI、PSI初級電子受體、Fd、Fp、NADP。該圖沒有展示ATP在哪里以及如何生成的。Fig.1-2Schematicrepresentationofelectrontransportandantioxidativedefensesysteminchloroplast,showingphotoreductionofdioxygentogeneratesuperoxide,disproportionationofsuperoxidetoH2O2,reductionofH2O2towater,associatedreductionofoxidiz

37、edASCstoASC,andmicrocompartmentationoftheparticipatingenzymes.APXascorbateperoxidase,ASCascorbate,CuZn-SODcopperzincsuperoxidedismutase,DHAdehydroascorbate,DHARdehydroascorbatereductase,MDAmonodehydroascorbateradical,MDAR,MDAreductase,sAPXstromalAPX,SFstromalfactorforenhancedphotoreductionofdioxygen

38、,tAPXthylakoid-boundAPX,VDEviolaxanthinde-epoxidase.Electrontransportchaincomponents:Tyrtyrosine,P682reactioncenterchlorophyllforPSII,Pheopheophytin,QAaplastoquinonemoleculetightlyboundtoPSII,QBanotherplastoquinonemoleculelooselyboundtoPSII,PQplastoquinone,Cytfcytochromef,PCplastocyanin,P700reaction

39、centerchlorophyllforPSI,XprimaryelectronacceptorofPSI,Fdferredoxin,Fpflavoprotein,NADPnicotinamideadeninedinucleotidephosphate.ThediagramdoesnotshowwhereandhowATPismade.Cd2+脅迫條件下對植物的S、N、C代謝都會受到一定的影響，Choetal.（2010）研究表明，S代謝與水稻對Cd2+脅迫反應機制密切相關硫代謝產(chǎn)物如谷胱甘肽（GSH）在植物對鎘的解毒過程中起著關鍵作用，GSH是水稻抗Cd的重要物質，一方面，GSH是植物螯合肽

40、合成的前體，后者可以與Cd2+及其他重金屬結合，而GSH在谷胱甘肽硫轉移酶的作用下也可與進入細胞內的Cd2+形成復合物，維持細胞內離子平衡；另一方面，GSH可以通過抗壞血酸谷胱甘肽循環(huán)，完成對Cd2+誘導的活性氧（ROS）的清除作用（圖1-3）。因此，過量表達硫代謝途徑相關酶基因也可以提高植物對鎘的耐性22。Dcloxificahon泌repairROSproduedonDamage-JjitiftxidanjLdcfciKtChelationEnzymesMetabolitesAsA-GSHcycleNADPHoxidasesSubcellularorganelles-Peroxisomes

41、-MitochondriaChloroplastsMetaluptakeandtoleranceMetalhomeostasisPhytocxiractionofmctals/mctalloidAOxidativechallengetSignalling.AntioxidantAcclimalion圖1-3在金屬的植物提取中谷胱甘肽中心角色的廣義模型。該模型中，金屬的吸收和耐受均是必要的前提條件，這些前提條件均受到金屬內平衡的影響。作為螯合代謝物以及生成PC的底物，谷胱甘肽對于金屬內平衡是必須的。它也是一種抗氧化物，對于金屬誘導產(chǎn)生的氧化脅迫解毒具有重要作用。連同整個抗氧化防御體系，在受到金屬

42、脅迫的植物中，它的行為對于ROS施加的氧化脅迫具有重要影響，這些脅迫可能導致?lián)p傷或者信號轉導。因此，GSH能夠影響到參與環(huán)境適應的細胞通路和修復機制，以便應對金屬接觸引起的植物中氧化脅迫挑戰(zhàn)。植物的生長發(fā)育以及生物產(chǎn)量是由這些綜合響應的效用決定的。Fig.1-3.Generalizedmodelforacentralroleofglutathione(GSH)inmetalphytoextraction,forwhichmetaluptakeandtoleranceareessentialprerequisitesthatarebothinfluencedbymetalhomeostasis.

43、AsachelatingmetaboliteandasasubstrateforPCformation,GSHisessentialinmetalhomeostasis.Itisalsoanantioxidantimportantfordetoxificationofmetal-inducedoxidativestress.Togetherwiththeentireantioxidativedefencesystem,itsactionisvitalduringthereactiveoxygenspecies(ROS)-imposedoxidativechallengeinplantsunde

44、rmetalstressleadingtodamageand/orsignalling.Inthisway,GSHisabletoinfluencethecellularpathwaysinvolvedinacclimationandrepairmechanismstocopewiththeoxidativechallengeinducedbymetalexposureinplants.Plantgrowthanddevelopment,andhencebiomassproduction,aredeterminedbytheeffectivenessoftheseintegratedrespo

45、nses.1.3重金屬在植物體內的轉運機制重金屬元素以可溶的離子態(tài)施入土壤后迅速轉化為其他復雜的形態(tài)。一方面，植物利用地下部分泌的特殊有機物，如細胞內的金屬硫蛋白、植物螯合肽或一些有機酸、氨基酸等物質，促進土壤中重金屬元素的溶解與地下部的吸收；另一方面利用一些特殊的蛋白，如金屬硫蛋白、植物螯合肽等，與重金屬離子結合固定，將其吸收的重金屬離子累積在根部，從而減輕毒害23。低濃度的重金屬(Cu、Zn、Mi)脅迫可促進植物對營養(yǎng)元素的吸收，從而對植物的生長有一定的促進作用。但環(huán)境中過量的重金屬對植物細胞正常生長與發(fā)育有毒害作用。然而，自然界中，不同的植物種類對Cd的抗性不同，有些植物能在高濃度的Cd

46、環(huán)境中生長、繁殖并完成生活史，表明在長期的進化過程中這些植物也相應地產(chǎn)生了對重金屬的抗性。植物對重金屬的抗性，就是植物能生存于某一特定的、含量較高的重金屬環(huán)境中而不會出現(xiàn)生長率下降或死亡等毒害癥狀。如，蘆葦對重金屬有很高的抗性，在其他植物都不能生長的環(huán)境中，蘆葦能正常生長，甚至還能完成生活史。我國已有利用蘆葦?shù)倪@一特點處理污水的例子，并取得了很好的效益。植物對鎘的排外和富集木本植物根系發(fā)達，具有強烈吸收作用，可以從土壤中吸收、富集、沉淀或去除重金屬污染物植物能產(chǎn)生新的重金屬積累器官富集重金屬，如：初生根皮層通過形成內周皮而起隔離作用，使重金屬在植株根部細胞壁沉淀而束縛其跨膜吸收，或形成重金屬高

47、積累根毛，局部累積重金屬，減少重金屬向地上部各器官的轉移，從而增強抗性。木本植物生長環(huán)境的特殊性，其根際環(huán)境，特別是根際pH變化、Eh狀況、根系分泌物、根際微生物效應、金屬有機成分的改變等，都可能會影響到木本植物根系對重金屬的吸收和運輸。眾多研究表明，重金屬在亞細胞水平的分布與其對植物體的毒性密切相關，細胞壁固持在植物對重金屬的解毒、耐性方面起著重要作用。植物的細胞質膜是Cd2+及其它各種離子進入細胞的重要屏障，對各種離子具有選擇性吸收的特性，細胞質膜能夠通過限制Cd2+的跨膜運輸來阻止Cd2+進入細胞內，這在理論上是植物提高對Cd2+耐性的最好機制。另外，植物對Cd2+等重金屬也具有排斥性，

48、即重金屬被吸收后又被排出體外，這也是植物對重金屬的一種很好的解毒方式。不同耐性植物金屬離子吸收與代謝關系的研究發(fā)現(xiàn)，植物原生質膜有主動排出金屬離子的作用24。植物還可以通過老葉的脫落把重金屬離子排出體外。植物還可通過將重金屬離子分布在一些非活性的或耐性較高的部分，提高自身對重金屬的耐性，這是植物對Cd2+等重金屬脅迫長期適應的結果。重金屬在超積累植物的葉片中都存在區(qū)域化分布，在組織水平上，重金屬主要分布在表皮細胞、亞表皮細胞和表皮毛中。細胞壁是重金屬進入植物細胞的第一道屏障，由于細胞壁上的膠質酸、多糖和蛋白質等能提供大量的配位體和官能團，能通過沉淀、絡合、吸附等阻礙重金屬進入細胞內，使植物對重

49、金屬表現(xiàn)出耐性。超積累植物的耐性與超富集性是由超積累植物本身的生理機制所控制。超積累植物吸收、富集重金屬與其根部細胞具有與重金屬較多的結合位點有關，而耐性則與重金屬在植物細胞中分布的區(qū)域化有關，即重金屬主要存在于細胞壁和液泡中，使其毒性降低。許多研究認為，一些耐性植物能在根部積累大量重金屬離子，植物根系中Cd2+的含量可達到植株中Cd2+總量的70%以上，這充分說明了植物根系在提高植物Cd2+耐性方面的作用。一些植物也可以通過將從根系運輸?shù)降厣喜康腃d2+在地上某部位富集的作用，來避免Cd2+對植株體自身造成傷害。如Cd超量富集于芥菜葉片表皮毛中，使其含量比葉片組織高43倍,這樣避免了Cd2+

50、對葉肉細胞的直接傷害。而且由于這種芥菜生長迅速，生長周期短等特點，葉片可大量富集Cd2+，在凈化重金屬污染的土壤和水體方面有很大作用25。Cd2在植物體內吸收轉運在逆境條件下，植物吸收重金屬的主要器官是根系，它是植物最先感受逆境的器官。植物根系吸收重金屬后，開始向莖、葉、枝器官轉移，并分配在不同的器官內。Cd離子在植物體內的轉運是植物能夠富集重金屬的一個重要的原因，Cd2+吸收進入根細胞后，能與細胞內的有機和無機化合物結合形成復合物，一些化合物主要包括谷胱甘肽、草酸、組氨酸以及檸檬酸鹽等小分子有機物質對金屬螯合能力較弱，可能更多是與金屬離子運輸過程相關。圖1-4表明，Cd2+被吸收進入根細胞后

51、，首先通過液泡膜上轉運蛋白暫時儲存于液泡并裝載到木質部導管，然后在根壓和蒸騰流的作用下，隨導管向上運輸，從而促進Cd2+向地上部轉移。柳樹樹干Cd2+含量約為0.6-4.1mg/kg，樹葉的Cd2+含量是1-7.3mg/kg，其年生物量為2.1-8.7t/hm2，對不同性質土壤Cd2+的去除量是每年2.6-16.5g/hm2。不同植物、同一植物的不同部位對Cd2+的積累能力不同。張連忠研究表明，果樹根中以梨積累的Cd2+最高，桃和梅次之，蘋果則最低26。土壤中Cd2+的水平仍然高于桃樹體上任何部位，是韌皮部的56倍、葉片的9.7倍、果實的68倍。葉片中Cd2+的累積水平低于韌皮部組織，但仍達到

52、果實含量的7倍之多。桃樹器官中Cd積累量大小為根莖葉果實，土壤中Cd2+濃度為10mg/kg，果皮中Cd2+積累量最大27。Cd2+被蘋果植株吸收以后，大部分滯留在根內，Cd2+在不同器官的積累量由高到低為：根系枝干新梢葉片。然而，根系吸收的鎘經(jīng)木質部運輸?shù)竭_地上部莖葉，轉移率取決于以下幾個因素：（1）根系細胞壁和液泡對鎘的吸收、固定作用；（2）鎘離子在根皮層細胞中橫向運輸；（3）鎘離子從根系的中柱薄壁細胞裝載到木質部導管；（4）鎘離子在木質部中長途運輸；（5）鎘離子從木質部運輸?shù)饺~細胞；（6）鎘離子跨葉細胞葉泡膜運輸。MetalhomeostasisingreypoplarrootsTric

53、honesshoots圖.1-4.鎘離子在白楊體內的轉移和分布Fig.1-4.ThebasicschemeofmaintainingCdionsdistributionandtransferringingreypoplar螯合作用重金屬脅迫下，植物體內螯合蛋白主要有金屬硫蛋白(Like-MT)及植物螯合肽(PC)兩大類。能結合被吸收的重金屬，轉運至液泡儲存，使細胞質中的重金屬濃度降低，防止金屬敏感酶變性失活減輕重金屬對植物毒害作用。植物螯合肽(Phytochelatins,PCs)是一種由半胱氨酸(cysteine,Cys)、谷氨酸(glutamicacid，Glu)和甘氨酸(Glycine,

54、Gly)組成的含巰基螯合多肽，分子量一般為l-4kD，其基本結構為(-Glu-Cys)n-Gly(n=2-ll)。由1-5可知，植物鰲合肽在鎘解毒和代謝過程中起著關鍵作用。PCs通過巰基與金屬離子螯合形成對植物無毒的復合物，可減少細胞內游離的重金屬離子，從而減輕重金屬對植物的毒害作用。同時，植物螯合肽(PC)是植物體內存在的Cd的天然配體28。PCs最早由從經(jīng)鎘離子誘導的蛇根木(Rauvolfiaserpentine)懸浮細胞中提取，它與MT最大的差異是非基因產(chǎn)物，而是GSH在PCs催化下合成的小肽化合物。在10多種高等植物中，PCs能結合所吸收的90%的鎘，根系所吸收的鎘至少有60%是以PC

55、-Cd復合物形式存在。正常情況下，PCs在植物體內含量極低，但在重金屬誘導下，PCs含量增加。在Cd2+脅迫下，編碼PCs合成酶基因高度表達,顯著提高了白楊樹葉的GSH含量，大量合成PCs，并以重金屬-PC螯合物形式大量累積重金屬。耐鎘植物的螯合肽Cd2+PC含量要比對照高出101000倍。ABCPCsvnthascXylem圖1-5參與植物根部Cd的吸收、隔離以及轉移的代謝過程示意圖。HMW?才PC-Cd(II)(=LMW)PC-Cd(ll)?Y-Cd(ll)GS2-Cd(II)GS2-(：d(ll)GS2-Cd(ll)X-Cd(lltransDorter?d(I，)PC-Cd(ll)(=L

56、MW)GS2-Cd(lI)圖中描繪的是兩個根細胞，一個朝向根際(右邊)，另一個臨近水和礦物質轉移組織，即木質部(左邊)。他們通過胞間連絲以共用質體的形式相連接。顯然植物細胞通過ZIP家族的Fe2+/Zn2+轉運蛋白吸收Cd2+，有可能通過Ca2+轉運蛋白或者離子通道。在細胞質中他們被螯合并且不大可能以游離的水合離子存在。最初的配體可能是GSH(bisglutathione-Cd復合物，GS2-Cd(II)以及一些潛在的其他未知分子(X-Cd(II)。GS2-Cd(II)同組成型表達酶PCS相互作用導致PC合成的激活。據(jù)推斷PC-Cd(II)復合物(=LMW復合物)可能是通過一種未知的ABC-型

57、轉運蛋白運輸?shù)揭号葜?。在液泡中，HMW復合物形成，其包含有硫化物。HMW復合物代謝率未知，主要是由于它們僅僅是瞬間存在。液泡隔離的第二種通路可能是Cd2+/H+逆向通道。在擬南芥中候選蛋白是CAX2。根細胞中金屬隔離通路的活力可能在決定轉移到植物地上部分速率上起到重要的作用。第二個因素就是隔離的金屬離子的流動性和易接近性。第三，跨域根部和內皮層的徑向共質體通道的效率有很重要的影響。最后，木質部的裝載活力，例如從木質部薄壁細胞到木質部的流出活力。至少有一小部分的液泡Cd，結合到HMW或者未鑒定的復合物(Z-Cd(II)-Z)，能夠明顯的通過蛋白如AtNramp3運回到細胞質。共質體轉運需要獲得可

58、流動的高親和性的配體(GS2-Cd(II),X-Cd(II)。木質部的裝載依賴于位于周圍細胞質膜上的流出泵。其中在擬南芥中這個泵為AtHMA4。也有人提出PC-Cd(II)復合物的流出物。在酸性木質部中Cd(II)的配體還是未知的。根據(jù)X-射線吸收光譜實驗，發(fā)現(xiàn)它們是氮或者氧氣配體。Fig.1-5.Aschematicrepresentationofprocessesinvolvedintheuptake,sequestrationandtranslocationofCdinplantroots.Depictedaretworootcells:oneisfacingtherhizosphere

59、(right),oneisadjacenttothewaterandmineralstranslocatingtissue,thexylem(left).Theyaresymplasticallyconnectedviaplasmodesmata.Cd2+ionsareapparentlytakenupintoplantcellsbyFe2+/Zn2+transportersoftheZIPfamilyandpossiblybyCa2+transporters/channels.Inthecytosoltheyarechelatedandmostlikelynotpresentasfireeh

60、ydratedions.InitialligandscouldbeGSH(bisglutathionato-Cdcomplexes,GS2Cd(II)andpotentiallyotherunknownmolecules(X-Cd(II).GS2-Cd(II)interactswiththeconstitutivelyexpressedenzymePCSresultingintheactivationofPCsynthesis.PC-Cd(II)complexes(=LMWcomplexes)arehypothesizedtobetransportedintothevacuolebyan(un