免疫比濁法檢測免疫球蛋白

1、免疫比濁法檢測免疫球蛋白第1頁，共23頁，2022年，5月20日，5點23分，星期一 實驗原理免疫濁度法是可溶性抗原、抗體在液相中特異結(jié)合，產(chǎn)生一定大小的復(fù)合物，形成光的折射或吸收，測定這種折射或吸收后的透射光或散射光作為計算單位。第2頁，共23頁，2022年，5月20日，5點23分，星期一免疫比濁法分類當(dāng)一束光線通過溶液受到光散射和光吸收兩個因素的影響而使光的強(qiáng)度減弱透射比濁法:在光源的光路方向（00）測量透射光強(qiáng)度和被檢測溶液微粒濃度關(guān)系的方法。散射比濁法:在光源的光路方向（50-960）角的方向上測量透射光強(qiáng)度和被檢測溶液中微粒濃度關(guān)系的方法。第3頁，共23頁，2022年，5月20日，5

2、點23分，星期一 透射比濁法和散射比濁法光路檢測器A檢測器B IC I0 I I 透射比濁法 散射比濁法第4頁，共23頁，2022年，5月20日，5點23分，星期一（一）基本原理 是個極其簡單的方法。在抗原過量情況下，與待測樣品中相應(yīng)的Ig發(fā)生抗原-抗體反應(yīng)，形成可溶性復(fù)合物，使反應(yīng)介質(zhì)的濁度發(fā)生改變。 測量方法利用分光光度計測量被吸收的量。讀數(shù)以吸收單位（A）或OD值表示，A值反映了入射光和透射光的比率。待測物中Ig含量可通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得出。 待測樣品中的抗原含量與吸光度呈正比，而與透射光呈反比。 反應(yīng)在PEG的作用下，加速復(fù)合物的形成。 免疫透射比濁法第5頁，共23頁，2022年，5月2

3、0日，5點23分，星期一透射比濁法測定原理光 源誘導(dǎo)劑第6頁，共23頁，2022年，5月20日，5點23分，星期一樣品光電計濾光片光源透射比濁法測定原理第7頁，共23頁，2022年，5月20日，5點23分，星期一透射比濁法的缺陷：(1)溶液中存在的抗原抗體復(fù)合物分子應(yīng)足夠大，分子太小則阻擋不了光線的通過。(2)溶液中的抗原抗體復(fù)合物的數(shù)量要足夠多。如果數(shù)量太小，溶液濁度變化太小，對光通量影響不大。(3) 透射比濁是依據(jù)透射光減弱的原理來定量的，因此只能測定抗原抗體反應(yīng)的第二階段，檢測仍需抗原抗體溫育反應(yīng)時間，檢測時間較長。光通量是每單位時間到達(dá)、離開或通過曲面的光能數(shù)量 第8頁，共23頁，20

4、22年，5月20日，5點23分，星期一 原理散射比濁法在入射光的一定角度檢測粒子發(fā)出的散射光，散射光的強(qiáng)度與IC的含量呈正比。第9頁，共23頁，2022年，5月20日，5點23分，星期一散射比濁法測定原理增 加 散 透 率 : 660nm 測 定 散 射 光聚集形成誘導(dǎo)劑第10頁，共23頁，2022年，5月20日，5點23分，星期一散射光測定檢測器 (LED)光電計樣品100 %0 %時間散射光強(qiáng)度第11頁，共23頁，2022年，5月20日，5點23分，星期一 速率散射比濁法 （一）基本原理 是測定抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的動態(tài)過程。 所謂速率，是在單位時間內(nèi)抗原抗體結(jié)合形成 復(fù)合物的速度。將各單位時

5、間內(nèi)形成復(fù)合物的 速率及測定的散射信號連接在一起，即是動態(tài) 的速率比濁分析。 當(dāng)儀器測定到某一時 間內(nèi)形成速率下降時， 即出現(xiàn)速率峰，該峰 值的高低，即代表所 測抗原的量。第12頁，共23頁，2022年，5月20日，5點23分，星期一CONCENTRATIONRATE在速率峰基礎(chǔ)上完成的標(biāo)準(zhǔn)曲線第13頁，共23頁，2022年，5月20日，5點23分，星期一方法評價： 敏感度高 快速(不必達(dá)平衡） 抗原抗體結(jié)合的動態(tài)測定，理論上測定不受本底散射信號的影響 可檢測微量樣品第14頁，共23頁，2022年，5月20日，5點23分，星期一 原理2.終點散射比濁法讓抗原抗體作用一定時間，使其反應(yīng)達(dá)到平衡后

6、，測定其IC形成的量。IC的濁度不再受時間的影響，但反應(yīng)IC聚合產(chǎn)生絮狀沉淀之前，進(jìn)行濁度測定。第15頁，共23頁，2022年，5月20日，5點23分，星期一散射比濁法的缺陷(1)因為是一次性測定光吸收值，沒有考慮每一個待測樣本的吸收和散射效果，可測定結(jié)果不準(zhǔn)確(2)測定的仍是抗原抗體反應(yīng)的第二階段，不適合快速檢測。(3) 終點法存在反應(yīng)本底，測定樣本的含量越低本底比例越大，故在微量測定時，本底的干擾是影響準(zhǔn)確測定的重要因素。 第16頁，共23頁，2022年，5月20日，5點23分，星期一影響免疫比濁測定的因素1、抗原抗體比例2、抗體的質(zhì)量 抗體的特異性、效價、親和力3、反應(yīng)的溶液4、增濁劑的

7、使用第17頁，共23頁，2022年，5月20日，5點23分，星期一1、透射比濁操作簡便，適用于普通的自動生化分析儀和普通的分光光度計，幾乎所有的實驗室均能開展。不足的是靈敏度和精密度均不夠理想，所需的抗血清量大，檢測的周期較長。2、散射比濁的優(yōu)點是靈敏度、精密度均較高，檢測快速。其缺點是需特定的分析儀器，試劑價格高。透射比濁法和散射比濁法優(yōu)缺點比較第18頁，共23頁，2022年，5月20日，5點23分，星期一免疫濁度法測定中應(yīng)注意的問題1、偽濁度的影響 偽濁度形成原因很復(fù)雜，主要是抗血清含有非特異性的交叉反應(yīng)性雜抗體成分；增濁劑濃度和反應(yīng)時間掌握不當(dāng)；樣品本身的濁度處理不當(dāng)；試劑的污染和變質(zhì)；

8、器材尤其是比色杯等不夠清潔等因素。2、非特異性散射光的影響 免疫濁度法經(jīng)常受內(nèi)源性光散射的干擾，為避免這些非特異性光散射的影響，應(yīng)用透射比濁法時需保證抗體組分在3以下，散射比濁法需保證在 0.5以下。 第19頁，共23頁，2022年，5月20日，5點23分，星期一本實驗中應(yīng)用聚乙二醇的生理特性 聚乙二醇是中性、無毒且具有獨(dú)特理化性質(zhì)和良好的生物相溶性的高分子聚合物，聚乙二醇即PEG具有高度的親水性，在水溶液中有較大的水動力學(xué)體積，并且沒有免疫原性。當(dāng)藕聯(lián)到藥物分子或藥物表面時，可以將其優(yōu)良性質(zhì)賦予修飾后的藥物分子，改變它們在水溶液中的生物分配行為和溶解性，在其修飾的藥物周圍產(chǎn)生空間屏障，減少藥物的酶解，避免在腎臟的代謝中很快消除，并使藥物能被免疫系統(tǒng)的細(xì)胞識別。第20頁，共23頁，2022年，5月20日，5點23分，星期一 材料1.免疫球蛋白試劑A,M,G2.免疫球蛋白試劑A,M,G校準(zhǔn)品，蒸餾水3.微量加樣槍4.分光光度儀第21頁，共23頁，2