基因芯片的必備知識(shí)和操作流程

1、基因芯片技術(shù)的誕生為生物技術(shù)工作人員打開了一道科研的便利之門，曾被評(píng)為199年8年度十大科技進(jìn)展之一。本文對(duì)基因芯片的實(shí)驗(yàn)原理、技術(shù)基礎(chǔ)、分類、用途、操作主要環(huán)節(jié)等內(nèi)容做詳細(xì)的介紹?；蛐酒夹g(shù)的誕生為生物技術(shù)工作人員打開了一道科研的便利之門，曾被評(píng)為年年度十大科技進(jìn)展之一。本文對(duì)基因芯片的實(shí)驗(yàn)原理、技術(shù)基礎(chǔ)、分類、用途、操作主要環(huán)節(jié)等內(nèi)容做詳細(xì)的介紹?；驹砗图夹g(shù)基礎(chǔ)基因芯片以雜交為基本原理，基于和、和的互補(bǔ)關(guān)系。它是在探針的基礎(chǔ)上研制出的。所謂探針是一段人工合成或篩選出的已知順序的堿基序列?樣品分子上連接有一些、等可檢測(cè)的物質(zhì)。經(jīng)激光共聚焦熒光顯微鏡檢出雜交或反應(yīng)信號(hào)，通過計(jì)算機(jī)處理、分

2、析，即可獲得所需信息。例如，用紅、綠熒光分別標(biāo)記實(shí)驗(yàn)樣本和對(duì)照樣本的，混合后與微陣列雜交，可顯示實(shí)驗(yàn)樣本和對(duì)照樣本基因的表達(dá)強(qiáng)度（顯示紅色、綠色或黃色），由此可在同一微陣列上同時(shí)檢測(cè)兩樣本的基因表達(dá)差異。在基因芯片工作過程中，固定位點(diǎn)使用不同分子生物學(xué)技術(shù)和堿基互補(bǔ)配對(duì)原則與待測(cè)基因片段雜交，并通過自動(dòng)閱讀設(shè)備分析雜交結(jié)果，達(dá)到定性、定量分析的目的?；蛐酒ㄟ^應(yīng)用平面微細(xì)加工技術(shù)和超分子自組裝技術(shù)，把大量分子檢測(cè)單元集成在一個(gè)微小的固體基片表面，可同時(shí)對(duì)大量的核酸等生物分子實(shí)現(xiàn)高效、快速、低成本的檢測(cè)和分析?；蛐酒臋z測(cè)主要建立在放射標(biāo)記技術(shù)、熒光標(biāo)記技術(shù)、質(zhì)譜分析、化學(xué)發(fā)光等技術(shù)上。使用

3、熒光標(biāo)記的基因芯片需要專用的熒光掃描儀。對(duì)于高密度的基因芯片，目前最常用的是激光共聚焦顯微鏡和高性能的冷卻。目前專用于熒光掃描的掃描儀大致分為兩類：一類是基于，電荷耦合裝置的檢測(cè)光子另一類則是基于，光電倍增管的檢測(cè)系統(tǒng)。生物芯片的發(fā)展得益于微細(xì)加工技術(shù)和現(xiàn)代分子生物技術(shù)的結(jié)合。隨著人類基因組計(jì)劃的實(shí)施，現(xiàn)代分子生物技術(shù)也取得了巨大突破：體外基因擴(kuò)增技術(shù)實(shí)現(xiàn)了核酸樣品的快速制備和放大，基因擴(kuò)增后可進(jìn)行基因測(cè)序，而基因探針技術(shù)使得基因測(cè)序的檢測(cè)自動(dòng)化成為可能，極大地促使了生物芯片的發(fā)展。微陣列的加工借助的是微電子工業(yè)中應(yīng)用十分成熟的光學(xué)光刻技術(shù)和微機(jī)電系統(tǒng)加工中所采用的各種方法，根據(jù)要求在玻璃、塑

4、料、硅片等基底材料上加工出用于生物樣品分離、反應(yīng)的各種微細(xì)結(jié)構(gòu)，然后在微結(jié)構(gòu)上施加表面化學(xué)處理。光學(xué)光刻的第一步是通過光學(xué)制板照相制備掩模。制備好的掩模通常是鍍有鉻層的石英玻璃板，該鉻層事先已按微細(xì)結(jié)構(gòu)的圖形被刻蝕成透光和不透光兩個(gè)部分。第二步是光刻，讓掩模與表面涂有光刻膠的硅片接觸，然后讓光源通過掩模照射到硅片上。通過顯影光刻膠中的圖形，使其上未被掩模遮掩的部分被溶解除去。上述工作完成之后，通過對(duì)無膠保護(hù)的硅片用腐蝕劑蝕刻，再去除剩余的光刻膠便可獲得所需生物芯片的微細(xì)結(jié)構(gòu)。微米級(jí)甚至納米級(jí)的微細(xì)加工技術(shù)使得數(shù)以萬計(jì)的生物探針DNA片段、抗原和抗體等微觀結(jié)構(gòu)成功地排列在很小的芯片載體上，從而保

5、證了生物芯片檢測(cè)的集成化、微型化和高通量化。2基.因芯片的分類基因芯片是分子生物學(xué)和微細(xì)加工技術(shù)cccno相結(jié)合的產(chǎn)物，分類方法有多種。分類的依據(jù)主要有制作方法、載體材料、載體上所固定的DNA的種類、用途等。1根）據(jù)制作方法，可將基因芯片分為原位合成芯片與合成后點(diǎn)樣芯片（王升啟等，9前者利用光引導(dǎo)聚合技術(shù)c或壓電打印法cn進(jìn)行原位合成寡聚核苷酸探針，以美國A公司的芯片產(chǎn)品為代表;后者主要利用微型機(jī)械點(diǎn)樣法或化學(xué)噴射法將合成好的探針、cDNA或基因組DNA通過特定的高速點(diǎn)樣機(jī)器直接點(diǎn)在芯片片基上。2根）據(jù)芯片上固定的探針數(shù)量，可以將基因芯片分為高密度芯片和中低密度芯片兩類。高密度芯片上的探針數(shù)量

6、從幾萬到上百萬，主要是通過原位合成制備的寡核苷酸芯片，以及通過將數(shù)萬個(gè)基因或者序列的擴(kuò)增產(chǎn)物直接點(diǎn)至芯片上制備的cDNA芯片。高密度基因芯片主要用于大規(guī)模的基因表達(dá)譜測(cè)定、藥物篩選和新藥開發(fā)、基因功能探索等方面。中低密度芯片中探針的數(shù)目一般在幾十到幾千不等，一般是通過合成后點(diǎn)樣制備的芯片，主要用于基因突變分析、基因表達(dá)譜分析等領(lǐng)域?；蛐酒闹饕攸c(diǎn)是高通量。實(shí)際上中低密度芯片是基因芯片在臨床應(yīng)用上的發(fā)展趨勢(shì)，原因主要是以下兩點(diǎn)：盡管多數(shù)疾病的影響因素很多，但是在診斷和鑒別中的目的是具體的，所以檢測(cè)需要低通量的;中低密度芯片檢測(cè)的指標(biāo)較少，各指標(biāo)問的相互影響作用較小，在制作工藝和檢測(cè)結(jié)果上更能

7、保證準(zhǔn)確性。根據(jù)芯片上探針的不同，可將基因芯片分為寡核苷酸芯片和cDNA芯片。寡核苷酸芯片：用照相平版印刷術(shù)和固相合成術(shù)結(jié)合在基片上生成寡核苷酸，由首先在年報(bào)道。該技術(shù)是先在玻片上涂上光敏化學(xué)材料，蓋上罩，根據(jù)所要合成的堿基序列決定罩的透光位點(diǎn)。光照局部產(chǎn)生去防護(hù)作用，用所需核苷酸沖洗玻片，該核苷酸即在去防護(hù)部位粘合于玻片。核苷酸的5端修飾以光不穩(wěn)定的保護(hù)基團(tuán)，該基團(tuán)經(jīng)光照而去保護(hù)，與下一個(gè)核苷酸結(jié)合。如此重復(fù)直至獲得所需核苷酸長度。每一層各點(diǎn)的A、tc不同，故每合成一層核苷酸需要4個(gè)不同透光位點(diǎn)的罩和A、c分別沖洗一次。通過4Xn次步驟可合成含有n個(gè)核苷酸的寡核苷酸鏈。其主要特點(diǎn)是可按需要設(shè)

8、計(jì)一定序列的寡核苷酸鏈。美國的A公司已能生產(chǎn)4萬個(gè)寡核苷酸的芯片。cDNA芯片：將特定的或文庫的cDNA經(jīng)擴(kuò)增后用機(jī)械手點(diǎn)到基片上。最先由c于年報(bào)道。美國n公司的cDNA微陣列已達(dá)4cDNA.c4根根據(jù)芯片用途，可以將芯片分為基因表達(dá)譜芯片、測(cè)序芯片、診斷芯片等?；虮磉_(dá)譜芯片技術(shù)是一種領(lǐng)先的研究方法。例如，通過對(duì)人類基因組中成千上萬個(gè)基因的表達(dá)水平進(jìn)行高通量檢測(cè)來尋找具有差異的基因表達(dá)，從而預(yù)測(cè)個(gè)體患者的病程發(fā)展及治療效果，以最終實(shí)現(xiàn)疾病的個(gè)體化治療。DNA測(cè)序芯片則是基于雜交測(cè)序發(fā)展起來的，其原理是任何線狀的單鏈或者序列均可以分解成一系列堿基數(shù)固定、錯(cuò)落而重疊的寡核苷酸，又稱為亞序列，如果

9、能把原序列所有的錯(cuò)落重疊的亞序列全部測(cè)出，就可以據(jù)此組建出原序列。5根）據(jù)載體材料不同，可將基因芯片分為尼龍膜、玻璃片、塑料片、硅膠晶片、微型磁珠等。3基.因芯片的主要技術(shù)環(huán)節(jié)基因芯片技術(shù)能夠提供極為豐富的信息，但其操作流程并不復(fù)雜。應(yīng)用基因芯片進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的操作過程主要包括以下4個(gè)環(huán)節(jié)。其基本要點(diǎn)為：芯片方陣的構(gòu)建、樣品的制備、雜交反應(yīng)和信號(hào)的檢測(cè)及分析。1方.陣的構(gòu)建1探）針的制備。芯片的類型不同，制備探針的方法也不盡相同。如果是檢測(cè)表達(dá)譜，需要從待檢測(cè)樣品或者總中制備探針如果是檢測(cè)，則需要從待檢測(cè)樣品中通過制備探針或者人工合成寡核苷酸探針。2片）基處理。目前制備芯片主要采用表面化學(xué)的方法或組

10、合分類化學(xué)的方法來處理片基，然后使片段按順序排列在芯片上。經(jīng)特殊處理過的玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硅膠晶等都可作為載體材料。探針的固定化方法目前常用兩種：寡聚賴氨酸法、醛基一氨基法，其他方法（如巰基一雙硫鍵法）也在研究中。固定化的效率也不同。3點(diǎn)）樣。因芯片種類較多，點(diǎn)樣方法也不盡相同，但基本上可分為原位合成與微矩陣點(diǎn)樣兩大類。原位合成是目前制造高密度寡核苷酸最為成功的方法，具體又可分為光引導(dǎo)原位合成、噴墨打印和分子印跡原位合成三種方法。這三種技術(shù)所依據(jù)的固相合成原理相似，只是在合成前體試劑定位方面采取了不同的解決辦法，由于原位合成的短核酸探針陣列具有密度高、雜交速度快、效率高等優(yōu)點(diǎn)，而且雜交效

11、率受錯(cuò)配堿基的影響很明顯，所以原位合成的微點(diǎn)陣適合于進(jìn)行突變檢測(cè)、多態(tài)性分析、表達(dá)譜檢測(cè)、雜交測(cè)序等需要大量探針和高的雜交嚴(yán)謹(jǐn)性的實(shí)驗(yàn)。微矩陣點(diǎn)樣法是將等得到的?；蛏锓肿佑冕橖c(diǎn)或噴射的方法直接排列到載體上。該方法在多聚物的設(shè)計(jì)方面與前者相似，合成工作用傳統(tǒng)的合成儀完成，只是合成后用特殊的自動(dòng)化微量點(diǎn)樣裝置將其以比較高的密度涂布于芯片載體上。2樣.品的制備生物樣品是復(fù)雜的生物分子混合體，一般不能直接與芯片反應(yīng)，必須將樣品進(jìn)行生物處理。對(duì)于基因芯片，組織中獲取的樣品必須通過擴(kuò)增以提高檢測(cè)的靈敏度。1細(xì)）菌性樣本。檢測(cè)的對(duì)象如果是細(xì)菌性樣本，在必要的情況下，首先應(yīng)該進(jìn)行增菌處理，然后使用合適的方法

12、提取樣本中的，設(shè)計(jì)特異或通用的引物進(jìn)行擴(kuò)增，使樣品分子標(biāo)記上可以檢測(cè)的熒光分子。美國技術(shù)公司發(fā)展的一種固相系統(tǒng)包含兩套引物，每套引物都可從靶基因兩頭延伸10當(dāng)引物和樣品及試劑相混時(shí)，如果樣品包含靶序列，就從引物兩頭開始合成，并在引物之間形成雙鏈環(huán)。由于上述反應(yīng)在固相中產(chǎn)生，避免了引物競(jìng)爭現(xiàn)象，并可減少殘留物污染和重復(fù)引發(fā)。病毒性樣本。如果待檢樣本是病毒，病毒的操作過程與細(xì)菌性樣本的操作過程相似，而病毒則需要加入一個(gè)過程。目前，已有多種方法廣泛使用，目的是提高擴(kuò)增效率和特異性，如、巢式、長距離等。3雜.交反應(yīng)樣品與芯片的雜交反應(yīng)中涉及的因素主要有雜交溫度、雜交時(shí)間、雜交液的成分等。生物分子反應(yīng)是生物芯片技術(shù)中除方陣構(gòu)建外最重要的一步，其復(fù)雜的程度和具體控制條件由芯片中基因片段的長短和芯片本身的用途而定。如果是基因表達(dá)檢測(cè)，反應(yīng)時(shí)需要高鹽濃度、低溫和長時(shí)間。如果要檢測(cè)是否有突變，因涉及單個(gè)堿基的錯(cuò)配，故需要在短時(shí)間內(nèi)、低鹽、高溫條件下高特異性雜交。4信.號(hào)的檢測(cè)和分析信號(hào)檢測(cè)與分析即對(duì)生化反應(yīng)所得結(jié)果的分析測(cè)定?；蛐酒谂c熒光標(biāo)記的目標(biāo)或雜交后，必須用激光共聚焦掃描芯片和芯片掃描儀將芯片測(cè)定結(jié)果轉(zhuǎn)變成可供分析處理的圖像數(shù)據(jù)，此方法重復(fù)性好，但是靈敏度相對(duì)較低。目前正在研究的替代方法有質(zhì)譜法、化學(xué)發(fā)光和光導(dǎo)纖維、二極管方陣檢測(cè)、乳膠凝集反應(yīng)、直接