定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)

1、定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第1頁(yè)細(xì)胞工程教研室定量蛋白質(zhì)組學(xué)定量蛋白質(zhì)組學(xué)是指把一個(gè)基因組表示全部蛋白質(zhì)或一個(gè)復(fù)雜混合體系中目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確定量和判定。這一概念提出標(biāo)志著蛋白質(zhì)組技術(shù)不停改進(jìn)和完善。蛋白質(zhì)組學(xué)研究已從對(duì)蛋白質(zhì)簡(jiǎn)單定性向準(zhǔn)確定量方向發(fā)展。定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第2頁(yè)細(xì)胞工程教研室定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第3頁(yè)細(xì)胞工程教研室主要內(nèi)容 定量技術(shù)體系與分類 熒光染料分析法 同位素標(biāo)識(shí)技術(shù) 針對(duì)性親和標(biāo)簽技術(shù) 同位素標(biāo)識(shí)技術(shù)應(yīng)用定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第4頁(yè)細(xì)胞工程教研室一 定量技術(shù)體系和分類 技術(shù)體系雙向電泳-質(zhì)譜技術(shù)體系蛋白質(zhì)芯片分析體系基于同位素標(biāo)識(shí)質(zhì)譜分析技術(shù)體系

2、定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第5頁(yè)細(xì)胞工程教研室2-DE-MS技術(shù)體系無標(biāo)識(shí)蛋白質(zhì)雙向電泳熒光差異凝膠電泳基于同位素標(biāo)簽和自動(dòng)化串聯(lián)質(zhì)譜定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第6頁(yè)細(xì)胞工程教研室定量分析方法定性差異分析和定量差異分析絕對(duì)定量和相對(duì)定量凝膠差異分析和非凝膠差異分析標(biāo)識(shí)定量法和無標(biāo)識(shí)定量法定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第7頁(yè)細(xì)胞工程教研室二 熒光染料分析法雙向電泳（2-DE）凝膠染料顯示考馬斯亮藍(lán)銀染熒光染色熒光標(biāo)識(shí)定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第8頁(yè)細(xì)胞工程教研室 熒光雙向差異凝膠電泳（2D-DIGE）當(dāng)前，在傳統(tǒng)2-DE技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展出2D-DIGE，采取專有熒光染料（Cy2、Cy3、Cy5）與多重樣本和圖象分析方

3、法，在同一塊膠上可同時(shí)分離多個(gè)由不一樣熒光標(biāo)識(shí)樣品，并以熒光標(biāo)識(shí)樣品混合物為內(nèi)標(biāo)，對(duì)每個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)和每個(gè)差異都能夠進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)可信度分析，從而含有良好重復(fù)性和較高準(zhǔn)確率。另外，因?yàn)闊晒馊玖鲜褂?，使?D-DIGE含有高靈敏度特征，能夠滿足高通量定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究分析要求。定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第9頁(yè)細(xì)胞工程教研室定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第10頁(yè)細(xì)胞工程教研室熒光掃描儀定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第11頁(yè)細(xì)胞工程教研室定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第12頁(yè)細(xì)胞工程教研室三 同位素標(biāo)識(shí)技術(shù)原理 多肽和蛋白質(zhì)質(zhì)譜響應(yīng)值受許多難以控制原因影響，尤其是其離子化效率受其它物質(zhì)和條件影響很大，含有很強(qiáng)體系依賴性，因而不能對(duì)來自

4、相同肽段兩次質(zhì)譜檢測(cè)得到信號(hào)強(qiáng)度像色譜定量中那樣進(jìn)行比較定量。定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第13頁(yè)細(xì)胞工程教研室一個(gè)肽惟一適合內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)是標(biāo)識(shí)有穩(wěn)定同位素同一個(gè)肽。所以，在完整蛋白或消化后多肽中引進(jìn)穩(wěn)定同位素（如2H、13C、15N、18O）標(biāo)識(shí)小分子，用來識(shí)別不一樣品起源肽段，經(jīng)“輕”質(zhì)和“重”質(zhì)同位素標(biāo)識(shí)不一樣多肽相互作為內(nèi)標(biāo)，化學(xué)性質(zhì)基礎(chǔ)上是一樣，這么就能夠確保同一次質(zhì)譜掃描中二者離子化效果是相同，此時(shí)肽質(zhì)譜峰信號(hào)成對(duì)出現(xiàn)，質(zhì)譜峰信號(hào)強(qiáng)度就能夠作為定量依據(jù)。它們相對(duì)強(qiáng)度就準(zhǔn)確地反應(yīng)了原樣品中多肽百分比（也就是蛋白百分比）。 定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第14頁(yè)細(xì)胞工程教研室 分類同位素標(biāo)簽引入方法生物代

5、謝方式化學(xué)方式酶解過程引入同位素標(biāo)識(shí)引入法體內(nèi)標(biāo)識(shí)【代謝標(biāo)識(shí)法（SILAC）】體外標(biāo)識(shí)【化學(xué)標(biāo)識(shí)法（ICAT）】定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第15頁(yè)細(xì)胞工程教研室 生物代謝方式引入標(biāo)識(shí)原理 將一定量相同種類但表示水平不一樣兩個(gè)（細(xì)胞）樣品分別置于正常培養(yǎng)介質(zhì)和富含某重質(zhì)同位素（如：15N）相同介質(zhì)中培養(yǎng)，一定時(shí)間后將二者混合酶解，然后選擇性親和分離、色譜分離，并進(jìn)行質(zhì)譜分析。定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第16頁(yè)細(xì)胞工程教研室方法15N/14N蛋白質(zhì)標(biāo)識(shí)技術(shù) 分別用富含15N/14N細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)要比較細(xì)胞或者簡(jiǎn)單生物體，經(jīng)過生物代謝方式以15N替換氨基酸組成中14N，進(jìn)而把15N標(biāo)識(shí)引入蛋白質(zhì)組成中。因?yàn)?/p>

6、氨基酸組成不固定（從甘氨酸1個(gè)到精氨酸4個(gè)），所以還沒有把此標(biāo)識(shí)用在細(xì)胞培養(yǎng)上報(bào)道。定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第17頁(yè)細(xì)胞工程教研室細(xì)胞培養(yǎng)條件下穩(wěn)定同位素標(biāo)簽技術(shù)（SILAC） 經(jīng)過細(xì)胞正常代謝，把穩(wěn)定同位素標(biāo)識(shí)氨基酸引入到蛋白質(zhì)組成中，大大簡(jiǎn)化質(zhì)譜定量分析前人工處理復(fù)雜度?？捎迷诩?xì)胞培養(yǎng)條件下穩(wěn)定同位素有： 2H、13C和15N等。定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第18頁(yè)細(xì)胞工程教研室定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第19頁(yè)細(xì)胞工程教研室 酶解過程引入標(biāo)識(shí)18O/16O水 在兩個(gè)要比較蛋白質(zhì)樣品酶解過程中分別加入18O和16O水，這么可特異性地對(duì)酶解肽段C末端進(jìn)行標(biāo)識(shí)，等量混合后進(jìn)行質(zhì)譜分析樣品間蛋白質(zhì)組差異?；?/p>

7、合樣品須快速判定。酶解標(biāo)識(shí)H218O 在H218O溶液中進(jìn)行蛋白質(zhì)酶解，可在其C端穩(wěn)定結(jié)合1或2個(gè)18O原子。定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第20頁(yè)細(xì)胞工程教研室整體內(nèi)標(biāo)技術(shù)（GIST） 經(jīng)過用N-acetoxy-2H3-succinimide/ N-acetoxy-succinimide(NAS)乙酰化處理酶解肽段，把同位素標(biāo)簽引入樣本分析體系中。NAS可標(biāo)識(shí)必需氨基酸親和肽段N末端。因?yàn)殡亩我阴；稽c(diǎn)不一，被標(biāo)識(shí)重鏈和輕鏈質(zhì)量差也不固定，給自動(dòng)化分析帶來了一定困難。定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第21頁(yè)細(xì)胞工程教研室親和標(biāo)簽法引入標(biāo)識(shí)原理 同位素標(biāo)識(shí)親和標(biāo)簽技術(shù)（ICAT）由Gygi等于1999年創(chuàng)造。此

8、技術(shù)是利用同位素親和標(biāo)簽試劑，預(yù)先選擇性地標(biāo)識(shí)某一類蛋白質(zhì)，分離純化之后進(jìn)行MS判定。依據(jù)MS圖上不一樣同位素標(biāo)識(shí)親和標(biāo)簽試劑標(biāo)識(shí)一對(duì)肽段離子強(qiáng)度比值定量分析樣品相對(duì)豐度。定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第22頁(yè)細(xì)胞工程教研室ICAT試劑組成：反應(yīng)基團(tuán)（特異性結(jié)合肽鏈中半胱氨酸殘基巰基）連接子（結(jié)合穩(wěn)定同位素）親和標(biāo)簽生物素（可與卵白素結(jié)合，選擇性分離標(biāo)識(shí)多肽）定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第23頁(yè)細(xì)胞工程教研室操作流程同位素標(biāo)識(shí)親和標(biāo)簽輕試劑標(biāo)識(shí)細(xì)胞蛋白質(zhì)1同位素標(biāo)識(shí)親和標(biāo)簽重試劑標(biāo)識(shí)細(xì)胞蛋白質(zhì)2混合，胰酶水解陽(yáng)離子交換卵白素親和層析LC分離，MS分析，數(shù)據(jù)庫(kù)檢索定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第24頁(yè)細(xì)胞工程教研室優(yōu)

9、點(diǎn)兼容任何生長(zhǎng)條件下組織中蛋白質(zhì)樣品；烷基化反應(yīng)高度特異；只分離含有半胱氨酸殘基肽段，降低了體系復(fù)雜性；可對(duì)膜蛋白進(jìn)行判定和定量；建立在色譜技術(shù)基礎(chǔ)上，任何促進(jìn)蛋白質(zhì)溶解試劑都可使用；能直接判定和測(cè)量低豐度蛋白質(zhì)。定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第25頁(yè)細(xì)胞工程教研室缺點(diǎn)無法分析不含半胱氨酸蛋白質(zhì)；同位素標(biāo)簽存在影響肽段檢測(cè)和增加數(shù)據(jù)庫(kù)搜索復(fù)雜性；被標(biāo)識(shí)含有兩個(gè)半胱氨酸多肽質(zhì)量相差16u時(shí)與氧化作用極難區(qū)分；樣品成份復(fù)雜時(shí)，定量誤差會(huì)增大標(biāo)識(shí)效率含有時(shí)間依賴性，極難到達(dá)80%。定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第26頁(yè)細(xì)胞工程教研室應(yīng)用測(cè)定和定量膜蛋白判定和定量低豐度蛋白質(zhì)定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第27頁(yè)細(xì)胞工程教研

10、室 ICAT技術(shù)改進(jìn)用13C/12C代替2H/1H，消除LC同位素效應(yīng)固相同位素標(biāo)識(shí)親和標(biāo)簽可剪切同位素標(biāo)識(shí)親和標(biāo)簽（酸切 割或光切割）可裂解同位素標(biāo)識(shí)親和標(biāo)簽（cICAT）可視同位素標(biāo)識(shí)親和標(biāo)簽（VICAT）定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第28頁(yè)細(xì)胞工程教研室固相同位素標(biāo)識(shí)親和標(biāo)簽其是將ICAT試劑與玻璃珠結(jié)合，使之固相化，經(jīng)過固相捕捉和釋放等化學(xué)反應(yīng)過程，LCMS-MS分析蛋白質(zhì)肽段。該方法與傳統(tǒng)ICAT方法相比，更簡(jiǎn)單，更靈敏，更有效。而最大不一樣是固相ICAT試劑標(biāo)識(shí)蛋白質(zhì)是在酶解后進(jìn)行，而ICAT試劑標(biāo)識(shí)蛋白質(zhì)要求在酶解前。固相同位素標(biāo)簽試劑由4個(gè)別組成，氨丙基包被玻璃珠、含有O-硝基苯光裂

11、解連接子、連接7個(gè)氫或7個(gè)氘亮氨酸同位素標(biāo)簽和巰基特異反應(yīng)碘乙酰胺基團(tuán)。定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第29頁(yè)細(xì)胞工程教研室可裂解同位素標(biāo)識(shí)親和標(biāo)簽用13C/12C代替了2H/1H使用了酸裂解連接子不一樣肽段質(zhì)量相差9u或9u倍數(shù)親和標(biāo)簽試劑由3個(gè)別組成半胱氨酸特異性反應(yīng)基團(tuán)含9個(gè)同位素13C或12C標(biāo)簽可裂解連接子親和純化生物素定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第30頁(yè)細(xì)胞工程教研室可視同位素標(biāo)識(shí)親和標(biāo)簽是在cICAT技術(shù)基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量改進(jìn)方法。親和標(biāo)簽試劑由3種不一樣同位素標(biāo)簽組成。用來標(biāo)識(shí)樣品巰基標(biāo)識(shí)標(biāo)簽（VICAT）標(biāo)識(shí)內(nèi)標(biāo)多肽標(biāo)簽（14C-VICAT+6）等電聚焦標(biāo)識(shí)標(biāo)簽（14C-VICAT-28）

12、定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第31頁(yè)細(xì)胞工程教研室定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第32頁(yè)細(xì)胞工程教研室同位素標(biāo)識(shí)相對(duì)定量和絕對(duì)定量ICAT技術(shù)每次試驗(yàn)只能對(duì)兩個(gè)樣品進(jìn)行相對(duì)定量。新近出現(xiàn)多重元素標(biāo)識(shí)同位素標(biāo)識(shí)相對(duì)和絕對(duì)定量技術(shù)（iTRAQ）在一定程度上處理了這一問題。它是年由ABI企業(yè)推出一個(gè)能夠同時(shí)對(duì)四組樣品進(jìn)行定量分析方法，對(duì)于試驗(yàn)設(shè)計(jì)比較多組樣品給予了有力支持。 定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第33頁(yè)細(xì)胞工程教研室iTRAQ試劑是非多聚體等質(zhì)量標(biāo)識(shí)試劑，是由四種試劑組成一組試劑，這四種試劑分子量相同。每一個(gè)試劑都包含三個(gè)別：一個(gè)匯報(bào)基團(tuán)（分子量分別為114u、115u、116u和117u）、一個(gè)平衡基團(tuán)（分子

13、量分別為31u、 30u、29u和28u）和一個(gè)與肽段反應(yīng)基團(tuán)。當(dāng)咱們需要同時(shí)比較四組不一樣品時(shí)，樣品分別跟四種iTRAQ試劑結(jié)合，然后混合在一起做質(zhì)譜判定。定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第34頁(yè)細(xì)胞工程教研室定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第35頁(yè)細(xì)胞工程教研室與ICAT試劑相比優(yōu)點(diǎn)是通量大。iTRAQ試劑對(duì)氨基標(biāo)識(shí)是一個(gè)普遍標(biāo)識(shí)模式，它幾乎全部肽段都能被標(biāo)識(shí)。不過，假如用這種普遍標(biāo)識(shí)方法來大規(guī)模判定和定量蛋白質(zhì)(理論上說，每個(gè)蛋白質(zhì)只要有一條肽段就能夠?qū)ζ溥M(jìn)行判定和定量)，則是一件費(fèi)時(shí)費(fèi)勁事情。另外，在iTRAQ試劑標(biāo)識(shí)需要反應(yīng)體系有機(jī)相體積高達(dá)60以上，蛋白質(zhì)樣品很輕易發(fā)生沉淀而損失，這也是該試劑一個(gè)弱點(diǎn)

14、。定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第36頁(yè)細(xì)胞工程教研室四 針對(duì)性親和標(biāo)簽技術(shù) 磷酸化蛋白質(zhì)同位素標(biāo)識(shí)親和標(biāo)簽PHIAT技術(shù)是建立在ICAT技術(shù)基礎(chǔ)上研究和判定磷酸化蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)新方法，且對(duì)低豐度蛋白質(zhì)判定有效。PHIAT試劑含有親核巰基和同位素標(biāo)簽及其共價(jià)結(jié)合生物素基團(tuán)。利用此方法已成功判定了酪蛋白和酵母提取物磷酸化位點(diǎn)。定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第37頁(yè)細(xì)胞工程教研室選擇性標(biāo)識(shí)特異性氨基酸同位素化學(xué)探針標(biāo)識(shí)半胱氨酸標(biāo)識(shí)色氨酸標(biāo)識(shí)氨基酸N末端標(biāo)識(shí)羧基標(biāo)識(shí)定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第38頁(yè)細(xì)胞工程教研室非同位素化學(xué)探針標(biāo)識(shí) （Label-free LC MS/MS ）賴氨酸標(biāo)識(shí) 質(zhì)量豐度編碼標(biāo)簽（MCAT）是一個(gè)色譜標(biāo)識(shí)定量法。組氨酸標(biāo)識(shí) 利用了固相金屬親和色譜可富集