《生化分離工程》第三章 沉淀

1、第三章 沉淀主要內(nèi)容第一節(jié) 蛋白質(zhì)表面特性第二節(jié) 蛋白質(zhì)沉淀方法2第一節(jié) 蛋白質(zhì)表面特性蛋白質(zhì)表面由不均勻分布的荷電基團(tuán)形成的荷電區(qū)、親水區(qū)和疏水區(qū)構(gòu)成。蛋白質(zhì)的水溶液呈膠體性質(zhì)，在蛋造白質(zhì)分子周圍存在與蛋白質(zhì)分子緊密或疏松結(jié)合的水化層。是蛋白質(zhì)形成穩(wěn)定的膠體溶液、防止蛋白質(zhì)凝聚沉淀的屏障之一。蛋白質(zhì)沉淀的另一屏障是蛋白質(zhì)分子間的靜電排斥作用。當(dāng)雙電層的電位足夠大時(shí)，靜電排斥作用抵御分子間的相互吸引作用，使蛋白質(zhì)溶液處于穩(wěn)定狀態(tài)。3第二節(jié) 蛋白質(zhì)沉淀的方法鹽析沉淀法等電點(diǎn)沉淀法有機(jī)溶劑沉淀法非離子型聚合物沉淀法聚電解質(zhì)沉淀法多價(jià)金屬離子沉淀法親和沉淀法4 鹽析沉淀法：蛋白質(zhì)在高離子強(qiáng)度溶液中溶

2、解度降低，發(fā)生沉淀的現(xiàn)象。1.鹽析法中性鹽：硫酸銨、硫酸鈉、檸檬酸鈉等5鹽析沉淀原理:由于加入大量的中性鹽破壞了蛋白質(zhì)的水化膜、中和其所帶的電荷從而使蛋白質(zhì)分子聚集而沉淀析出。6lgS=-Ks 蛋白質(zhì)的鹽析行為常用Cohn經(jīng)驗(yàn)式表示：式中S為蛋白質(zhì)的溶解度； 為離子強(qiáng)度； 為常數(shù)，與鹽的種類無(wú)關(guān)，但與溫度和pH有關(guān)； Ks為鹽析常數(shù)，與鹽的種類有關(guān)，但與溫度和pH無(wú)關(guān)。Ks分級(jí)鹽析法：在一定的pH和溫度條件下，改變鹽的濃度(即離子強(qiáng)度)達(dá)到沉淀的目的。分級(jí)鹽析法：在一定的離子強(qiáng)度條件下，改變?nèi)芤旱膒H和溫度達(dá)到沉淀的目的。7影響鹽析的因素(1)無(wú)機(jī)鹽種類：離子半徑小，帶電多，電荷密度高的陰離子

3、，鹽析效果好。(2)pH值：pH影響Cohn方程中的值，pH值接近蛋白質(zhì)pI值時(shí)，蛋白質(zhì)溶解度最小。 (3)溫度：T影響Cohn方程中的值。溫度升高，降低；溫度降低 ，升高。 8 不同的蛋白質(zhì)分子，由于其分子表面的極性基團(tuán)的種類、數(shù)目以及排布的不同，其水化層厚度不同，故鹽析所需要的鹽濃度也不一樣，因此調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的中鹽濃度，可以使不同的蛋白質(zhì)分別沉淀。如：血清球蛋白清蛋白(NH4)2SO450%飽和度飽和析出析出分段鹽析9常用的鹽析劑是硫酸銨，因?yàn)樗柠}析能力強(qiáng)，在水中的溶解度大，價(jià)格便宜，濃度高時(shí)也不會(huì)引起蛋白質(zhì)活性喪失。鹽析沉淀的蛋白質(zhì)仍保持天然構(gòu)象，即仍有活性。蛋白質(zhì)用鹽析方法沉淀分離后，

4、還需要脫鹽才能進(jìn)一步精提純。脫鹽常用透析法。 透析是將含有小分子雜質(zhì)的蛋白質(zhì)溶液裝在半透膜（玻璃紙、火綿紙等）制的透析袋里放在緩沖液中進(jìn)行，可不斷更換緩沖液，直至雜質(zhì)被除去。10透析只用于除鹽類和小分子雜質(zhì)11透析只用于除鹽類和小分子雜質(zhì)12超濾除小分子雜質(zhì)，分離、濃縮蛋白質(zhì)加壓蛋白質(zhì)溶液半透膜支持膜的柵板超濾液132 等電點(diǎn)沉淀利用蛋白質(zhì)在pH等于其等電點(diǎn)的溶液中溶解度下降的原理進(jìn)行沉淀分級(jí)的方法稱為等電點(diǎn)沉淀法。不同的蛋白質(zhì)有不同的等電點(diǎn)，因此通過(guò)調(diào)節(jié)溶液pH到目的蛋白的等電點(diǎn)，可使之沉淀而與其它蛋白質(zhì)分開(kāi)，從而除去大量雜蛋白。沉淀原理：蛋白質(zhì)在其等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低。 143 有機(jī)溶劑沉淀

5、法有機(jī)溶劑沉淀：向含有目標(biāo)物質(zhì)的溶液中加入水溶性的有機(jī)溶劑(如丙酮，乙醇等)，而使目標(biāo)物質(zhì)發(fā)生沉淀的方法。沉淀原理：A 有機(jī)溶劑能破壞溶質(zhì)分子的水化層，降低溶質(zhì)的溶解度；B 有機(jī)溶劑降低水溶液的介電常數(shù)，使溶質(zhì)分子間的靜電引力（庫(kù)侖力）增大，導(dǎo)致溶質(zhì)的凝集和沉淀。 154 非離子型聚合物沉淀法 非離子型聚合物：利用一些非離子型的高聚物來(lái)沉淀蛋白質(zhì)的方法。沉淀原理：可能有降低蛋白質(zhì)分子表面的水化程度或空間排阻作用 165 聚電解質(zhì)沉淀法聚電解質(zhì)沉淀法：利用一些含有重復(fù)離子化基團(tuán)的水溶性聚合物來(lái)沉淀蛋白質(zhì)的方法沉淀原理：與絮凝類似，在蛋白質(zhì)間起架橋作用，同時(shí)還兼有鹽析、降低水化程度和電荷中和等作用。176 多價(jià)金屬離子沉淀法多價(jià)金屬離子：向蛋白質(zhì)溶液中加入一些高價(jià)金屬離子而使蛋白質(zhì)沉淀下來(lái)。沉淀原理：金屬離子可與蛋白質(zhì)分子上的某些殘基發(fā)生作用而使蛋白質(zhì)沉淀。 187 親和沉淀法親和沉淀是利用蛋白質(zhì)與特定的生物的或合成的分子（免疫配位體、基質(zhì)、輔酶等）之間高度專一的相互作用而設(shè)計(jì)出來(lái)的一種特殊選擇性的分離技術(shù)。沉淀原理不是依據(jù)蛋白質(zhì)溶解度的差異，而是依據(jù)“吸附”有特殊蛋白質(zhì)的聚合物的溶解度的大小。19親和過(guò)程提供了一個(gè)從復(fù)雜混合物中分離提取單一產(chǎn)品的有效方法。初始階段，將一個(gè)目標(biāo)蛋白質(zhì)與鍵合在可溶性載體上的親合配位體絡(luò)和形成沉淀；所