抗體的純化與檢測

1、 抗體純化和檢測抗體純化抗體檢測 第1頁怎么純化我們想要抗體？第2頁常見單抗結(jié)構(gòu)、種類、性質(zhì)第3頁每個單抗等電點、電荷密度、疏水性、糖基化程度等生化性質(zhì)各不相同。選擇單抗純化方法，既要了解他們共性，又要了解個性，從而制訂對應(yīng)純化策略(下表 3)。單抗特征及純化策略第4頁純化步驟#抗體純化#第5頁抗體 純化步驟#抗體純化#第6頁飽和硫酸銨沉淀法 飽和硫酸氨分級沉淀法是從溶液中分離蛋白質(zhì)慣用方法。這是一個比較原始，非特異性分離技術(shù)。飽和硫酸氨沉淀法作為抗體純化第一步,難以得到高純度抗體。不過它能夠濃縮和出去大部分蛋白質(zhì)，尤其是脂蛋白#抗體純化#第7頁鹽離子溶液水分子蛋白質(zhì)溶液競爭關(guān)系溶解度基本原理

2、這種方法稱之為鹽析。鹽濃度通慣用飽和度來表示。硫酸銨因其溶解度大，溫度系數(shù)小和不易使蛋白質(zhì)變性而被廣泛應(yīng)用。水化膜強弱第8頁2， 操作步驟 以腹水或組織培養(yǎng)上清液為例來介紹抗體硫酸銨沉淀。各種不一樣免疫球蛋白鹽析所需硫酸 銨飽和度也不完全相同。通慣用來分離抗體硫酸銨飽和度為 33% 50% （一）配制飽和硫酸銨溶液（ SAS ） 依據(jù)樣品中蛋白質(zhì)含量以及種類配制飽和濃度硫酸銨溶液來沉淀樣品中大多數(shù)蛋白質(zhì)。當(dāng)然這一步也有利于后邊層析。第9頁出去雜質(zhì)破碎沉淀細胞抗體在里邊鹽析蛋白充分沉淀蛋白樣品預(yù)處理10000r，30min離心保留上清液加入飽和SAS（1:1）攪拌過夜（4度）第10頁透析袋沉淀離

3、心沉淀蛋白沉淀10000r，30min，離心溶解PBS溶液疊氮鈉棄上清液蛋白成份：抗體，極少許雜蛋白，SAS3-6個小時更換一次透析緩沖液（24-48h）第11頁 親和層析是一個快速有效生物活性物質(zhì)純化方法,它經(jīng)過偶聯(lián)蛋白對目標(biāo)蛋白選擇性吸收和分離,可取得較高純化效果,且操作簡便,廣泛地應(yīng)用于試驗室抗體純化。因為產(chǎn)品價格昂貴,使用成本較高,限制了它利用。Protein A/G親和層析第12頁Protein A A 蛋白是金黃色葡萄球菌表面蛋白,分子量為42 KD ,有6 個不一樣IgG結(jié)合位點。其中有5 個位點對IgGFc 片段顯示很強特異性親和力,不一樣位點獨立地與抗體結(jié)合。但IgA , I

4、gM , IgE 也可能結(jié)合在配體上,當(dāng)?shù)竭_飽和時,一個A 蛋白分子最少能夠結(jié)合兩個IgG分子。A 蛋白對IgG有高親和力和特異性,這一特點使之非常適適用于純化腹水或細胞培養(yǎng)上清中單克隆抗體第13頁Protein G G蛋白是一個源自鏈球菌G族細胞表面蛋白，一個三型Fc受體。其經(jīng)過類似于A蛋白非免疫機制與抗體Fc段結(jié)合。像A蛋白一樣，G蛋白與IgG Fc 區(qū)域特異性結(jié)合，不一樣是，Protein G Sepharose 還能夠特異性低親和地與重鏈CH1及輕鏈C 結(jié)合而用于純化Fab 及F(ab)2。另外，ProteinG能夠廣泛、更強地結(jié)合許多類型IgG，多克隆IgG及人IgG，同時血清蛋白結(jié)

5、合水平更低，純度更高，配體脫落也相對更低。第14頁重鏈第15頁Protein A-Sep harose CL2-4B 親和層析柱分離提純IgG Protein A-Sepharose CL24B 親和層析法原理: A 蛋白可與IgG上Fc 段特異性地結(jié)合,與小鼠IgG各亞類表現(xiàn)為不一樣結(jié)協(xié)力,結(jié)合強弱程度依次是: IgG2a IgG2b IgG3 IgG1 。A 蛋白這種結(jié)合也是含有p H 依賴性,即可利用改變p H 及離子強度,純化與其結(jié)合較弱IgG1。第16頁洗脫腹水處理裝柱平衡上樣1r，15min，去除大凝塊將Protein A-Sep harose CL-4B 干粉溶解,再用p H 7

6、. 4 磷酸鹽緩沖液 浸泡15min ,然后裝入層析柱中。緩沖液平衡柱子，測ph=7.4緩沖液稀釋，濾膜過濾用ph=4.0檸檬酸溶液洗脫抗體，再用ph=9.0Tris-hcl緩沖液調(diào)整至7.0。應(yīng)用A KTA explorer100 進行監(jiān)測,當(dāng)觀察到基線開始上升,即出現(xiàn)洗脫峰時,開始搜集洗脫液第17頁至洗脫峰回到基線后，使用上樣緩沖液平衡柱子平衡電泳判定采取SDS 不連續(xù)丙烯酰胺凝膠電泳第18頁層析圖及電泳結(jié)果第19頁AKTA蛋白純化系統(tǒng)AKTA主要是依據(jù)電導(dǎo)率不一樣級鹽濃度不一樣來洗脫不一樣物質(zhì)。系統(tǒng)主要分為兩部分，分別是檢測系統(tǒng)和層析柱，依據(jù)洗脫不一樣ph值來確定洗脫物質(zhì)是什么。當(dāng)然全自

7、動AKTA系統(tǒng)能夠多柱，多樣品，多緩沖液，多組份檢測，其檢測功效包含多波長紫外/可見光、電導(dǎo)、pH、壓力、溫度、等等。功效很強大。第20頁MabSelect 系列大規(guī)?？贵w純化親和層析介質(zhì)MabSelect 是一系列最新大規(guī)模純化抗體親和層析介質(zhì)。它們特點包含：更高流速和動態(tài)載量 更低宿主雜蛋白吸附，抗體純度更高更低蛋白A脫落更易于工藝線性放大MabSelect易于清洗與除菌，壽命更長、更經(jīng)濟生產(chǎn)過程無動物血清成份第21頁CaptoAdhere原理：Capto Adhere介質(zhì)專為治療用抗體分離純化而設(shè)計，其配基 (N-Benzyl-N-methylethanolamine）綜合了陰離子交換、

8、氫鍵和疏水等各種復(fù)雜作用方式，所以對于抗體聚集體含有非常獨特而高效去除能力；另外，經(jīng)過有效試驗設(shè)計 (Design of Experiment，DoE)，Capto Adhere介質(zhì)還能夠同時有效去除泄漏蛋白A配基、宿主蛋白、核酸、內(nèi)毒素和潛在病毒。Capto Adhere是一個流穿模式純化系統(tǒng)，能夠?qū)⑺拗鞯鞍?、脫落蛋白A和聚集體降低到很低水平，載量可達100-200mg/ml介質(zhì)，單步收率90%。另外，Capto Adhere還含有很強病毒去除能力。第22頁將Mabselect SuRe和Capto Adhere相結(jié)合進行兩步層析純化。Mabselect SuRe能夠到達99%抗體純度，親和洗脫峰使用Captoadhere流穿模式進行精純: 使抗體分子流穿而聚集體、宿主蛋白、脫落蛋白A配基等雜質(zhì)結(jié)合在Adhere柱上加以去除。這么僅用兩步層析就能夠得到符合藥用級質(zhì)量要求高純度抗體產(chǎn)品，大大縮短了工藝時間，提升生產(chǎn)效率，同時增加了收率，降低了生產(chǎn)成本。兩步層析工藝第23頁