國家自然科學(xué)基金申請書范本

1、項目類不申報學(xué)科代碼1科學(xué)部編號CC03030310國家自然科學(xué)基金申 請 書項目名稱：MSC對先天性巨結(jié)腸癥腸道神經(jīng)組織重建的實驗研究申 請 者： 所在單位： 郵政編碼： 410016通訊地址： 重慶市渝中區(qū)醫(yī)學(xué)院路號電 話： 4傳 真： 6申請日期： 2000年12月國 家 自 然 科 學(xué) 基 金 委 員 會一九九七年制填 報 講 明 一、填寫申請書前，請先查閱國家自然科學(xué)基金有關(guān)項目申請方法及規(guī)定。申請書各項內(nèi)容，要實事求是，逐條認(rèn)真填寫。表達(dá)要明確、嚴(yán)謹(jǐn)，字跡要清晰易辨。外來語要同時用原文和中文表達(dá)。第一次出現(xiàn)的縮寫詞，須注出全稱。 二、申請書為十六開本，復(fù)印時用B5復(fù)印紙，于左側(cè)裝訂

2、成冊。第三頁起各欄空格不夠時，請自行加頁。一式六份（至少一份為原件），由所在單位審查簽署意見后，按申報學(xué)科投送國家自然科學(xué)基金委員會對口科學(xué)部。地區(qū)科學(xué)基金項目，申請書另報送?。ㄗ灾螀^(qū)）科委一份原件。 三、封面右上角“科學(xué)部編號”由對口科學(xué)部填寫，項目類不和申報學(xué)科代碼1由申請者填寫。 四、下列人員不得作為申請項目的負(fù)責(zé)人提出申請，但可作為項目組成員參加研究： 在讀（含在職）研究生 已離退休的科研人員 申請單位的兼職科研人員 五、申請者和項目組中具有高級專業(yè)技術(shù)職務(wù)的要緊成員申請（含參加）的項目數(shù)，連同在研的國家自然科學(xué)基金項目數(shù)（不含重點項目、重大項目），不得超過兩項。 六、同一項目組研究內(nèi)

3、容相近的項目，只同意報送一個學(xué)科。 七、申請者可因同類項目競爭等緣故，提出不宜評議本項目的專家名單（姓名與單位，3人以內(nèi)），密封于信封中，釘在申請書原件封面，或另專函相關(guān)學(xué)科，供科學(xué)部選擇同行評議人時參考?？茖W(xué)部將對此信息保密。 八、國家自然科學(xué)基金委員會通訊地址：北京市海淀區(qū)花園北路35號東門 郵政編碼：100083 一、簡表1研究內(nèi)容和意義摘要通過MSC體外培養(yǎng)，轉(zhuǎn)化為神經(jīng)干細(xì)胞，進(jìn)而基因轉(zhuǎn)染，體內(nèi)移植，誘導(dǎo)分化等方法探索對先天性巨結(jié)腸癥動物無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞段進(jìn)行神經(jīng)支配重建的途徑和效果。本研究的完成將采用細(xì)胞工程原理和方法代替手術(shù)方法,從根本上改進(jìn)先天性巨結(jié)腸癥的治療及預(yù)后，豐富臨床神經(jīng)生物

4、學(xué)的發(fā)展。主題詞1. 主題詞數(shù)量不多于三個；2. 主題詞之間空一格（英文用/分隔）。中文MSC神經(jīng)干細(xì)胞先天性巨結(jié)腸癥英文mesenchymal stem cell / neuronal stem cell / aganglionic bowel簡 表 填 寫 要 求一、簡表內(nèi)容將輸入計算機，必須逐項認(rèn)真填寫，采納國家公布的標(biāo)準(zhǔn)簡化漢字。簡表中所有代碼以最新公布的國家自然科學(xué)基金申請項目分類目錄及代碼為準(zhǔn)填寫。高技術(shù)探究課題主題號按高技術(shù)新概念新構(gòu)思探究課題項目指南中主題號填寫，申請其重點項目時項目類不也填寫B(tài)，并在申請書封面右上角加注“高技術(shù)探究課題重點項目”。二、凡選擇性欄目，將相應(yīng)提示符

5、A、B等之一填入該欄的右下角。三、部分欄目填寫要求：項目名稱應(yīng)確切反映研究內(nèi)容和范圍，最多不超過25個漢字 (包括標(biāo)點符號）?；A(chǔ)研究指以認(rèn)識自然現(xiàn)象、探究自然規(guī)律為目的，不直接考慮應(yīng)用目標(biāo)的研究活動。應(yīng)用基礎(chǔ)研究指有廣泛應(yīng)用前景，但以獵取新原理、新技術(shù)、新方法為要緊目的的研究。申報學(xué)科申請項目所屬的最基礎(chǔ)學(xué)科。如涉及多學(xué)科可填寫兩個，先填為主學(xué)科。申請金額以萬元為單位，用阿拉伯?dāng)?shù)字表示，注意小數(shù)點。起止年月起始時刻從申請的次年1月算起。終止時刻為完成年度的 12月。所用實驗室系指研究項目將利用的實驗室，僅填寫國家計委批準(zhǔn)的國家重點實驗室或部門批準(zhǔn)的開放實驗室。所在單位名稱及代碼按單位公章填寫

6、全稱。例如“中國科學(xué)院西安光學(xué)周密機械研究所”不得填“中科院西安光機所”或“西安光機所”。全稱中的數(shù)字，一律寫中文，例如：中國航天工業(yè)總公司第七一所。首次申請國家自然科學(xué)基金的單位，尚未編入單位代碼，其代碼暫不填寫。參加單位數(shù)指研究項目組要緊成員所在單位數(shù)，包括主持單位和合作單位(合作者所在單位)，以阿拉伯?dāng)?shù)字表示。項目組要緊成員指在項目組內(nèi)對學(xué)術(shù)思想、技術(shù)路線的制訂與理論分析及對項目的完成起重要作用的人員，本人應(yīng)在申請書上親自簽名。本欄雙線右側(cè)內(nèi)容不輸入計算機。研究內(nèi)容和意義摘要與主題詞均錄入軟盤。2 二、立論依據(jù)（包括項目的研究意義、國內(nèi)外研究現(xiàn)狀分析，并附要緊參考文獻(xiàn)及出處） 對基礎(chǔ)研究

7、，著重結(jié)合國際科學(xué)進(jìn)展趨勢，論述項目的科學(xué)意義；對應(yīng)用基礎(chǔ)研究，著重結(jié)合學(xué)科前沿、圍繞國民經(jīng)濟和社會進(jìn)展中的重要科技問題，論述其應(yīng)用前景。先天性巨結(jié)腸癥（Hirschsprungs disease，HD）是小兒外科領(lǐng)域內(nèi)的一種常見性疾病，發(fā)病率為1/20001/5000。對HD 臨床及基礎(chǔ)研究一直是小兒外科研究的熱點之一。此疾病的發(fā)生是由于多種緣故使胚胎期神經(jīng)嵴細(xì)胞在消化道移行受阻，結(jié)腸壁肌間神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺如，病變結(jié)腸痙攣收縮，腸內(nèi)容物排出受阻，近端腸管繼發(fā)性擴張形成巨結(jié)腸，阻礙兒童健康成長。自發(fā)覺HD的病因以來，HD的治療要緊依靠手術(shù)切除遠(yuǎn)端無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞段，手術(shù)方式較多，由于各種術(shù)式固有缺陷，

8、目前仍存在各種并發(fā)癥，阻礙HD患兒術(shù)后恢復(fù)。尋求更為有效及安全的針對HD的治療方法，一直是國內(nèi)外小兒外科工作者努力的方向。在臨床及科研工作中我們注意到細(xì)胞療法（cell therapy）近年來已成為治療多種疾病的新策略，在替代，修復(fù)或加強受損的組織或器官的生物學(xué)功能方面有巨大作用。細(xì)胞療法中應(yīng)用的靶細(xì)胞之一，神經(jīng)干細(xì)胞，目前已成為研究熱點。傳統(tǒng)的發(fā)生生物學(xué)認(rèn)為人體神經(jīng)細(xì)胞一經(jīng)受損就永久不能再生新的神經(jīng)元。然而隨著神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā)覺，受損神經(jīng)細(xì)胞不能恢復(fù)的觀點正在發(fā)生變化。神經(jīng)干細(xì)胞是一種終身具有自我更新能力的細(xì)胞，其子細(xì)胞能分化產(chǎn)生神經(jīng)系統(tǒng)的各類細(xì)胞，干細(xì)胞通過不對稱分裂產(chǎn)生一個祖細(xì)胞和另一個干

9、細(xì)胞，祖細(xì)胞具有有限的自我更新能力，并自發(fā)分化產(chǎn)生成神經(jīng)元細(xì)胞和成膠質(zhì)細(xì)胞等，從而生成神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。已有研究表明神經(jīng)干細(xì)胞具有潛在多向分化能力，能在一定條件下定向分化，具有較強的增殖能力，移植入成體神經(jīng)組織后易于存活，目前神經(jīng)干細(xì)胞在損傷神經(jīng)組織，細(xì)胞的修復(fù)方面已顯示出良好的應(yīng)用前景2。HD病因為胚胎早期神經(jīng)嵴細(xì)胞移行受阻的結(jié)果，以往我們對HD的研究中也發(fā)覺HD病變腸段不僅存在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞異常，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞也表現(xiàn)出異常，進(jìn)一步支持了HD病因系胚胎早期神經(jīng)嵴細(xì)胞移行異常的結(jié)果。關(guān)于這種病變腸段無神經(jīng)節(jié)的異常神經(jīng)支配可否通過神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行移植修復(fù)呢？ 結(jié)論是確信的，Natarajan等在體外

10、實驗中觀看到正常鼠的神經(jīng)嵴細(xì)胞可在體外修復(fù)培養(yǎng)中的RET.K突變鼠(一種HD動物模型)病變腸段神經(jīng)支配，且前瞻性地指出了神經(jīng)嵴細(xì)胞移植可能成為今后先天性巨結(jié)腸癥的治療手段3 。目前的問題是在臨床實踐中診斷的HD患兒均在出生后，此刻神經(jīng)嵴細(xì)胞分化成熟，3-1且此3-2類患兒病變腸段不僅有神經(jīng)節(jié)異常，尚有腸道平滑肌，結(jié)締組織的增生等細(xì)胞外基質(zhì)變化，單純的神經(jīng)嵴細(xì)胞移植一方面神經(jīng)嵴細(xì)胞來源受限，另一方面能否在體內(nèi)改造病變腸段的病理變化，仍需進(jìn)一步研究。近年來干細(xì)胞的基因修飾治療進(jìn)展較快，國外有人發(fā)覺將表達(dá)神經(jīng)營養(yǎng)因子的神經(jīng)干細(xì)胞直接種植于受傷的腦組織中，能促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)。神經(jīng)干細(xì)胞在受到堿性成纖

11、維細(xì)胞因子（FGF-2）和上皮細(xì)胞生長因子（EGF）刺激時可分化出神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，EGF可維持神經(jīng)干細(xì)胞的生成，F(xiàn)GF-2對干細(xì)胞的分化起重要作用；有專門多神經(jīng)因子（如血小板生長因子，轉(zhuǎn)化生長因子等）對神經(jīng)干細(xì)胞的分化起著協(xié)同作用。誘導(dǎo)分化劑維甲酸對神經(jīng)干細(xì)胞也有誘導(dǎo)分化作用3。關(guān)于HD病變腸段不僅有神經(jīng)節(jié)異常，尚有腸道平滑肌，結(jié)締組織的增生等變化的現(xiàn)象，我們注意到纖溶酶原激活因子（PA）能激活纖溶酶原，水解纖維蛋白，及細(xì)胞外基質(zhì)中的纖連蛋白(fibronectin, Fn)，層粘連蛋白（laminin，Ln），基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase enzyme,

12、 MMP）能分解周圍組織細(xì)胞外基質(zhì)，如將PA，MMP的cDNA轉(zhuǎn)染修飾神經(jīng)干細(xì)胞將有可能對HD病變段的病理變化進(jìn)行改造，有利于神經(jīng)干細(xì)胞生長，發(fā)育。通過探究阻礙神經(jīng)干細(xì)胞移植，生長，分化的分子機制，結(jié)合基因工程技術(shù)，將可為神經(jīng)干細(xì)胞移植治療成功制造條件。鑒于神經(jīng)干細(xì)胞的多向分化潛能，在大腦，脊髓中的損傷修復(fù)研究中令人鼓舞的發(fā)覺，自體造血干細(xì)胞等分化為神經(jīng)干細(xì)胞可能性的提出4 （此將為神經(jīng)干細(xì)胞自體移植提供一個專門好的來源），以及神經(jīng)干細(xì)胞目前被認(rèn)為是一種更優(yōu)于成纖維細(xì)胞的基因治療的載體細(xì)胞5，針對上面的問題我們提出如下假講：如同神經(jīng)干細(xì)胞移植在恢復(fù)受損大腦，脊髓神經(jīng)功能上具有良好的應(yīng)用前景一樣

13、，通過各種人工方法修飾后，神經(jīng)干細(xì)胞移植有恢復(fù)HD 病變腸段的正常神經(jīng)支配的可能。細(xì)胞移植盡管已被認(rèn)為關(guān)于修復(fù)神經(jīng)組織是有效的治療方法，但目前使用的細(xì)胞多取自胚胎，如此一方面細(xì)胞來源有限，另一方面存在異體免疫排斥作用。神經(jīng)干細(xì)胞能夠在體外大量增殖，但目前要緊在海馬和室管膜下層發(fā)覺有神經(jīng)干細(xì)胞分布，如此造成了神經(jīng)干細(xì)胞來源困難。骨髓中有兩類干細(xì)胞，即造血干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell, MSC）。前者的移植已成功用于臨床治療白血病，但其移植需要獲得足夠數(shù)量的造血干細(xì)胞，同時造血干細(xì)胞體外擴增存在困難。MSC易于從骨髓中分離，體外擴增簡單，長期培養(yǎng)過程中能保持多向

14、分化潛能。近期美國學(xué)者Woodbury等在體外實驗中成功地將源于成年大鼠及人骨髓MSC轉(zhuǎn)化為神經(jīng)干細(xì)胞, 并進(jìn)而分化為神經(jīng)元6。此研究結(jié)果專門好地解決了神經(jīng)干細(xì)胞來源困難的問題，為今后神經(jīng)干細(xì)移植治療多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病打下了基礎(chǔ)?？傊S著當(dāng)今干細(xì)胞研究的深入，探究通過MSC轉(zhuǎn)化為神經(jīng)干細(xì)胞恢復(fù)小兒外科常見疾?。ㄏ忍煨跃藿Y(jié)腸癥）正常神經(jīng)支配的方法具有重要現(xiàn)實性及可能性。美國時代周刊曾將人類胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）和胚胎生殖細(xì)胞（EG 細(xì)胞）建系研究成功列為20世紀(jì)末世界十大科技成就之首，并認(rèn)為ES細(xì)胞和人類基因組將同時成為新世紀(jì)最具進(jìn)展和應(yīng)用前景的領(lǐng)域。由此激發(fā)了人們對ES細(xì)胞，骨髓干細(xì)胞，神經(jīng)干

15、細(xì)胞定向分化的研究。將MSC,神經(jīng)干細(xì)胞定向分化，移植的研究引入到HD這一小兒外科常見病的治療研究中，探究MSC，神經(jīng)干細(xì)胞克隆、定向分化、移植關(guān)于HD治療方法，可為發(fā)育生物學(xué)積存寶貴的資料；采納細(xì)胞工程原理和方法，通過MSC，神經(jīng)干細(xì)胞移植重建HD病變段的正常神經(jīng)支配方法的研究成功，在臨床上將能夠讓HD患兒免于手術(shù)，使HD的治療發(fā)生全然性的改觀。該課題的完成除能為兒童的健康成長做出巨大貢獻(xiàn)，并能帶動本地區(qū)整個小兒外科水平的進(jìn)展，提高本地區(qū)小兒外科在國內(nèi)及國際上的地位，為祖國西部大開發(fā)戰(zhàn)略的順利進(jìn)行貢獻(xiàn)力量。參考文獻(xiàn)陳雷玲，胡廷澤，朗詩明，等。320例先天性巨結(jié)腸癥的診斷與治療分析。華西醫(yī)科大

16、學(xué)學(xué)報，2000，31(2)：274-27Kathryn S. Embryonic stem cells used to remyelinate injured rat spinal cord neurons. Lancet, 2000, 355 (9218): 1890McCaffery P, Drager UC. Regulation of retinioc acid signaling in the embryonic nervous system: a master differentiation factor. Cytokine Growth Factor Rev. 2000, 11

17、(3): 233-249Natarajan D, Grigoriou M, Marcos-Gutierrez CV, et al. Multipotential progenitors of themammalian enteric nervous system capable of colonizing aganglionic bowel in organ culture. Development, 1999,126:157-168劉平，盧亦成，朱誠。中樞神經(jīng)干細(xì)胞。中華神經(jīng)外科雜志。2000，16（3）：196-198Woodbury D, Schwarz EJ, Prockop DJ,

18、et al. Ault rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons. J Neurosci Res, 2000, 61(4): 364-3703-3三、研究方案研究目標(biāo)、研究內(nèi)容和擬解決的關(guān)鍵問題研究目標(biāo)： 探究建立針對先天性巨結(jié)腸癥的MSC，神經(jīng)干細(xì)胞移植治療方法。研究內(nèi)容：MSC的分離，體外克??；MSC向神經(jīng)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)化；多種人工修飾條件下的神經(jīng)干細(xì)胞在HD動物模型（lethal spotted rat, ls/ls）無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞腸段移植，定向分化；鑒定神經(jīng)干細(xì)胞移植后HD動物模型的消化道神經(jīng)系統(tǒng)形態(tài)

19、及機能。擬解決的關(guān)鍵問題：MSC向神經(jīng)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)化；神經(jīng)干細(xì)胞的基因修飾； 神經(jīng)干細(xì)胞移植，定向分化的分子機制。4擬采取的研究方法、技術(shù)路線、實驗方案及可行性分析研究方法：無血清培養(yǎng)，單細(xì)胞克隆技術(shù)；mRNA差異消減顯示技術(shù)；原位雜交；RT-PCR，免疫組化技術(shù)，透射電鏡技術(shù)；基因轉(zhuǎn)染技術(shù)。技術(shù)路線： 建立HD動物模型 MSC的分離及體外培養(yǎng)MSC向神經(jīng)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)化 神經(jīng)干細(xì)胞體外培養(yǎng)，克?。╒-MYC，EGF等多種基因轉(zhuǎn)染，修飾）神經(jīng)干細(xì)胞移植到HD動物無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞段誘導(dǎo)分化（維甲酸等） mRNA差異消減顯示技術(shù)顯示神經(jīng)干細(xì)胞移植分化的分子機制 觀看無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞段腸神經(jīng)系統(tǒng)形態(tài)及功能獲得通過

20、MSC、神經(jīng)干細(xì)胞移植對先天性巨結(jié)腸癥腸道神經(jīng)組織重建的方法5-15-2實驗方案：第一部分：建立HD動物大鼠參照文獻(xiàn)進(jìn)行大鼠選育，源于Wistar-Imamichi AR系，HD大鼠均結(jié)腸造瘺處理。第二部分：MSC分離培養(yǎng)，向神經(jīng)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化MSC分離培養(yǎng) 切取鼠一側(cè)股骨，暴露骨髓腔，用注射器抽取細(xì)胞培養(yǎng)液（DMEM/20FBS），反復(fù)多次沖洗出骨髓細(xì)胞，用吸管反復(fù)抽吸后，F(xiàn)icoll 分離液離心分離出有核細(xì)細(xì)胞，移入T-75培養(yǎng)瓶，過夜培養(yǎng)，第二日將懸浮細(xì)胞移去（貼壁細(xì)胞為較純的基質(zhì)干細(xì)胞），3-4天更換培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞融合時用胰島素/EDTA（trypsin/EDTA）處理，收獲貼壁細(xì)胞為MS

21、C ( MSC鑒定選用CD29，CD90，CD106等標(biāo)記)。MSC向神經(jīng)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化 參照文獻(xiàn)在MSC培養(yǎng)液中加入脊索中胚層浸出液，脊索中胚層條件培養(yǎng)液，星形膠質(zhì)細(xì)胞上清液，多種神經(jīng)生長因子等。鑒定 A. 光鏡及電鏡下觀看轉(zhuǎn)化細(xì)胞形態(tài)改變。B. 免疫組化或流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)化后的表面標(biāo)志: nestin, 波形蛋白，RC抗原。第三部分：神經(jīng)干細(xì)胞分離提取，體外培養(yǎng)，基因轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞的分離和傳代 分不取鼠紋狀體和孕鼠皮層組織，吸管吹打機械分離制成單細(xì)胞懸液，利用DMEM/F12(1:1) 加B27及bFGF無血清培養(yǎng)基進(jìn)行原代培養(yǎng)，具體參見文獻(xiàn)。體外基因轉(zhuǎn)染 關(guān)于以上兩種來源的神經(jīng)干細(xì)胞采納

22、脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，將V-MYC，EGF，及FGF-2 ，PA，MMP cDNA重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體導(dǎo)入神經(jīng)干細(xì)胞，包括雙基因及單基因轉(zhuǎn)染的多種形式。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLNCXE由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院分子生物學(xué)國家重點實驗室提供。E. coli質(zhì)粒DNA大量制備、純化和酶切參照Sambrook等的文獻(xiàn)方法進(jìn)行；按LipofectamineTM試劑盒講明進(jìn)行轉(zhuǎn)染實驗。第四部分：神經(jīng)干細(xì)胞在無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞段的移植，定向分化及檢測神經(jīng)干細(xì)胞在HD動物模型體內(nèi)移植 按多種組合形式，利用毛細(xì)顯微注射器將經(jīng)多種形式基因轉(zhuǎn)染的神經(jīng)干細(xì)胞注射到HD無神經(jīng)5-3節(jié)細(xì)胞段；參考文獻(xiàn)報道進(jìn)行，將注射細(xì)胞濃度定為0.5-1

23、cell/ 0.5ul。移植后的神經(jīng)干細(xì)胞在HD動物體內(nèi)的分化誘導(dǎo) 維甲酸等分化誘導(dǎo)劑處理，藥物濃度選擇參考文獻(xiàn)。移植后的神經(jīng)干細(xì)胞對HD動物模型無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞段腸神經(jīng)系統(tǒng)的阻礙檢測 A實驗動物的處理：將實驗組鼠（包括對比組）分不于不同時期斷頸處死，如移植后4周，16周，32周。取移植處腸組織進(jìn)行檢測，分不按進(jìn)行檢測的項目要求對樣本進(jìn)行處理。光鏡及電鏡檢測移植處組織形態(tài)學(xué)變化。免疫組化技術(shù)：檢測神經(jīng)細(xì)胞特異性烯醇化酶（NSE），-100，GAFP等表達(dá)。原位雜交，RT-PCR檢測：轉(zhuǎn)染基因的表達(dá)（V-MYC，EGF等），原位雜交所需探針，RT-PCR引物可分不購自中山，GIBIC公司，按講明進(jìn)行

24、實驗操作。功能鑒定：直腸測壓技術(shù)，生物化學(xué)方法檢測r-氨基丁酸，P物質(zhì)等的合成。神經(jīng)干細(xì)胞移植，分化的分子機制 參照文獻(xiàn)利用mRNA差異消減顯示技術(shù)顯示以上多種形式神經(jīng)干細(xì)胞移植，分化的差異基因，進(jìn)而進(jìn)行分級分段克隆。神經(jīng)干細(xì)胞移植處腸段及相同部位正常腸神經(jīng)組織RNA的純化：利用腸道組織的剝片技術(shù)獵取腸神經(jīng)組織，立即置放于液氮中，-70保存。氯仿法提取RNA，DNase = 1 * ROMAN I 處理，紫外分光度計定量測定。RT-PCR差異消減顯示：對分不將神經(jīng)干細(xì)胞移植處腸段及相同部位正常腸神經(jīng)組織分離擴增出cDNA，運用5、端帽子引物與3、端錨定引物，對cDNA進(jìn)行大量擴增，正常腸神經(jīng)組

25、織用生物素標(biāo)記的dATP和dNTPs進(jìn)行PCR擴增，產(chǎn)物進(jìn)行消減雜交，用連親和素去除共有產(chǎn)物，剩下的產(chǎn)物由帶有-32 PdATP的dNTPs進(jìn)行PCR，在重復(fù)差異顯示，回收差異條帶并克隆。（0.4ul RNA，1逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，15umol/L dNTP, 10umol/L簡并引物，65。C 5min，37。C溫育10min，加200U/ulMoMuLV反轉(zhuǎn)錄酶，37。C溫育50min，95。C 溫育5min，PCR，消減雜交，過柱子，PCR，消減雜交，TA克隆盒進(jìn)行DNA克隆，按講明進(jìn)行，及進(jìn)行測序，基因鑒定等）。結(jié)合步驟3的檢測結(jié)果再進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染 同第三部份的體外基因轉(zhuǎn)染。獲得神

26、經(jīng)干細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染，移植，分化，重建HD正常神經(jīng)支配的方案 重復(fù)步驟1；2；3；4，反復(fù)調(diào)整。第五部分：統(tǒng)計分析各實驗組間的數(shù)據(jù)以 均數(shù) 標(biāo)準(zhǔn)差表示，用F檢驗，t檢驗，多因素方差分析進(jìn)行多組及組間統(tǒng)計學(xué)處理，P值小于0.05為差異顯著?？尚行苑治觯篗SC分離，體外培養(yǎng)，本課題組差不多完成。本課題組已前期進(jìn)行了MSC轉(zhuǎn)化為神經(jīng)干細(xì)胞的實驗，同時成功進(jìn)行了體內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞的分離并獲得了國家自然科學(xué)基金支助（編號30070382）。神經(jīng)干細(xì)胞移植為當(dāng)今各國神經(jīng)細(xì)胞工程研究重點，大量的研究文獻(xiàn)報道了神經(jīng)干細(xì)胞分離，培養(yǎng)的方法。較其它一些干細(xì)胞研究不同，神經(jīng)干細(xì)胞有明確的免疫標(biāo)記。在臨床及研究中對大量先天性

27、巨結(jié)腸癥進(jìn)行了觀看，有多篇相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)表。課題組已成功進(jìn)行了神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定，及成人骨髓MSC體外擴增和定向誘導(dǎo)分化為骨和軟骨細(xì)胞。5-43本項目的創(chuàng)新之處以往對神經(jīng)干細(xì)胞移植的研究要緊局于中樞神經(jīng)系統(tǒng)及脊髓損傷修復(fù)方面，盡管有類似于神經(jīng)干細(xì)胞的神經(jīng)嵴細(xì)胞修復(fù)腸神經(jīng)節(jié)缺如的文章報道，但神經(jīng)干細(xì)胞移植修復(fù)腸神經(jīng)節(jié)缺如尚未見報道。首次提出MSC轉(zhuǎn)化為神經(jīng)干細(xì)胞后，移植分化修復(fù)HD正常神經(jīng)支配可能。4. 年度研究打算及預(yù)測進(jìn)展2002年1月2002年12月構(gòu)建HD動物模型及初步完成MSC分離，體外培養(yǎng)，及向神經(jīng)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化。2003年1月2003年12月完成神經(jīng)干細(xì)胞的各種基因轉(zhuǎn)染實驗，初步完

28、成HD動物模型的無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞段的神經(jīng)干細(xì)胞注射及檢測。 2004年1月2004年6月進(jìn)一步完成HD動物模型的無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞段的神經(jīng)干細(xì)胞注射及檢測，獲得MSC轉(zhuǎn)化為神經(jīng)干細(xì)胞后移植分化重建HD正常神經(jīng)支配的方法。 2004年6月2004年12月數(shù)據(jù)處理，完成論文。5. 預(yù)期研究成果以論文發(fā)表作為研究成果。6 四、研究基礎(chǔ)1. 與本項目有關(guān)的研究工作積存和已取得的研究工作成績本項目的提出源于課題組對先天性巨結(jié)腸癥長期的臨床及基礎(chǔ)研究，既往要緊將注意力集中在手術(shù)方法的改進(jìn)，病理生理學(xué)變化觀看上，已有多篇相關(guān)文章發(fā)表。本課題組對多個年齡組的正常個體及先天性巨結(jié)腸癥患者進(jìn)行了神經(jīng)節(jié)發(fā)育觀測，并對人巨細(xì)胞

29、病毒與先天性巨結(jié)腸癥的關(guān)系進(jìn)行了研究。對數(shù)百例先天性巨結(jié)腸癥患者進(jìn)行了診治，有較豐富的臨床經(jīng)驗。已成功地建立了神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)。本課題組成員已進(jìn)行了MSC轉(zhuǎn)化為神經(jīng)干細(xì)胞的實驗，并獲得了國家自然科學(xué)基金資助（編號30070382）。本課題組較熟練地掌握了基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，效果優(yōu)良。2. 已具備的實驗條件，尚缺少的實驗條件和擬解決的途徑（包括利用國家重點實驗室和部門開放實驗室的打算與落實情況）本研究室所在的重慶醫(yī)科大學(xué)兒科研究所為原四川省重點實驗室，現(xiàn)已重新評定為重慶直轄市重點實驗室，目前正在申報國家級及教育部重點實驗室，是博士授權(quán)點并可培養(yǎng)博士后人員。有高級職稱人員100多人。兒科研究所專業(yè)門類齊

30、全，技術(shù)力量雄厚，設(shè)備完善，具有包括中心實驗室在內(nèi)的涉及分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、組織病理學(xué)、生物化學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)以及急救醫(yī)學(xué)、小兒腫瘤實驗外科學(xué)等專業(yè)實驗室、研究室十余個，能承擔(dān)國家重點科研課題及博士后研究工作。多年來，已完成包括國家自然科學(xué)基金資助項目在內(nèi)的部、委、省、市級科研課題上百項，并獲多項各級獎勵。要緊設(shè)備及實驗條件包括：掃描、透射電鏡高壓液相色譜儀顯微成像系統(tǒng)石蠟，冷凍，恒冷，超薄切片機熒光，相差，倒置，自動照相顯微鏡PCR儀7-1細(xì)胞培養(yǎng)全套設(shè)備熒光分光光度計紫外分光光度計 LKB 電泳儀器低溫超速離心機超低溫冰箱，低溫冰柜超聲細(xì)胞粉碎儀去離子水發(fā)生器分子生物學(xué)

31、實驗常用設(shè)備動物實驗檢測維持設(shè)施二氧化碳孵箱其他輔助設(shè)備其它本次實驗需要，但缺少的設(shè)備，如DNA測序分析儀等可通過測序公司解決或聯(lián)系國家干細(xì)胞研究重點實驗室解決。7-2申請者和項目組要緊成員的學(xué)歷和研究工作簡歷，近期已發(fā)表與本項目有關(guān)的要緊論著目錄*和獲得學(xué)術(shù)獎勵情況及在本項目中承擔(dān)的任務(wù)；青年科學(xué)基金申請者還應(yīng)注明學(xué)位論文名稱及導(dǎo)師姓名與工作單位* 論文：作者題目刊名年份卷（期）頁碼 專著：作者書名出版者年份8-18-3五、經(jīng)費預(yù)算支 出 科 目金 額（萬元）計 算 根 據(jù) 及 理 由1. 合 計21.31科研業(yè)務(wù)費3.5資料費0.5資料檢索及查新等學(xué)術(shù)交流費1.0發(fā)表論文等成果鑒定費2.0

32、2實驗材料費16.8實驗動物及飼養(yǎng)2.1Wistar-Imamichi AR系選育生物試劑及化學(xué)試劑3.5nestin，及V-MYC，EGF，F(xiàn)GF-2等 cDNA的構(gòu)建等多種消耗性材料費3.3引物合成2.3cDNA測序2.5多種生長因子 3.13項目組織費1.0 注: 預(yù)算支出科目按下列順序填寫: 1. 科研業(yè)務(wù)費 2. 實驗材料費 3. 儀器設(shè)備費 4. 實驗室改裝費 5. 協(xié)作費 6. 項目組織實施費。開支范圍詳見國家自然科學(xué)基金資助項目財務(wù)治理方法第二章。9 六、申請者正在承擔(dān)的其它研究項目 （攀登打算、863打算、攻關(guān)任務(wù)和各部委、省市任務(wù)等項目的名稱及編號、任務(wù)來源、起止年月、負(fù)責(zé)

33、或參加以及與本申請項目的關(guān)系等情況）七、申請者承擔(dān)（負(fù)責(zé)或參加）國家自然科學(xué)基金資助項目的情況批準(zhǔn)號項目名稱起止年月負(fù)責(zé)或參加進(jìn)展或完成情況10 對申請者負(fù)責(zé)的前一個已結(jié)題科學(xué)基金資助項目（項目名稱及批準(zhǔn)號）完成情況，后繼研究進(jìn)展及與本申請項目的關(guān)系加以詳細(xì)講明。另附該已結(jié)題項目研究工作總結(jié)摘要（300字）及已發(fā)表要緊相關(guān)論文首頁復(fù)印件（限三篇）。 八、申請者承諾 我保證上述填報內(nèi)容的真實性。假如獲得資助，我與本項目組成員將嚴(yán)格遵守國家自然科學(xué)基金委員會的有關(guān)規(guī)定，切實保證研究工作時刻，按打算認(rèn)真開展研究工作，按時報送有關(guān)材料。 申請者（簽章） 年 月 日11 九、推舉意見 （不具有高級專業(yè)技術(shù)職務(wù)的申請者，須有兩名具有高級專業(yè)技術(shù)職務(wù)的同行專家推舉。推舉時，請認(rèn)真負(fù)責(zé)地介紹申請者及其項目組成員的業(yè)務(wù)基礎(chǔ)、研究能力、科研態(tài)度及研究條件等。項目組成員不能做推舉者） 推舉者（簽章） 專業(yè)技術(shù)職務(wù) 專長 所在單位： 推舉者（簽章） 專業(yè)技術(shù)職務(wù) 專長 所在單位：12十、申請者所在單位及合作單位的審查與保證申請者所在單位學(xué)術(shù)委員會的審查意見（包括：對項目的意義、特色和創(chuàng)新之處及申請者的研究水平與學(xué)風(fēng)簽署具體意見）先天性巨結(jié)腸癥是小兒外科