分子生物學(xué)診斷技術(shù)進(jìn)展課件

1、分子生物學(xué)診斷技術(shù)進(jìn)展分子生物學(xué)診斷技術(shù)進(jìn)展主要內(nèi)容：分子生物學(xué)診斷技術(shù)在病原學(xué)檢測(cè)中的應(yīng)用簡(jiǎn)單介紹實(shí)驗(yàn)原理以PCR、熒光實(shí)時(shí)定量PCR、NASBA為例分子診斷技術(shù)在以下病原研究的應(yīng)用進(jìn)展乙型肝炎丙型肝炎結(jié)核分枝桿菌2主要內(nèi)容：分子生物學(xué)診斷技術(shù)在病原學(xué)檢測(cè)中的應(yīng)用4病原學(xué)檢測(cè)常用的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定（“金標(biāo)準(zhǔn)”）、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)血清學(xué)、免疫學(xué)診斷技術(shù)電鏡技術(shù)分子生物學(xué)診斷技術(shù)3病原學(xué)檢測(cè)常用的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定（“金標(biāo)準(zhǔn)”）、動(dòng)物分子生物學(xué)診斷技術(shù)方法簡(jiǎn)介1、主體技術(shù)具體方法舉例 循環(huán)擴(kuò)增PCR （聚合酶鏈反應(yīng)） Real-time PCR, RT-PCR，巢式PCR，復(fù)合PCR PC

2、R-ELISA，微孔板雜交，熒光探針標(biāo)記法LCR（連接酶鏈反應(yīng)） 恒溫NASBA（依賴(lài)核酸序列的擴(kuò)增，主要用于RNA）SDA（鏈置換擴(kuò)增術(shù)） CPT（環(huán)狀探針技術(shù) ）bDNA（枝鏈核酸信號(hào)放大系統(tǒng) ）雜交捕獲 （如：檢測(cè)HPV-DNA的試劑盒）4分子生物學(xué)診斷技術(shù)方法簡(jiǎn)介1、主體技術(shù)具體方法舉例 循分子診斷技術(shù)方法簡(jiǎn)介2、多標(biāo)靶同時(shí)檢測(cè)多重PCR毛細(xì)管電泳以測(cè)序分析為基礎(chǔ)的檢測(cè)技術(shù)5分子診斷技術(shù)方法簡(jiǎn)介2、多標(biāo)靶同時(shí)檢測(cè)7分子診斷技術(shù)方法簡(jiǎn)介3、核酸雜交DNA熒光原位雜交（FISH）將標(biāo)記的探針直接原位雜交到染色體或DNA纖維切片上，再用與熒光素分子偶聯(lián)的單克隆抗體與探針?lè)肿犹禺愋越Y(jié)合來(lái)檢測(cè)D

3、NA序列在染色體或DNA纖維上的定位。 線(xiàn)性探針?lè)治龇ǎ↙iPA）雜交保護(hù)分析法（HPA）4、質(zhì)譜利用色、質(zhì)譜結(jié)合PCR技術(shù)6分子診斷技術(shù)方法簡(jiǎn)介3、核酸雜交8分子診斷的功能及擴(kuò)展病原的診斷和鑒別診斷病原分型病毒載量監(jiān)測(cè)-個(gè)體化治療的依據(jù)療效及預(yù)后標(biāo)志其他：病原感染中發(fā)生、發(fā)展各階段7分子診斷的功能及擴(kuò)展9分子診斷的功能及擴(kuò)展疾病分型及意義例如：HPV （30/100） 高危-16，18，31，45 低危- 6，118分子診斷的功能及擴(kuò)展疾病分型及意義10分子診斷的功能及擴(kuò)展病毒載量與治療 例1.-北京地壇醫(yī)院謝堯提供9分子診斷的功能及擴(kuò)展病毒載量與治療 -北京地壇醫(yī)院謝堯提分子診斷的功能及擴(kuò)

4、展病毒載量與治療例2. HBV-干擾素HBV100pg/mL 1/30 陰轉(zhuǎn)(HBeAg HBeAb)10分子診斷的功能及擴(kuò)展病毒載量與治療12分子診斷的功能及擴(kuò)展病毒載量與治療例3. HIV病毒載量與傳播15127人 流行病學(xué)調(diào)查415對(duì)伴侶30個(gè)月HIV陽(yáng)轉(zhuǎn)22%（90/415）51人RNA1500copies/mL 全陰11分子診斷的功能及擴(kuò)展病毒載量與治療13分子診斷的功能及擴(kuò)展病毒載量與治療例4. 血漿EBV載量與鼻咽癌復(fù)發(fā)15個(gè)二年持續(xù)緩解： 0 copy/mL10個(gè)復(fù)發(fā)：32250 copies/mL17個(gè)隨訪(fǎng)：臨床惡化前半年病毒載量升高12分子診斷的功能及擴(kuò)展病毒載量與治療14

5、耐藥病原的分子診斷WHO：人類(lèi)死亡1/3是長(zhǎng)期用藥的毒副作用HBV的YMDD變異HIV耐藥13耐藥病原的分子診斷15血制品篩查300余萬(wàn)的血清陰性樣品，分子生物學(xué)復(fù)測(cè)：HBV：47HCV：10HIV-1：2 -2001年劍橋資料 HIV-1血清陰性而RNA陽(yáng)性 0.2-6.6% -Am. J. Chin Athol. 200014血制品篩查300余萬(wàn)的血清陰性樣品，分子生物學(xué)復(fù)測(cè)：16在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域中的應(yīng)用；遺傳病的基因診斷和產(chǎn)前基因診斷：如血友病、地中海貧血等腫瘤基因和腫瘤標(biāo)志物表達(dá)(mRNA)的檢測(cè)；骨髓移植、器官移植供體配型選擇；法醫(yī)學(xué)、動(dòng)植物學(xué)、古人類(lèi)學(xué)、古生物學(xué)； 與疾病相關(guān)的各種蛋

6、白（細(xì)胞因子、酶、激素、受體）的基因表達(dá)的檢測(cè)；藥物基因組學(xué)、耐藥基因的檢測(cè)，等等分子生物學(xué)技術(shù)在其它領(lǐng)域的應(yīng)用15在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域中的應(yīng)用；分子生物學(xué)技術(shù)在其它領(lǐng)域的應(yīng)用17簡(jiǎn)單介紹實(shí)驗(yàn)原理PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶鏈反應(yīng)) 熒光實(shí)時(shí)定量PCR （real time PCR）NASBA （依賴(lài)核酸序列的擴(kuò)增）16簡(jiǎn)單介紹實(shí)驗(yàn)原理PCR(Polymerase Chain PCR原理:實(shí)質(zhì)就是體外基因復(fù)制技術(shù)Mg2+dCTPdGTPdUTPdATPTaq DNA聚合酶 AmpErasePrimer靶序列加熱變性95 C靶序列引物退火55 C引物延伸72 C1

7、7PCR原理:實(shí)質(zhì)就是體外基因復(fù)制技術(shù)Mg2+dCTPdGTPPCR 循環(huán) 第一步 加熱變性靶序列靶序列從外周血白細(xì)胞或絨毛、羊水細(xì)胞提取的DNA約1ug，在含有適當(dāng)緩沖液、引物、dNTPs（dATP、dCTP、dGTP及dTTP）等的反應(yīng)混合物中，在94下熱變性1-4分鐘，使之解為單鏈。18PCR 循環(huán) 靶序列靶序列從外周血白細(xì)胞或絨毛、羊水細(xì)胞提PCR 循環(huán)第二步引物與靶序列退火靶序列靶序列Primer 1Primer 2BiotinBiotin53553533引物與解為單鏈的DNA上互補(bǔ)序列雜交在一起，稱(chēng)之為退火。55左右19PCR 循環(huán)靶序列靶序列Primer 1Primer 2BiP

8、CR 循環(huán) 第三步 - 引物延伸靶序列靶序列Primer 1Primer 2BiotinBiotin53553533Taq DNAPolymerase在DNA聚合酶催化作用下，以dNTPs為原料（底物），從引物的3端A開(kāi)始, 沿著53的方向，合成每條模板的互補(bǔ)鏈，此稱(chēng)引物延伸。72左右20PCR 循環(huán) 靶序列靶序列Primer 1Primer 2B第1個(gè)PCR循環(huán)完成后靶序列 靶序列BiotinBiotin21第1個(gè)PCR循環(huán)完成后靶序列 靶序列BiotinBioti30次循環(huán)后靶序列擴(kuò)增的數(shù)量No. ofNo. Amplicon CyclesCopies of Target122438416

9、532664201,048,576301,073,741,8241 cycle = 2 Amplicon2 cycle = 4 Amplicon3 cycle = 8 Amplicon4 cycle = 16 Amplicon5 cycle = 32 Amplicon6 cycle = 64 Amplicon7 cycle = 128 Amplicon2230次循環(huán)后靶序列擴(kuò)增的數(shù)量No. ofNo. Ampli53RQ探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收，所以檢測(cè)不到熒光，此種現(xiàn)象稱(chēng)為熒光共振能量轉(zhuǎn)移。熒光PCR原理 TaqManTM技術(shù)2353RQ探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光

10、信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收535353RQExtension Step531. Strand DisplacementTaq3QR5533QTaqR52. Cleavage3. PolymerizationComplete53QTaqR354. Detection533QTaqR5lR熒光PCR原理 TaqManTM技術(shù)24535353RQExtension Step5定量PCR測(cè)定的是擴(kuò)增的指數(shù)擴(kuò)增期;定性PCR測(cè)定的是擴(kuò)增的終點(diǎn)（平臺(tái)期）定量PCR與定性PCR測(cè)定的區(qū)別25定量PCR測(cè)定的是擴(kuò)增的指數(shù)擴(kuò)增期;定量PCR與定性PCR測(cè)市場(chǎng)上常見(jiàn)的實(shí)時(shí)熒光PCR儀羅氏LightcyclerMJ opt

11、icon2伯樂(lè)icyclerABI7000杭州博日（原大和）linegene26市場(chǎng)上常見(jiàn)的實(shí)時(shí)熒光PCR儀羅氏LightcyclerMJ 臨床標(biāo)本核酸提取技術(shù)NASBA 擴(kuò)增ECL-化學(xué)發(fā)光標(biāo)記檢測(cè)NASBA 擴(kuò)增+分子燈塔檢測(cè)擴(kuò)增過(guò)程中“分子燈塔” 即時(shí)同相檢測(cè) 方法 1 - NucliSens ECL方法 2 - NucliSens EasyQ加入裂解緩沖液和內(nèi)置標(biāo)準(zhǔn)NASBA測(cè)定原理27臨床標(biāo)本核酸提取技術(shù)NASBA 擴(kuò)增ECL-化學(xué)發(fā)光標(biāo)記檢測(cè)NASBA擴(kuò)增原理引物 1逆轉(zhuǎn)錄酶RNase H引物 2逆轉(zhuǎn)錄酶T7 RNA 聚合 酶引物 2逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶RNase H引物 1線(xiàn)性循環(huán)擴(kuò)

12、增循環(huán)28NASBA擴(kuò)增原理引物 1逆轉(zhuǎn)錄酶RNase H逆轉(zhuǎn)錄酶T7NASBA 和 PCR 的不同NASBA擴(kuò)增目標(biāo)為RNA同溫?cái)U(kuò)增連續(xù)擴(kuò)增擴(kuò)增物為單鏈RNA引物次序不包含於最終產(chǎn)物中PCR擴(kuò)增目標(biāo)為DNA溫度循環(huán)擴(kuò)增循環(huán)擴(kuò)增擴(kuò)增物為雙鏈DNA引物次序包含於最終產(chǎn)物中29NASBA 和 PCR 的不同NASBAPCR31乙型肝炎檢測(cè)標(biāo)志物：HBsAg，抗-HBs,HBeAg，抗-Hbe,抗HBc (IgG,IgM),HBV-DNADane顆粒（完整的病毒）形態(tài)乙型肝炎的分子診斷30乙型肝炎檢測(cè)標(biāo)志物：Dane顆粒（完整的病毒）形態(tài)乙型肝炎的乙型肝炎的分子診斷1. 重要性全球 20億人感染慢性

13、 3.5億人中國(guó)、東南亞、非洲50肝硬化，70-90肝癌7-30攜帶者感染變異體31乙型肝炎的分子診斷332. HBV基因型與血清型關(guān)系及流行病學(xué)分布基因型與血清型不完全一致臨床突變率不同有地域分布特點(diǎn)乙型肝炎的分子診斷32乙型肝炎的分子診斷34表1：基因型血清學(xué)亞型基因長(zhǎng)度(nt)臨床突變率主要流行地域PC*(G1896A)BCP*(1762/1764)Aadw2ayw132216.5（少）C185845（常）西歐、北歐、北美、中非、印度Badw2ayw1321550（常）T185816東南亞、中國(guó)、日本Cayr;adrq+;Adrq-;adr;adw2321550（常）T1858或C185

14、858（常）東南亞、中國(guó)、日本、澳洲、美國(guó)Dayw2;ayw3;ayw4318243%(常）T185812（低）地中海、俄羅斯、印度、美國(guó)33表1：基因型基因長(zhǎng)度臨床突變率PC*BCP*Aadw232表1(續(xù)）:基因型血清學(xué)亞型基因長(zhǎng)度(nt)臨床突變率主要流行地域PC*(G1896A)BCP*(1762/1764)Eayw4321227（中）7（低）西非Fayw4;adw2;Adw4q-321516（少）C1858未定中美、南美、波利尼西亞GAdw23248100（高）未定中美、美國(guó)、法國(guó)、德國(guó)Hadw43215未定未定中美、南美、美國(guó)PC*:前核心 BCP*:基本核心啟動(dòng)子 （科華生物 2

15、004.07.21）34表1(續(xù)）:基因型基因臨床突變率PC*BCP*Eayw433. 基因型與臨床實(shí)驗(yàn)室表現(xiàn)不同（表2）病情與轉(zhuǎn)歸：C較B差抗病毒治療：A優(yōu)于D B優(yōu)于C adw/ayw 20:1乙型肝炎的分子診斷35乙型肝炎的分子診斷37表2:B基因C基因HBeAg(+)少多免疫清除期短長(zhǎng)嚴(yán)重急性加劇少多組織學(xué)活動(dòng)性低高血清HBV-DNA水平低高PC1896突變率高低BCP雙突變率低高抗病毒治療應(yīng)答好差臨床轉(zhuǎn)歸（硬化、癌變）好差36表2:B基因C基因HBeAg(+)少多免疫清除期短長(zhǎng)嚴(yán)重急性4. 一般實(shí)驗(yàn)室分型方法測(cè)序PCR-RELP（限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性）PCR核酸雜交（譜線(xiàn)探針?lè)ǎ┭?/p>

16、學(xué)：?jiǎn)慰箍蓞^(qū)分A-F各基因型乙型肝炎的分子診斷37乙型肝炎的分子診斷395. 抗病毒治療的耐藥性問(wèn)題拉米夫定耐藥性的檢測(cè)乙型肝炎的分子診斷38乙型肝炎的分子診斷40拉米夫定耐藥性的檢測(cè)耐藥性與HBV多聚酶基因YMDD氨基酸序列中的核酸變異有關(guān)I型：YMDD變異為HBV聚合酶基因(P區(qū)基因)區(qū)第741個(gè)核苷酸位,A-G置換，使第552個(gè)密碼子蛋氨酸(M)被纈氨酸(V)取代，成為YVDD變異II型：YMDD變異為P基因區(qū)743個(gè)核苷酸的G-T置換，使第55個(gè)密碼子蛋氨酸(M)被異亮氨酸(工)取代，成為YIDD變異 YMDD變異：Y（酪氨酸） M（蛋氨酸） V（纈）： YVDD變異 D（天冬氨酸）

17、I（異亮）：YIDD變異 D（天冬氨酸） 最近報(bào)道： YSDD （ATG AGT ） 應(yīng)用拉米夫定耐藥位點(diǎn)基因芯片檢測(cè)突變位點(diǎn)乙型肝炎的分子診斷39拉米夫定耐藥性的檢測(cè)乙型肝炎的分子診斷41乙型肝炎的分子診斷40乙型肝炎的分子診斷42乙型肝炎的分子診斷41乙型肝炎的分子診斷43HCV的基因型/亞型6個(gè)型，68個(gè)亞型 1a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m2a, b, c, d, e, f, g, h, i, k, l, m3a, b, c, d, e, f, g, h, i, k4a, c, d, e, f, g, h, k, l, m, n, o, p,

18、 q, r, s, t5a6a, b, d, f, g, h, i, j, k, l, m, n丙型肝炎的分子診斷42HCV的基因型/亞型6個(gè)型，68個(gè)亞型 1a, b, c, HCV基因分型方法測(cè)序型特異性引物PCR分型法 線(xiàn)性探針雜交（InnoLipa)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（RFLP）TRUGENE HCV 5NC Genotyping Assay丙型肝炎的分子診斷43HCV基因分型方法測(cè)序丙型肝炎的分子診斷455UTR (5Non-Coding Region)高度保守HCV RNA診斷實(shí)驗(yàn)的常用區(qū)域有一套良好的多態(tài)性特征，因此可用于基因分型 許多HCV分型商業(yè)試劑盒都采用該區(qū)進(jìn)行分型

19、TRUGENE HCV 5NC Genotyping AssayVERSANT HCV Genotyping Assay (LiPA)HCV NS5B區(qū)各亞型間基因差異較大擴(kuò)增效率較低若成功擴(kuò)增，序列分析可區(qū)別HCV各亞型。HCV基因分型常選用的區(qū)域丙型肝炎的分子診斷445UTR (5Non-Coding Region)HCV臨床工作目前常用的基因型檢測(cè)方法（RFLP, InnoLipa, Trugene) 通常建立在5非編碼區(qū)，因?yàn)樵搮^(qū)序列保守，檢測(cè)靈敏度高，是HCV RNA診斷實(shí)驗(yàn)的常用區(qū)域。在臨床工作中，對(duì)5UTR進(jìn)行分型的RFLP, InnoLipa, Trugene分型都可以滿(mǎn)足分型

20、的需要，為制定治療方案和判斷預(yù)后提供指導(dǎo)。常只需將1型和4型與其它基因型相區(qū)別，以決定抗病毒治療的療程和利巴韋林的劑量，因此上述的任何一種方法均可以采用。丙型肝炎的分子診斷45臨床工作目前常用的基因型檢測(cè)方法（RFLP, InnoLipHCV 5UTR geneSecond PCR product=257bpScheme ACleavage with BsrB,Hinfand Hae93 and 91bp Genotype 2a and 2b257bpGenotype 3b,4a and 5a127 and 91bp104,74bp160,74bp2a2b160,74bp234bp3b4a a

21、nd 5aCleavage with HaeScheme C Cleavage with Apo183,74bp257bp4a1b197bpGenotype 1a,1b and 6a166/169 and 91bp Cleavage with BstUScheme B 1a227bp5aGenotype3a6a257bp HCV 5非編碼區(qū)ABC程序復(fù)合酶切分型法流程圖 -北京大學(xué)人民醫(yī)院肝病研究所提供46HCV 5UTR geneSecond PCR produ抗HCV的確認(rèn)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)的重要性（灰區(qū)的遺漏）目的：解決血液篩查實(shí)驗(yàn)（如ELISA）的非特異性問(wèn)題方法：例如：PCR 活動(dòng)性病毒血癥的

22、檢測(cè)是一個(gè)很好的檢測(cè)方法RIBA 3.0 抗體的確認(rèn)新流程：丙型肝炎的分子診斷47抗HCV的確認(rèn)實(shí)驗(yàn)丙型肝炎的分子診斷49 抗-HCV篩查檢測(cè)報(bào)告陰性或根據(jù)S/Co比值判定為陽(yáng)性所有陽(yáng)性結(jié)果高S/Co比值陽(yáng)性*報(bào)告低S/Co比值陽(yáng)性*RIBA HCV檢測(cè)或陽(yáng)性報(bào)告陰性報(bào)告不確定報(bào)告陽(yáng)性陰性RIBA HCV檢測(cè)HCV RNA的NAT檢測(cè)陽(yáng)性報(bào)告陰性報(bào)告不確定報(bào)告報(bào)告*以S/Co 3.8 (OCD HCV ELISA 3.0) 或 8.0 (OCD VITROS ECi/ECiQ HCV)為“界值”。CDC抗-HCV實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果報(bào)告導(dǎo)則48 抗-HCV篩查檢測(cè)報(bào)告陰性或根據(jù)S/Co比值判定靶序列

23、來(lái)源: a. 單抗檢出的TB抗原蛋白編碼基因b. TB特異性核酸片段克隆c. 插入序列結(jié)核分枝桿菌(TB) 的分子診斷TB 檢測(cè)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)特點(diǎn)49靶序列來(lái)源: 結(jié)核分枝桿菌(TB) 的分子診斷TB 檢測(cè)實(shí)65KD，165bp;MPB64，240bp;IS6110，123bp;IS986，245bp; 16sDNA，584bp.舉例結(jié)核分枝桿菌(TB) 的分子診斷TB 檢測(cè)50舉例結(jié)核分枝桿菌(TB) 的分子診斷TB 檢測(cè)52 標(biāo)本處理 ：痰液化，抑制物去除 試劑質(zhì)控及靈敏度注意事項(xiàng)結(jié)核分枝桿菌(TB) 的分子診斷TB 檢測(cè)51 標(biāo)本處理 ：痰液化，抑制物去除注意事項(xiàng)結(jié)核分枝桿菌(TB 結(jié)核的PC

24、R臨床主要應(yīng)用 a.結(jié)核與其他分枝桿菌區(qū)分 b.結(jié)核耐藥基因 c.對(duì)含菌量低的標(biāo)本的分離 d.為臨床可疑者捕捉信息臨床評(píng)價(jià)結(jié)核分枝桿菌(TB) 的分子診斷TB 檢測(cè)52 結(jié)核的PCR臨床主要應(yīng)用 臨床評(píng)價(jià)結(jié)核分枝桿菌(TB) PCR方法與痰涂片及TB培養(yǎng)的比較 應(yīng)做比對(duì)研究臨床評(píng)價(jià)結(jié)核分枝桿菌(TB) 的分子診斷TB 檢測(cè)53 PCR方法與痰涂片及TB培養(yǎng)的比較臨床評(píng)價(jià)結(jié)核分枝桿菌(RFP（利福平）INH（異煙肼）SM（鏈霉素）EMB（乙胺丁醇）PZA（吡嗪酰胺）喹諾酮類(lèi)已確定的耐藥的抗結(jié)核藥物結(jié)核分枝桿菌(TB) 的分子診斷耐藥監(jiān)測(cè)54RFP（利福平）已確定的耐藥的抗結(jié)核藥物結(jié)核分枝桿菌(TB)單耐藥基因檢測(cè)耐利福平：突變一般發(fā)生在RNA聚合酶B亞單位編碼基因（rpoB基因）突變位點(diǎn)：531位 絲氨酸亮氨酸526位 組氨酸酪氨酸突變導(dǎo)致RFP 不能與RNA聚合酶B亞單位結(jié)合耐異煙肼：與