內(nèi)蒙古大學基因工程實驗指導

1、基因工程實驗指導基因工程實驗課程的內(nèi)容是從亞克隆一個基因直到最終表達出該基因產(chǎn)物的一個完整的科研項目。以表達納豆激酶為例，從已經(jīng)克隆在pMD-18-T載體上的納豆激酶酶原基因上用PCR擴增出837bp的納豆激酶成熟肽基因片段，與T載體連接后轉入DH5a菌中篩選鑒定，然后用雙酶切下納豆激酶成熟肽基因片段，插入帶有6個組氨酸標簽的原核表達載體pET-Trx，在表達菌BL(21)DE3中誘導表達出納豆激酶蛋白質(zhì)并用SDS鑒定。整套實驗圍繞納豆激酶基因的亞克隆、重組、轉化、篩選直到表達這一研究順序進行操作。其間共涉及學習約11種基因操作的基本技術，我們按這些操作技術出現(xiàn)的先后順序分別編為實驗一至實驗十

2、一。各個實驗之間具有很強的邏輯性和連貫性，前一個實驗的結果就是下一個實驗的原料。整套實驗設計實際上是一個基因操作實驗平臺，隨時能根據(jù)需要更改外源基因和表達載體或進一步擴充實驗內(nèi)容。我們在每年的教學實踐中會不斷增加目的基因和表達載體的種類，以便于學生實驗小組能夠從事不同的項目，減少雷同，增加興趣。基因工程實驗的宗旨是讓學生在獨立實踐操作中學習基因工程的基本研究方法和體會基因工程研究的嚴密邏輯和科研理念。實驗教學的組織方式是科研項目式管理，即在教師的總體指導下，在給定的實驗材料和實驗條件的基礎上，讓學生獨立思考、自行規(guī)劃實驗流程、制定實驗計劃、準備實驗材料、動手操作、整理和分析實驗結果，最后完成實

3、驗項目，寫出實驗論文。因此學生在實驗前要認真預習實驗內(nèi)容，結合學過的基因工程原理，弄懂每一步實驗的目的和原理，了解實驗的內(nèi)容和總體實驗方案，寫出基因工程大實驗開題報告，交教師審閱和討論修改后才能進入實驗室操作。在實驗過程中，教師不干涉學生的實驗安排和操作程序，僅以導師的身份對學生的實驗操作進行現(xiàn)場巡回指導、回答學生的疑問、為學生示范一些高檔實驗儀器和軟件的使用，提供公用的試劑（如酶）等，并對學生的每一步實驗結果進行評價和把關。因局部實驗失敗而沒有取得預期的結果，無法進入下一步實驗的小組，先要與教師討論分析失敗的原因，然后向其他成功組的同學或教師索取實驗材料繼續(xù)進行?；蚬こ虒嶒炞⒁馐马?.上實

4、驗課的學生每兩人分為一個小組，登記領取微量移液器（1000mL, 200mL和10mL各一支）。2.課前要提前預習實驗內(nèi)容，弄懂實驗設計的目的，理清實驗順序。認真填寫本科基因工程實驗論文開題報告，制定實驗方案（沒有方案或方案不合理者不能進入實驗操作）。3.實驗指導中所寫的實驗一、實驗二等并非嚴格的實驗順序，只是提供一種相關的實驗操作技術。各小組學生應根據(jù)整體實驗方案制定自己的實驗順序和計劃。4.實驗指導中所寫的實驗操作技術和步驟僅供參考，學生在弄懂操作原理和目的的基礎上多動腦筋，摸索適合自己的操作技巧。5.由于實驗內(nèi)容多，時間短，多數(shù)實驗需要同時或穿插進行，一定要做好統(tǒng)籌安排，分別記錄實驗操作

5、和結果。6.實驗指導中的所有單項實驗都屬于一個整體流程。實驗時間安排上沒有上下午晚上等嚴格的作息安排，一切服從實驗進度，全部實驗必須在10天之內(nèi)完成。7.每一步實驗都要詳細地記錄操作內(nèi)容、時間、步驟、結果等，以備查詢！8.對任何自己不熟悉的實驗儀器都不要隨意操作（尤其是PCR儀、微量移液器！）。在操作的過程中發(fā)現(xiàn)任何意外的現(xiàn)象都要及時向任課教師匯報。9.寫作開題報告、實驗記錄和實驗論文一定要文理通順、邏輯清晰、圖表說明詳細，討論分析透徹（包括操作錯誤和結果失?。?0.在實驗室內(nèi)不能大聲喧嘩。11.在實驗的過程中制造的任何垃圾都要丟到垃圾筐里（或先放在自己的桌面一角），嚴禁隨地投棄！特別注意對

6、廢棄細菌的殺滅和有毒垃圾的定點投放和處理。12.實驗結束后要把用過的器皿清洗后歸放整齊并清點數(shù)目，向教師匯報征得同意后方可離開實驗實。13.值日組的同學最后離開，等待清掃實驗室的衛(wèi)生，關閉門窗水電。14.實驗時損壞的任何物品都要及時申報，并按照生命科學學院實驗中心的有關規(guī)定進行適當?shù)馁r償。15.實驗需要的油性記號筆、計時器（或手表）、衛(wèi)生紙、白大衣、擦手毛巾等需要自備。實驗一質(zhì)粒DNA的小量制備【實驗目的】學會最常用的小量制備質(zhì)粒DNA的堿裂解方法?！緦嶒炘怼扛鶕?jù)共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA與線性DNA在拓撲學上的差異來分離。在pH12.012.5這個狹窄的范圍內(nèi)，DNA雙螺旋結構被解開而變性。盡

7、管在這樣的條件下共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA也會變性，但兩條互補鏈彼此互相盤繞，仍會緊密結合在一起。當加入pH4.8的乙酸鉀高鹽緩沖液使pH恢復中性時，共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA復性快，而線性的染色體DNA復性緩慢。溶液中的K+置換了SDS中的Na+而形成了不溶性的PDS，由于基因組DNA很長，容易被PDS共沉淀，經(jīng)過離心與蛋白質(zhì)和大分子RNA一起沉淀下去，質(zhì)粒DNA和小分子RNA留在上清液里，用乙醇沉淀即可得到質(zhì)粒DNA。【實驗用品】1.器材超凈工作臺，接種環(huán)，酒精燈，臺式離心機，旋渦混合器，微量移液取樣器，恒溫搖床，雙面微量離心管架，試管架，標簽紙，磁力攪拌機，pH計，制冰機。搖菌試管洗凈并蓋上蓋、

8、1.5mL離心管裝入不銹鋼飯盒、吸頭（10mL，200mL，1000mL）裝入相應的吸頭盒，一起高壓（121C 20min）滅菌。2.試劑（1）LB培養(yǎng)基：胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，加200mL dd water攪拌完全溶解，用約200mL 5N NaOH調(diào)pH至7.0，加dd water至1L，121C 20min滅菌。使用時加入氨芐青霉素，終濃度100mg/mL。（2）氨芐青霉素儲存液：無菌水配制100mg/mL，分裝后-20C保存。（3）溶液 I 葡萄糖/Tris/EDTA(GTE)溶液：50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris HCl pH8.0，1

9、0mmol/L EDTA ，調(diào)pH8.0（4）溶液 II（NaOH/SDS溶液)：0.2mol/L NaOH，1% SDS，現(xiàn)用現(xiàn)配（5）溶液 III KAc溶液（pH4.8）：60mL 5mol/L KAc，加冰乙酸調(diào)至pH4.8，補dd water至100mL（6）10mg /mL RNase A：RNA酶A溶于10mmol/L Tris HCl pH7.5，15mmol/L NaCl中（7）TE 緩沖液：10mmol/L Tris HCl pH8.0，1mmol/L EDTA pH8.0，高溫高壓滅菌（8）95%和70%乙醇（9）0.5mol/L EDTA pH8.0：稱取18.61g

10、Na2EDTA2H2O，加入約80mL的去離子水，充分攪拌。用NaOH顆粒調(diào)節(jié)PH值至8.0（約2g NaOH）使其完全溶解。加去離子水將溶液定容至100mL。高溫高壓滅菌。（10）1mol/L Tris HCl pH7.5：稱取12.1gTris堿,加80mL蒸餾水，緩慢地加濃鹽酸至pH6.8（約加6.5mL）。讓溶液冷卻至室溫，調(diào)至pH7.5，加蒸餾水至100mL。高溫高壓滅菌后4C保存（11）1mol/L Tris HCl pH8.0：稱取12.1gTris堿,加80mL蒸餾水，緩慢的加濃鹽酸至pH8.0（約加4.2mL）。讓溶液冷卻至室溫，調(diào)至pH8.0，加蒸餾水至100mL。高溫高壓

11、滅菌后4C保存3.材料帶有pET-Trx質(zhì)粒載體的DH5a菌,帶有pMD18-T-NK（納豆激酶）載體的DH5a菌，保存在-80C。【實驗方法】1.在超凈工作臺中分別吸取5mL和2 mL LB（Amp+），分別加入兩支滅菌的搖菌管中。2.從超低溫冰箱中取出保存pET-Trx載體的菌種和pMD-18T-NK的菌種，在超凈工作臺上用燒紅的接種環(huán)刮一下，再把接種環(huán)于無菌LB培養(yǎng)液（含100ug/mL氨芐青霉素）中攪拌一下，操作完后迅速把菌種放回超低溫冰柜中，切不可將菌融化！37C搖床中搖過夜。pET-Trx菌：接種于5mL LB（Amp+）pMD18-T-NK菌：接種于2mL LB（Amp+）3.取

12、1.5mL的菌液于1.5mL離心管中，10000r/min離心1min，棄上清液（盡量棄干凈），留沉淀備用。pET-Trx菌：3管（31.5mL）pMD18-T-NK菌：1管（1.5mL）4.在沉淀中加入100mL溶液I，蓋上蓋后立即在渦旋混合器上混勻，室溫下靜置15min。（等待的同時，取一個塑料盒，裝上適量的碎冰塊備用。）5.加入200mL溶液II，蓋上蓋后上下輕微顛倒幾次混勻，插入冰中，放置15min。6.加入150mL溶液III，蓋上蓋后上下輕微顛倒幾次混勻，插入冰中，放置15min。7.14000r/min離心510min，小心吸取400mL上清液于另一個干凈的1.5mL離心管中，（

13、不要將白色沉淀物帶入！如帶入可重新離心），加入800mL 95%乙醇，蓋上蓋后立即在渦旋混合器上混勻，室溫下（或冰上）靜置510min。8.14000r/min離心10 min，小心棄掉上清液，加入500mL 70%乙醇，蓋上蓋后立即在渦旋混合器上混勻。14000r/min離心10 min，小心棄掉上清液，在衛(wèi)生紙上倒置輕磕，盡量棄干凈。9.再加入500mL70%乙醇，蓋上蓋后立即在渦旋混合器上混勻。14000r/min離心10 min，小心棄掉上清液，在衛(wèi)生紙亦上倒置輕磕，盡量棄干凈。10.離心管倒置在37C培養(yǎng)箱中（或室溫）空氣干燥。（管底的沉淀質(zhì)粒DNA用肉眼幾乎看不見?。?。11.pMD

14、18-T-NK加入30mL無菌蒸餾水或TE緩沖液；3管pET-Trx質(zhì)粒中每管加入10mL蒸餾水混勻后收集到一個管中，渦旋混合器上混勻，在離心機中瞬時轉一下（約2000r/min 1min），使溶液集中在管底。待電泳確認（見實驗二）后再在pET-Trx質(zhì)粒中加入1mL RNaes A。用油性記號筆標記后放入4C冰箱中備用。12.在剩余的菌液中倒入少許84消毒液，待溶液變清亮后隨廢液和剩余的冰塊一起倒入下水池。清理桌面，撰寫實驗記錄。13.有條件的話，可以選作用分光光度計測定質(zhì)粒DNA的濃度：用dd water稀釋20倍，并以dd water為對照，在波長260nm，280nm及310nm處讀O

15、D值。通過下列公式計算DNA的濃度（mg/mL）：ssDNA濃度=33（OD260OD310）稀釋倍數(shù)dsDNA濃度=50（OD260OD310）稀釋倍數(shù)ssRNA濃度=40（OD260OD310）稀釋倍數(shù)【思考題】1.影響最終質(zhì)粒產(chǎn)量的主要因素有哪些？2.提取到的質(zhì)粒純度將直接影響到以后的酶切效果，如何操作才能盡可能地避免蛋白質(zhì)的污染？實驗二質(zhì)粒DNA電泳鑒定【實驗目的】學會常用的DNA瓊脂糖凝膠電泳技術?！緦嶒炘怼緿NA雙螺旋分子骨架兩側帶有含負電荷的磷酸根，在電場中會向正極方向移動。不同長度和形態(tài)的DNA由于受到凝膠介質(zhì)的阻力不同，表現(xiàn)為不同的遷移率而被分開?！緦嶒炗闷贰?.器材電泳儀

16、，水平凝膠電泳槽和梳子及其制膠模塊。250mL三角瓶，微波爐，臺式離心機，旋渦混合器，凝膠成像系統(tǒng)，微量移液取樣器，1.5mL離心管，雙面微量離心管架，試管架，一次性薄膜手套等。2.試劑（1）50TAE電泳緩沖液（pH約8.5）：Tris堿 242g，57.1mL冰乙酸，37.2g Na2EDTA2H2O，dd water 定容至1L。使用時稀釋成1。（2）1000溴化乙錠儲存液（0.5mg/mL）：50mg溴化乙錠溶于100mL dd water，4C避光儲存。使用時在蒸餾水里滴入適量，使水看起來微微發(fā)紅即可。（3）10加樣緩沖液：20% Ficoll 400，0.1mol/L Na2EDT

17、A pH8.0，1.0% SDS，0.25%溴酚藍（4）6加樣緩沖液：0.25%溴酚藍，40%蔗糖水溶液（5）DNA分子量標準：lDNAHindIII，Tiangen公司的Marker II或Marker III等。（6）電泳級瓊脂糖粉3.材料pET-Trx質(zhì)粒，pMD18-T-NK質(zhì)粒，PCR產(chǎn)物或DNA酶切產(chǎn)物等?！緦嶒灧椒ā?.稱取0.25g瓊脂糖粉，放入三角瓶，加入25mL 1TAE電泳緩沖液（注意原液是50，需要自己稀釋?。?，用保鮮膜蓋住，放入微波爐中燒開（0.5min）。25mL 正好能倒?jié)M一塊小膠。實驗時可以根據(jù)需要少倒一些，以制作較薄的膠。如果電泳樣品少的話，可與其他組共用一塊

18、膠，或在電泳結束后將帶有DNA的膠切下來放入EB染色，剩下的膠塊用保鮮膜包住放到4C冰箱，以便下次再用。2.注意觀察燒瓶中的瓊脂糖粉末，待完全熔化后停止微波爐（切不可讓膠溶液溢出到微波爐中！）。3.戴上線手套，從微波爐中取出三角瓶，置桌面上冷卻至不燙手（約5060C）。4.把梳子（最細的齒）插到凝膠灌制模具的正確位置后緩緩倒入膠溶液。膠溶液倒至與模具的矮邊緣相差12mm即可，但盡量不要太厚，更不要把膠溶液溢到外面。在桌面上靜置1020分鐘待膠完全凝固。（如有剩下的膠溶液，封口后留待以后再熔化使用）。5.在水平電泳槽中加滿1TAE電泳緩沖液。根據(jù)電泳槽的長度把電泳儀的電壓調(diào)至10V/cm（170

19、V），注意正負電極的位置連接正確。6.待膠完全凝固后（1520分鐘），小心拔出梳子。用手指捏住模具兩側的高邊緣取出模具和凝膠放入電泳槽中間的平臺上，凝膠要沒入電泳液中。凝膠上有樣品孔的一側要朝向電泳槽的負極（黑色電極）。7.取1小片光面紙，點6mL蒸餾水、1mL10加樣緩沖液，再加入3mL質(zhì)粒DNA溶液制成10mLDNA混合樣品。在做PCR產(chǎn)物或酶切產(chǎn)物電泳的時候要根據(jù)DNA的量上樣。8.在凝膠上選擇相鄰的加樣孔。用10mL的吸液頭分別將紙上的混合樣品加入凝膠的加樣孔中。加樣時持移液器的手以肘部固定在桌上，用另一只手指夾住移液器下部，以減少移液器的抖動?？吹綆в兴{色樣品的吸管尖頭伸進加樣孔后（

20、不能伸得太深，以免穿破凝膠的底部）緩緩將藍色的樣品壓入加樣孔中，切不可使藍色樣品流到孔外。在電泳PCR產(chǎn)物或酶切產(chǎn)物時，在相鄰的加樣孔中加入2mLDNA分子量標準物。9.打開電源開關，170V電泳。樣品將形成一條藍色的橫帶向前移動（如果發(fā)現(xiàn)藍色向后移動，立即關閉電源，調(diào)換電極）。電泳將進行約30min。10.當藍色的溴酚藍遷移到距凝膠邊緣1cm時，關閉電源。取出模具和凝膠。將沒有使用的凝膠部分切下來收入溶膠瓶，回收再用。11.把帶有樣品的凝膠小心放入盛有EB的搪瓷盒中。以下需戴手套到專門的染色區(qū)操作。放置約10分鐘后，取出來在自來水中浸泡10min。用自來水沖洗后放入凝膠成像系統(tǒng)中拍照。照片要

21、以合適的文件名保存，以便寫論文的時候調(diào)用。12.染有EB的凝膠和手套（只要手套沒破，可以節(jié)約使用：將手套脫下來以后張開口放在染色區(qū)，下一次把手伸進去即可）要放到專用的垃圾袋中作專門處理，以免污染環(huán)境。不可用接觸過EB的手套接觸電腦或凝膠成像儀的門。13.撰寫實驗記錄?！舅伎碱}】1.泳道中的質(zhì)粒DNA有幾條帶？為什么？2.溴酚藍的遷移率相當于多少bp的DNA?3.影響本實驗結果的因素有哪些？實驗三質(zhì)粒DNA的酶切【實驗目的】學會用限制性內(nèi)切酶切割DNA?！緦嶒炘怼縄I型限制性內(nèi)切酶能識別雙鏈DNA內(nèi)部的特殊序列并在識別位點處將雙鏈切斷，形成粘性末端或齊平末端，通過電泳把酶切后的DNA片段混合物

22、分離。可根據(jù)DNA上已知的酶切位點和預期的酶切結果，與DNA分子量Marker對比，判斷酶切是否成功。【實驗用品】1.器材旋渦混合器，微量移液取樣器，雙面微量離心管架，水漂，恒溫水浴鍋。移液器吸頭、0.5mL和1.5mL微量離心管分別高壓滅活。2.試劑（1）50TAE電泳緩沖液（pH約8.5）：Tris堿 242g，57.1mL冰乙酸，37.2g Na2EDTA2H2O，dd water 定容至1L。使用時稀釋成1。（2）1000溴化乙錠儲存液（0.5mg/mL）：50mg溴化乙錠溶于100mL dd water，4C避光儲存。使用時在蒸餾水里滴入適量，使水看起來微微發(fā)紅即可。（3）10加樣緩

23、沖液：20% Ficoll 400，0.1mol/L Na2EDTA pH8.0，1.0% SDS，0.25%溴酚藍（4）6加樣緩沖液：0.25%溴酚藍，40%蔗糖水溶液（5）DNA分子量標準：lDNAHindIII，Tiangen公司的Marker II或Marker III等。（6）電泳級瓊脂糖粉（7）EcoR I和BamH I內(nèi)切酶，10內(nèi)切酶緩沖液3.材料pET-Trx質(zhì)粒【實驗方法】1.先準備一個冰盒并放入一定量的冰塊。混合下列溶液于一個高壓過的0.5mL微量離心管中：自提的pET-Trx質(zhì)粒DNA 8 L10酶切緩沖液（用BamHI的緩沖液） 4 Ldd water 26 LEco

24、RI 1LBamHI 1L總體積 40L2.加完質(zhì)粒、緩沖液和水后，從-30C冰柜中取出限制性內(nèi)切酶，立即插入冰塊中。3.用一只手的手指捏住盛放酶的微量離心管的上部（以免手指給酶液加溫），另一只手持10L微量移液器，讓吸頭尖部剛好伸進酶液即可，吸取1 LEcoRI限制性內(nèi)切酶。更換吸頭后吸取1 LBamHI限制性內(nèi)酶。吸完酶后立即把內(nèi)切酶液送回冰柜！4.在酶切樣品混合液中加入限制性內(nèi)切酶后，輕輕震動微量離心管，使管中的溶液混勻。再在離心機中2000r/min離心10秒。取出后插到水漂的孔中，在37C水浴中酶切3-4 h。注意不同的內(nèi)切酶的最適酶切溫度不同。5.取少量（約10L）酶切產(chǎn)物，與合適

25、的已知分子量的DNA（如先前的PCR產(chǎn)物或Marker等）對比電泳（方法見實驗二），以確認酶切是否成功。根據(jù)已知的酶切位點，判斷酶切結果。6.酶切后的目的片斷可以回收備用（方法見實驗五）。7.清理桌面垃圾，清洗實驗儀器。撰寫實驗記錄?！舅伎碱}】1.酶切反應混合物的體積是否對酶切效果有影響？為什么？2.如何估計DNA用量和酶的用量？3.在吸取內(nèi)切酶的時候如何操作才能避免浪費？實驗四PCR擴增制備目的基因【實驗目的】學會PCR儀的設置和PCR操作的基本技術。【實驗原理】將待擴增的DNA模板加熱至94變性，再降低溫度與其兩側互補的寡聚核苷酸引物復性，然后經(jīng)過耐熱的DNA聚合酶延伸。再進入下一輪變性復

26、性延伸的循環(huán)，n次循環(huán)后DNA可被擴增（1+X）n倍。復性溫度可根據(jù)引物設計軟件Oligo6或Primer5給出的引物Tm值確定，其中7.0），室溫或37放置2min（55-80洗脫效果更好）。8000r/min室溫離心1min，離心管中的液體就是回收產(chǎn)物。（2）其它公司的試劑盒（如AXYGEN公司的AXYprep DNA Gel Extraction Kit）的操作步驟與上述大同小異，做實驗時按照各家的產(chǎn)品說明書操作即可。8.可取2l-5l回收產(chǎn)物電泳，檢測是否有回收到的目的DNA帶。9.清理桌面，撰寫實驗記錄?！舅伎碱}】1.為何避免用EB染色及用紫外燈照射欲回收的目的DNA？實驗六目的基因

27、片段與載體連接【實驗目的】學會DNA片斷的體外連接技術?！緦嶒炘怼吭贛g2+和ATP存在下，T4 DNA連接酶能催化載體分子的粘性末端與外源DNA的相同粘性末端連接成重組DNA分子。【實驗用品】1.器材旋渦混合器，微量移液取樣器，雙面微量離心管架，臺式離心機，干式恒溫氣浴，恒溫水浴，泡沫塑料保溫盒。移液器吸頭和0.5mL微量離心管分別進行高壓滅活。2試劑（1）T4 DNA連接酶（2）連接酶緩沖液（3）無菌dd Water等3材料（1）pMD19-T載體。NK PCR產(chǎn)物（2）EcoRI +BamHI酶切回收的pET-Trx載體。EcoRI +BamHI酶切回收的NK插入片斷【實驗方法】1.P

28、CR產(chǎn)物與T載體直接連接：（1）事先將干式恒溫儀（或泡沫塑料保溫盒里的水）溫度調(diào)整到14C。（2）取一個高壓滅活的0.5mL微量離心管，加入：PCR產(chǎn)物混合液 4mLpMD19-T載體 1mLT4 DNA連接酶（TAKARA, 350U/ul） 0.5mL連接酶緩沖液 1mLdd Water 3.5mL總體積 10mL（3）將上述混合液輕輕震蕩后再短暫離心，然后置于14C水中保溫過夜。（4）連接后的產(chǎn)物可以立即用來轉化感受態(tài)細胞（方法見實驗八）或置4C冰箱備用。2.DNA回收片斷（NK）與表達載體（pET-Trx）連接：（1）取一個滅菌的0.5mL微量離心管，加入：NK片段回收產(chǎn)物 4mLpE

29、T-Trx載體酶切回收產(chǎn)物 1mLT4 DNA連接酶（TAKARA, 350U/uL） 0.5mL連接酶緩沖液 1mLdd Water 3.5mL總體積 10mL（2）將上述混合液輕輕震蕩后再短暫離心，然后置于14C干式恒溫儀（或14C水中）中保溫過夜。（3）連接后的產(chǎn)物可以立即用來轉化感受態(tài)細胞（方法見實驗八）或置4C冰箱備用。【思考題】1.連接酶的最適活性溫度是多少？2.為什么要采用14C下連接？3.如何確定插入片段的用量與質(zhì)粒載體的用量？實驗七感受態(tài)大腸桿菌的制備【實驗目的】學會用CaCl2法制備大腸桿菌感受態(tài)細胞?！緦嶒炘怼考毦?C的CaCl2低滲溶液中脹成球形，丟失部分膜蛋白，成

30、為容易吸收外源DNA的狀態(tài)?！緦嶒炗闷贰?器材旋渦混合器，微量移液取樣器，雙面微量離心管架，臺式冷凍離心機，制冰機，恒溫搖床，分光光度計，超凈工作臺，恒溫培養(yǎng)箱，接種環(huán)。搖菌試管、三角燒瓶、移液器吸頭和0.5mL微量離心管分別進行高壓滅菌。2試劑（1）LB培養(yǎng)基：胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，加200mL dd water攪拌完全溶解，用約200mL5N NaOH調(diào)pH至7.0，加dd water至1L，121C20min滅菌。（2）0.1 mol/LCaCl2溶液，121C20min滅菌后存放在冰箱。（3）無菌dd Water3材料E. coliDH5a，E. coli

31、BL21（DE3）【實驗方法】1.取一支無菌的搖菌試管，在超凈工作臺中加入2mL LB培養(yǎng)基（不含抗菌素?。?.從超低溫冰柜中取出DH5a菌種和BL21(DE3)菌種，放置在冰上。在超凈工作臺中用燒紅的接種環(huán)插入凍結的菌中，然后接入含2mL LB培養(yǎng)基的試管中，37搖床培養(yǎng)過夜。3.在超凈工作臺中取0.5mL上述菌液轉接到含有50mL LB培養(yǎng)基的三角燒瓶中，37下250r/min搖床培養(yǎng)23h。4.取少量菌液測定OD590為0.375（0.40.6，細胞數(shù)108/mL，此為關鍵參數(shù)?。?。以下操作除離心外，都在超凈工作臺中進行。如果有大型冷凍離心機則應當使用50mL離心管離心集菌和CaCl2

32、處理。5.將菌液分裝到1.5mL預冷的無菌微量離心管中，于冰上放置10min，然后于4，5000r/min離心10min。6.棄上清，并將離心管倒置以倒盡上清液。加入1mL 冰冷的0.1 mol/LCaCl2溶液，立即在渦旋混合器上混勻，插入冰中放置30min。7.4，5000r/min離心10min。棄上清液后，用1mL 冰冷的0.1 mol/LCaCl2溶液垂懸，插入冰中放置30min。8.4，5000r/min離心10min。棄上清液后，用200L 冰冷的0.1 mol/LCaCl2溶液垂懸，超凈工作臺中按每管50mL分裝到0.5mL的無菌微量離心管中。9.分裝好的感受態(tài)菌可以直接用作轉

33、化實驗（方法見實驗八），或立即放入-80超低溫冰柜中保藏（可存放數(shù)月）。以后用的時候每次用完一管，不可反復凍融。10.在被細菌污染的桌面上噴灑70%乙醇，擦干桌面，寫實驗記錄。【思考題】1.制作感受太菌的過程中，應注意那些關鍵步驟？2.CaCl2溶液的作用是什么？為什么要冰冷的？實驗八感受態(tài)細菌的轉化【實驗目的】學會用質(zhì)粒DNA轉化感受態(tài)受體菌的基本操作技術?！緦嶒炘怼抠|(zhì)粒DNA粘附在細菌細胞表面，經(jīng)過42C短時間的熱休克處理，促進其吸收DNA。然后在非選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)一代，待質(zhì)粒上所帶的抗菌素基因表達，就可以在含抗菌素的培養(yǎng)基中篩選。如果轉化成功，獲得外源質(zhì)粒的受體菌能夠依靠質(zhì)粒上的抗菌素

34、抗性基因在選擇平板培養(yǎng)基上生長，沒有獲得外源質(zhì)粒的菌體將被抗菌素殺死?！緦嶒炗闷贰?器材旋渦混合器，微量移液取樣器，雙面微量離心管架，干式恒溫氣?。ɑ蚝銣厮″仯?，制冰機，恒溫搖床，超凈工作臺，酒精燈，玻璃涂棒，恒溫培養(yǎng)箱，0.22m細菌濾器。培養(yǎng)皿、移液器吸頭和1.5mL、0.5mL微量離心管分別進行高壓滅菌。4試劑（1）LB培養(yǎng)基：胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，加200mL dd water攪拌完全溶解，用約200mL5N NaOH調(diào)pH至7.0，加dd water至1L，121C20min滅菌。使用時可加入氨芐青霉素，終濃度100mg/mL。（2）氨芐青霉素儲存液：

35、無菌水配制100mg/mL，每管200L分裝到0.5mL微量離心管中，-20C保存。（3）LB平板培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基中含14%瓊脂，高壓滅菌后加入氨芐青霉素至100g/mL，每個培養(yǎng)皿中約15mL倒制平板。（4）無菌dd water（5）20%（M/V）IPTG：無菌水配制，過濾滅菌。（6）2%（M/V）X-gal：用N,N-二甲基甲酰胺配制，過濾除菌，鋁箔封裹避光-20C保存。3材料感受態(tài)細菌，質(zhì)?！緦嶒灧椒ā?.事先將恒溫水浴的溫度調(diào)到42。2.從-80 超低溫冰柜中取出一管（50L）感受態(tài)菌，立即用手指加溫融化后插入冰上，冰浴510min。3.加入5L連接好的質(zhì)?；旌弦海―NA含量不超過

36、100ng），輕輕震蕩后放置冰上20min。4.輕輕搖勻后插入42水浴中12min進行熱休克，然后迅速放回冰中，靜置35min。5.在超凈工作臺中向上述管中加入300L LB培養(yǎng)基（不含抗菌素）輕輕混勻，然后固定到搖床的彈簧架上37震蕩45min。6.在超凈工作臺中取上述轉化混合液50300L（根據(jù)轉化效率和載體連接效率而定），滴到含合適抗菌素的固體LB平板培養(yǎng)皿中。從酒精中取出玻璃涂布棒，在火上點燃，熄滅后稍等片刻，待其冷卻后輕輕涂布均勻。7.如果載體和宿主菌適合藍白斑篩選的話，滴完菌液后再在平板上滴加40L 2% X-gal，7L 20% IPTG，用酒精燈燒過的玻璃涂布棒涂布均勻。8.在

37、涂好的培養(yǎng)皿上做上標記，先放置在37恒溫培養(yǎng)箱中約1030min直到表面的液體都滲透到培養(yǎng)基里后，再倒置過來放入37恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)約18h。9.在被細菌污染的桌面上噴灑70%乙醇，擦干桌面，寫實驗記錄。10.觀察平板上長出的菌落克隆，以菌落之間能互相分開為好。挑選白色菌斑進行篩選和鑒定（方法見實驗九）?！舅伎碱}】1.影響轉化效率的因素有哪些？2.白色菌落出現(xiàn)的原理是什么？實驗九轉化克隆的篩選和鑒定【實驗目的】學會用酶切法或PCR法篩選重組質(zhì)粒轉化成功的克隆菌?！緦嶒炘怼坷棉D化后宿主菌所獲得的抗菌素抗性性狀篩選出獲得質(zhì)粒的菌落克隆。再從這些菌落中鑒定出質(zhì)粒上帶有外源基因插入片斷的克隆菌落。選

38、擇一定數(shù)目的菌落接種培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，用載體克隆位點兩側的酶切位點進行酶切，如果切出預期的DNA片段，說明質(zhì)粒上插入了外源DNA片段。也可以以提取的質(zhì)粒為模板，或直接以選擇培養(yǎng)基上的菌落得少量菌體為模板，用目的DNA片段兩側的引物進行PCR擴增，如果擴增出預期的DNA帶，說明質(zhì)粒上插入了目的DNA?！緦嶒炗闷贰?器材旋渦混合器，小鑷子，微量移液取樣器，雙面微量離心管架，干式恒溫氣浴（或恒溫水浴鍋），制冰機，PCR儀，恒溫搖床，超凈工作臺，酒精燈。牙簽、搖菌管、移液器吸頭和1.5mL微量離心管分別進行高壓滅菌。2試劑（1）LB培養(yǎng)基：胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，加200mL

39、 dd water攪拌完全溶解，用約200mL5N NaOH調(diào)pH至7.0，加dd water至1L，121C20min滅菌。使用時可加入氨芐青霉素，終濃度100mg/mL。（2）氨芐青霉素儲存液：無菌水配制100mg/mL，每管200L分裝到0.5mL微量離心管中，-20C保存。（3）LB平板培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基中含14%瓊脂，高壓滅菌后加入氨芐青霉素至100g/mL，每個培養(yǎng)皿中約15mL倒制平板。（4）無菌dd water（5）20（M/V）%IPTG：無菌水配制，過濾滅菌。（6）2%（M/V）X-gal：用N,N-二甲基甲酰胺配制，過濾滅菌。（7）50TAE電泳緩沖液（pH約8.5）：T

40、ris堿 242g，57.1mL冰乙酸，37.2g Na2EDTA2H2O，dd water 定容至1L。使用時稀釋成1。（8）1000溴化乙錠儲存液（0.5mg/mL）：50mg溴化乙錠溶于100mL dd water，4C避光儲存。使用時在蒸餾水里滴入適量，使水看起來微微發(fā)紅即可。（9）10加樣緩沖液：20% Ficoll 400，0.1mol/L Na2EDTA pH8.0，1.0% SDS，0.25%溴酚藍（10）6加樣緩沖液：0.25%溴酚藍，40%蔗糖水溶液（11）DNA分子量標準：lDNAHindIII，Tiangen公司的Marker II或Marker III等。（12）電泳

41、級瓊脂糖粉（13）3U/L Taq DNA聚合酶（14）10PCR緩沖液（MgCl2free）（15）25mMMgCl2（16）dNTP混合液（每種25mM）（17）無菌dd water（18）溶液 I 葡萄糖/Tris/EDTA(GTE)溶液：50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris HCl pH8.0，10mmol/L EDTA pH8.0（19）溶液 II（NaOH/SDS溶液)：0.2mol/L NaOH，1% SDS，現(xiàn)用現(xiàn)配（20）溶液 III KAc溶液（pH4.8）：60mL 5mol/L KAc，加冰乙酸調(diào)至pH4.8，補dd water至100mL（21）10mg

42、/mL RNase A：RNA酶A溶于10mmol/L Tris HCl pH7.5，15mmol/L NaCl中（22）TE 緩沖液：10mmol/L Tris HCl pH8.0，1mmol/L EDTA pH8.0（23）95%和70%乙醇（24）EcoRI和BamHI內(nèi)切酶，10內(nèi)切酶緩沖液（25）65%甘油：65%甘油，0.1mol/L MgSO4，0.025mol/L Tris Cl pH8.03材料要鑒定的克隆，引物【實驗方法】方法一：菌落快速PCR篩選法（選做）1.在轉化的平板培養(yǎng)基上隨機選取3個邊緣清晰的白色菌落，并用記號筆在其所在的培養(yǎng)皿底部玻璃背面畫圈做標記編號。2.在0

43、.2mL PCR微量離心管中配制25L反應體系（方法參見實驗四）。 dd water 16L10PCR buffer（不含MgCl2）2.5L 25mM MgCl21.5L 2.5mmol/L dNTP 2L（每種dNTP終濃度0.2mM） 10mol/L Primer1 1L（12.525pmoles） 10mol/L primer2 1L（12.525pmoles） Taq酶 0.5L（1.5u） 模板質(zhì)粒：用小tip頭輕輕粘一下選中的白色菌落，伸入PCR混合液中洗一洗總體積 25L3.根據(jù)PCR儀的操作手冊設置PCR儀的循環(huán)程序： （1）94C5min（2）94C 1min（3）60C

44、1min（根據(jù)引物的Tm值設定）（4） 72C 1min50s（根據(jù)所擴增的DNA的長度設定）（5）go to（2）29 times（6）72C10min4.PCR結束后，取10L產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳（與原始插入片斷同時電泳）。觀察膠上是否有預計的主要產(chǎn)物帶。5.按照編號找到培養(yǎng)皿中的原菌斑。根據(jù)需要進行放大培養(yǎng)提取其質(zhì)粒6.提取到的質(zhì)粒與原先的空載體（或已知分子量的質(zhì)粒）再對比電泳（方法見實驗二）篩選，然后用內(nèi)部引物進行PCR的鑒定，或用酶切進一步確認。方法二：酶切鑒定1.在轉化的平板培養(yǎng)基上隨機選取3個邊緣清晰的白色菌落，并用記號筆在其所在的培養(yǎng)皿底部玻璃背面畫圈做標記編號。2.在超凈工

45、作臺中取3支無菌搖菌管，各加入3mL LB（含100mg/mL氨芐青霉素），用記號筆寫好編號。3.在超凈工作臺中將70%乙醇浸泡過的小鑷子頭用酒精燈烤過，鑷取一支無菌牙簽。用牙簽的尖部接觸轉化的平板培養(yǎng)基上的一個白色菌落，然后將牙簽放入盛有3mL LB（含100mg/mL氨芐青霉素）的搖菌管中。4.37搖菌過夜后，用堿裂解法分別提取質(zhì)粒（方法見實驗一）。搖菌管中的剩余菌液暫保留在4冰箱中。5.將提取到的3管質(zhì)粒樣品與已知分子量的質(zhì)粒同時電泳（方法見實驗二），先根據(jù)分子量判斷和選取有插入片段的質(zhì)粒。6.然后用適當?shù)拿盖校ǚ椒ㄒ妼嶒炄?.酶切產(chǎn)物與目的片段一同電泳（方法見實驗二）來進一步鑒定其上

46、的外源插入片斷大小是否與預期相符。8.將經(jīng)過鑒定判斷為正確的質(zhì)粒保存。按照編號找到冰箱中原菌液。根據(jù)需要進行放大培養(yǎng)提取其質(zhì)?；蜻M行誘導表達，或取500mL菌液與500mL65%甘油混合后-80保存菌種。9.在被細菌污染的桌面上噴灑70%乙醇，擦干桌面，寫實驗記錄?！舅伎碱}】1.PCR法篩選的優(yōu)點和缺點是什么？2.酶切法與PCR法篩選方案哪個更可靠？3.最終確認克隆的方法有哪些？實驗十外源基因的誘導表達【實驗目的】了解外源基因在原核細胞中表達的特點和IPTG誘導表達的方法?！緦嶒炘怼客庠椿蚩寺≡诤蠺7啟動子的表達載體pET-Trx中。lacI產(chǎn)生的阻遏蛋白與lac操縱基因結合抑制下游的外

47、源基因轉錄。在沒有誘導劑的條件下先讓宿主菌生長，等到細菌進入最佳生長狀態(tài)，向培養(yǎng)基中加入誘導物IPTG（異丙基硫代-b-D-半乳糖），與阻遏蛋白結合解除抑制，使整合在BL21（DE3）基因組中的T7 RNA聚合酶表達，從而啟動表達載體pET-Trx上的外源基因大量表達。表達的蛋白可用SDS或Western-blotting檢測。【實驗用品】1器材旋渦混合器，微量移液取樣器，雙面微量離心管架，臺式離心機，制冰機，恒溫搖床，分光光度計，超凈工作臺，恒溫培養(yǎng)箱，接種環(huán)。三角燒瓶、搖菌管、移液器吸頭和1.5mL微量離心管分別進行高壓滅菌。2試劑（1）LB培養(yǎng)基：胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaC

48、l 10g，加200mL dd water攪拌完全溶解，用約200mL5N NaOH調(diào)pH至7.0，加dd water至1L，121C20min滅菌。使用時可加入氨芐青霉素，終濃度100mg/mL。（2）氨芐青霉素儲存液：無菌水配制100mg/mL，每管200L分裝到0.5mL微量離心管中，-20C保存。（3）無菌dd water（4）100mg/mL（M/V）IPTG：無菌水配制，過濾除菌（5）20%葡萄糖：8磅滅菌20分鐘。使用時添加至LB中，終濃度為0.2%3材料 pET-Trx-NK重組載體及空pET-Trx轉化的BL21（DE3）菌株，對照BL21（DE3）菌株【實驗方法】1.在超凈

49、工作臺中接種含有pET-Trx-NK重組載體的BL21（DE3）菌、BL21（DE3）空菌、空pET-Trx轉化的BL21（DE3）菌，培養(yǎng)于1.5mL LB-葡萄糖培養(yǎng)基（含抗菌素Amp 120g/mL）的搖菌管中，37C搖菌至OD600=0.5，此為關鍵）。2.按下列組合用IPTG進行誘導表達：BL21（DE3）空菌不加IPTGpET-Trx轉化的BL21（DE3）菌 加IPTG至100mg/mLpET-Trx-NK轉化的BL21（DE3）菌加IPTG至100mg/mL3.150170r/min37C搖菌1.53h。4.10004000r/min離心15min，棄掉上清液，收獲菌體。5.菌

50、體可以進行SDSPAGE電泳分析（見實驗十一），也可放在-20C保存?zhèn)溆谩?.在被細菌污染的桌面上噴灑70%乙醇，擦干桌面，寫實驗記錄。【思考題】1.IPTG的作用原理是什么？2.為什么要增加抗菌素的用量？實驗十一SDS檢測表達蛋白【實驗目的】學習SDS膠的基本灌制方法和用SDS檢測表達蛋白?！緦嶒炘怼康鞍踪|(zhì)在加熱變性以后與SDS結合，帶上負電荷，在電場的作用下，向正極移動，結果按分子量大小排列在膠板的不同位置上，經(jīng)考馬斯亮蘭染色后可觀察到蛋白質(zhì)帶。含量多的蛋白帶紋粗含量少的帶細。根據(jù)目的基因在載體上從起始密碼至終止密碼的編碼堿基數(shù)目估計表達產(chǎn)物的分子量（1kb DNA約相當于3.7104道

51、爾頓蛋白質(zhì)）?！緦嶒炗闷贰?器材旋渦混合器，微量移液取樣器，雙面微量離心管架，臺式離心機，制冰機，超聲波破碎儀，電磁爐，電泳儀，垂直電泳槽及配套的玻璃板、夾子、密封條、梳子等，pH計，電磁爐，帶蓋的搪瓷盤。移液器吸頭和1.5mL微量離心管分別進行高壓滅菌。2試劑（1）1.0mol/L Tris HCl pH8.8：稱取12.1gTris堿,加50mL蒸餾水，緩慢地加濃鹽酸至pH8.8（約加8mL）。讓溶液冷卻至室溫，pH將會升高，然后再調(diào)至pH8.8，加蒸餾水至100mL。高溫高壓滅菌后4C保存（2）0.5mol/L Tris HCl pH6.8：稱取6.05gTris堿溶于40mL蒸餾水中，

52、加約48mL 1mol/L HCl，讓溶液冷卻至室溫，再用HCl調(diào)至pH6.8，加水稀釋到100mL終體積。高溫高壓滅菌后4C保存（3）10%SDS：蒸餾水配制，室溫保存（4）30% Acr（丙烯酰胺）/Bis（N,N-亞甲基雙丙烯酰胺）：30gAcr+0.8g Bis，用dd water定容至100mL，4C棕色瓶避光保存，可用一個月（5）10%Aps（過硫酸氨）：蒸餾水配制，-20C保存。過硫酸銨會緩慢分解，一周內(nèi)使用完。（6）2上樣緩沖液：0.5mol/L Tris HCl，pH6.8 2mL，甘油2mL，20%SDS 2mL，0.1%溴酚藍0.5mL，b-2-巰基乙醇1.0mL，dd

53、water 2.5mL，室溫存放（7）5電泳緩沖液：Tris 7.5g，甘氨酸36g，SDS 2.5g，加dd water至500mL。使用時稀釋5倍（8）TEMED（(N,N,NN-四甲基乙二胺）（9）低分子量蛋白分子量Marker：97.4，66.2，43，31，20.1，14.4 kDa（10）考馬斯亮藍R250染色液：考馬斯亮藍R250 0.25g + 45mL甲醇+10mL冰醋酸，用dd water定容至100mL（11）脫色液：95%乙醇/冰醋酸/水= 4.5/0.5/5（體積比）3材料IPTG誘導表達的菌體?！緦嶒灧椒ā?.將表達后的菌體與2上樣緩沖液按1：1混勻于微量離心管中。2.（此步可省略）用超聲波破碎儀脈沖10次，每次10秒。中間間隔時放入冰中降溫。注意一定要將超聲波探頭插入容液底部，在溶液表面或上部時容易起泡！3.將上述微量離心管用封口膜封住管蓋，插入水漂中，放在電磁爐鍋里的沸水中煮35min。然后立即插入冰中