基因甲基化給研究生講課2課件

1、表觀遺傳學(xué)從根本上講，表觀遺傳是環(huán)境因素和細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)之間發(fā)生交互作用的結(jié)果。 與中心法則不同，表觀遺傳學(xué)認(rèn)為遺傳信息并非單方向傳遞，環(huán)境因素也能改變遺傳物質(zhì)。目前表觀遺傳學(xué)研究主要集中在甲基化、組蛋白修飾、小RNA 和 染色質(zhì)重塑等方面。騾和駃騠前者又稱馬騾，是公驢與母馬雜交的后代，體大、耳小而尾部蓬松; 后者又叫驢騾，是公馬與母驢雜交的后代，相對(duì)來(lái)說體小、耳大而尾毛較少。這個(gè)現(xiàn)象表明，來(lái)源于不同性別親本的遺傳物質(zhì)在后代表達(dá)的功能可以有差別。這就是基因印記?；蛴∮?Hinny 駃騠Mule 類胰島素生長(zhǎng)因子-2 基因Igf2( 位于7 號(hào)染色體) 在小鼠身體里是否表達(dá)，要看它是否是受之

2、于父親，因?yàn)閬?lái)自母親的基因拷貝是處于失活性狀態(tài)的。這就是說，該基因是被母親所印記的。相反，17 號(hào)染色體上的Igf2r是被父親所印記的，被特別關(guān)注。因?yàn)閬?lái)自父親的Igf2r是處于失活性狀態(tài)的，它只有受之于母親才在體內(nèi)表達(dá)。類胰島素生長(zhǎng)因子親代印記的結(jié)果是，被印記的基因所表現(xiàn)的形式好像半合子的情況，盡管在每一個(gè)細(xì)胞中這種體細(xì)胞基因均成對(duì)存在。分子水平的分析發(fā)現(xiàn)，DNA 序列并沒有發(fā)生改變。那么，功能與性狀的變化因何而起?X染色體失活X 連鎖的O基因控制黃色毛性狀，其等位基因o控制黑色毛性狀，另有常染色體基因S 控制白色性狀。在雜合子貓XOXo，一些細(xì)胞團(tuán)產(chǎn)生黃毛 、一些細(xì)胞團(tuán)產(chǎn)生黑毛，在白色背景

3、下構(gòu)成3 色皮毛?，F(xiàn)象與猜想基因一定受到了某種修飾，這種修飾效應(yīng)能夠通過有絲分裂和減數(shù)分裂實(shí)現(xiàn)代間傳遞。甲基化的發(fā)現(xiàn) 1979 年 Mc Ghee 等發(fā)現(xiàn)與雞珠蛋白基因比鄰的胞嘧啶核苷酸甲基化后，該基因轉(zhuǎn)錄受抑制的現(xiàn)象。IPALTRLTRPhenotype diversity contributed by dynamics of epigenotypeWTIPALTRLTRAgouti別小看一個(gè)小小的修飾，卻給DNA增加了額外的信息，使得有限的基因組遺傳信息的表現(xiàn)呈現(xiàn)出豐富的多樣性和可塑性。 簡(jiǎn)單地把DNA甲基化理解為“一把鎖”，凡是被DNA甲基化標(biāo)記的部分，大都是需要被“塵封”“監(jiān)禁”的基因

4、，比如基因組的“搗蛋鬼”轉(zhuǎn)座子，就是被甲基化這把“鎖”管制著，失去管制或管制不嚴(yán)，這些“搗蛋鬼”會(huì)在基因組里跳來(lái)跳去，把基因組搞得一團(tuán)糟，會(huì)引起很多問題，如腫瘤、精神疾病等。CpG CpG表示核苷酸對(duì)，其中G在DNA鏈中緊隨C后?；蚪M中60%90% 的CpG 都被甲基化, 未甲基化的CpG 成簇地組成CpG 島, 位于結(jié)構(gòu)基因啟動(dòng)子的核心序列和轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)?；蚪M甲基化的特點(diǎn)：可逆性許多甲基化位點(diǎn)可以根據(jù)細(xì)胞活性的要求重新甲基化或去甲基化；組織特異性不同的組織細(xì)胞具有不同的甲基化模式，為基因表達(dá)設(shè)定程序。異常的甲基化可分為高甲基化和低甲基化 ，前者指正常組織中不發(fā)生甲基化的位點(diǎn)被甲基化 ，后者

5、是指在正常組織中發(fā)生甲基化的位點(diǎn)去甲基化。突變熱點(diǎn)：5-mC胞嘧啶發(fā)生脫氨基作用,就可能被氧化成為U,被DNA修復(fù)系統(tǒng)所識(shí)別和切除,恢復(fù)成C.已經(jīng)甲基化的胞嘧啶發(fā)生脫氨基作用, 它就變?yōu)門, 無(wú)法被區(qū)分.可能導(dǎo)致基因置換突變, 發(fā)生堿基錯(cuò)配: T-G, 如果在細(xì)胞分裂過程中不被糾正,就會(huì)誘發(fā)遺傳病或癌癥。 DNA甲基化的相關(guān)蛋白從頭甲基化酶Dnmt3a 在未分化的胚胎干細(xì)胞中高度表達(dá)，在體細(xì)胞中表達(dá)水平很低。主要作用是從頭甲基化，負(fù)責(zé)重復(fù)序列的甲基化。Dnmt3b維持DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶Dnmt1MET1 與繁殖細(xì)胞核酸抗原(PCNA)、組蛋白脫乙酰酶2(HDAC2)和一個(gè)新的蛋白質(zhì)DNAP1(

6、DNMT1相關(guān)蛋白)組成復(fù)合體，維持CG序列的甲基化。CMT 僅發(fā)現(xiàn)在植物中，其催化區(qū)l和包埋染色體的主區(qū)，并且特異性地維持CG序列的甲基化。去甲基化酶5一甲基胞嘧啶糖基化酶、MBD25一甲基胞嘧啶糖基化酶是體內(nèi)候選去甲基化酶。甲基化酶一般按甲基化的方式將甲基化酶（DNA methytransferase，DNMT）分為2類：一種是維持型甲基轉(zhuǎn)移酶，需以半甲基化的雙鏈 DNA 為模板，指導(dǎo)新合成的鏈甲基化；一種是全新甲基化酶，不依賴半甲基化 DNA 分子中的甲基化模板而從新開始合成5mC哺乳動(dòng)物細(xì)胞中已知有活性的 DNMT 有 3 種 ，它們是 DNMT1 、DNMT3a 、DNMT3b 。D

7、NMT1 的主要功能是作為 DNA 復(fù)制復(fù)合物(DNA synthesome) 中的組分 ，催化子鏈 DNA 半甲基化位點(diǎn)甲基化 ，維持復(fù)制過程中甲基化位點(diǎn)的遺傳穩(wěn)定性；DNMT3a 和 DNMT3b 主要催化從頭甲基化 ，以非甲基化的 DNA 為模板 ，催化新的甲基化位點(diǎn)形成 ，在胚胎發(fā)育中起重要作用。甲基化酶CpG島的形成雖然人類基因組上有的 CpG 島處于甲基化狀態(tài)，但是大部分 CpG 島是不易被甲基化的，這同基因組上約 80%的 CpG 雙核苷酸處于甲基化狀態(tài)的現(xiàn)象形成鮮明對(duì)比。該現(xiàn)象促使人們思考為什么CpG 島不易被甲基化。去甲基化酶哺乳動(dòng)物體內(nèi)可能存在去甲基化的酶，這種酶可能為一種

8、糖基化酶、核酸內(nèi)切酶或真正的去甲基化酶。近2年來(lái)，對(duì)去甲基化酶的研究有所突破。一般認(rèn)為，DNA 甲基化有兩種方式：一種是主動(dòng)去甲基化 ；另一種是復(fù)制相關(guān)的 DNA 去甲基化 DNA甲基化與腫瘤腫瘤細(xì)胞的特征： 癌基因低甲基化 被激活； 抑癌基因高甲基化 被沉默 腫瘤中普遍存在DNA甲基化狀態(tài)的改變，其特點(diǎn)是總體的甲基化水平降低與局部的甲基化水平升高。 低甲基化可誘導(dǎo)原癌基因和轉(zhuǎn)座子成分活化，基因印跡缺失以及染色體不穩(wěn)定性增加，最終誘發(fā)腫瘤 在整體低甲基化的水平下，某些抑癌基因發(fā)生高甲基化，導(dǎo)致基因沉默，對(duì)腫瘤抑制能力低下甲基化水平與腫瘤生物學(xué)特性密切相關(guān)，DNA甲基化水平越低，染色體越容易發(fā)生

9、功能異常，腫瘤的浸潤(rùn)能力就越高，臨床分期也愈晚腫瘤的去甲基化治療 DNA甲基化程度依賴于DNMT活性。正常甲基化模式的建立需要DNMT1和DNMT3的共同作用， DNMT1是DNMT3啟動(dòng)CpG核苷酸從頭甲基化的保證，而DNMT3則使甲基化水平穩(wěn)定在正常需要水平（去甲基化） 抑制DNMT活性藥物是治療腫瘤的新希望 胞苷類似物通過共價(jià)鍵與DNMT形成不可逆的復(fù)合物從而競(jìng)爭(zhēng)性抑制其活性,使DNA甲基化隨細(xì)胞分裂進(jìn)行性丟失,部分地逆轉(zhuǎn)腫瘤的惡性表型。中國(guó)測(cè)序論壇甲基化的檢測(cè)方法高效液相色譜法組織DNA提取(酚-氯仿法)DNA的水解 取相當(dāng)于50微克DNA的溶液用40%的氫氟酸溶解,調(diào)整DNA濃度為1

10、g/L。100C水浴3 h使DNA水解完全。氮?dú)獯蹈蓚溆?。上樣前將處理好的DNA樣品加入200 微升新鮮配制的0.05 moL/L磷酸二氫鉀溶液溶解。一、甲基化分型 絕大多數(shù)的DNA 甲基化分型均基于聚合酶鏈反應(yīng)( PCR )的方法, 使用亞硫酸氫鈉處理過的DNA 作為模板。PCR 引物設(shè)計(jì)上通常存在2 種策略: 甲基化非依賴性PCR( methy lationindependent PCR, M IP)引物: 甲基化特異性PCR ( m ethylat ion specific PCR, MSP)引物。 （1） 甲基化特異性PCR (m ethylat ion2specif ic PCR,M

11、 S PCR ) 該法是檢測(cè)基因組DNA 甲基化水平的一種常用方法, 原理是DNA 經(jīng)亞硫酸氫鈉處理后, 非甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏? 而甲基化的胞嘧啶保持不變。在PCR 反應(yīng)時(shí), 有兩套不同的引物對(duì): 其一引物序列來(lái)自經(jīng)處理后的甲基化DNA 鏈, 若用該對(duì)引物能擴(kuò)增出片段, 說明該檢測(cè)位點(diǎn)發(fā)生了甲基化; 另一引物來(lái)自經(jīng)處理后的非甲基化DNA 鏈, 若用該對(duì)引物能擴(kuò)增出片段, 說明該檢測(cè)位點(diǎn)沒有甲基化。 兩對(duì)引物都具有很高的特異性, 與未經(jīng)處理的DNA 序列無(wú)互補(bǔ)配對(duì)。 M S PCR 是一種快速檢測(cè)方法, 只需極少量的DNA 用于分析。 不足之處在于: 引物的選擇和設(shè)計(jì)非常關(guān)鍵, 否則易導(dǎo)致假陽(yáng)性; 如果亞硫酸氫鈉對(duì)DNA 處理不完全, 也易導(dǎo)致假陽(yáng)性; M SP 法是以引物中所有CpG 位點(diǎn)胞嘧啶均甲基化為前提設(shè)計(jì)的, 而事實(shí)上甲基化的CpG 島中卻并非每個(gè)CpG 位點(diǎn)都完全甲基化, 所以,M SP 法常常存在目標(biāo)片段難擴(kuò)增, 或者特異性差等問題, 不能反映整個(gè)CpG 島甲基化狀態(tài)的缺陷。中國(guó)科學(xué)院化學(xué)研究所與清華大學(xué)的研究人員合作, 發(fā)展了基于水溶性陽(yáng)離子型共軛聚合物的新DNA 甲基化分析方法. 通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)(FR