雙黃連口服液化學(xué)成分含量測定及指紋圖譜研究

1、 雙黃連口服液化學(xué)成分含量測定及指紋圖譜研究 馮宏玲+黃森+李穆睿+張慧+于思慧+韓麗【Summary】目的：測定雙黃連口服液化學(xué)成分含量，建立化學(xué)成分指紋圖譜的研究，為雙黃連口服液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供理論依據(jù)。方法：采用高效液相色譜法，Agilent C18色譜柱（250mm46mm，5m），流動相為甲醇（A）-025%冰乙酸（B），流速為10mL/min；柱溫為30；進(jìn)樣體積為10L。結(jié)果：測定雙黃連口服液中化學(xué)成分含量并建立了指紋圖譜，標(biāo)定12個共有峰，以9號峰（即黃芩苷）為參照。方法學(xué)考察符合規(guī)定，RSD均小于30%。結(jié)論：建立了以黃芩苷、連翹苷和綠原酸為參照物，測定不同廠家的雙黃連口服液

2、的含量及化學(xué)指紋圖譜方法，結(jié)果顯示不同廠家制劑的指紋圖譜存在差異性，此方法簡便，重現(xiàn)性好，精密度高，可以為雙黃連口服液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供一定的依據(jù)?！綤ey】雙黃連口服液；高效液相色譜法；含量測定；指紋圖譜R284【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A1007-8517（2017）05-0017-06雙黃連口服液是臨床抗菌抗病毒常用藥，由金銀花、黃芩和連翹三味中藥提取精制而成，具有抑菌1、抗病毒2-3、解熱抗炎4的作用，用于治療外感風(fēng)熱所致的感冒，癥見發(fā)熱頭痛、咳嗽及咽痛等。此三味中藥主要成分為綠原酸、黃芩苷以及連翹苷，綠原酸具有抗菌、抗病毒、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等作用5，黃芩苷具有抗菌抗病毒、解熱鎮(zhèn)痛抗炎、清除氧自由基等作

3、用6，連翹苷具有抗菌抗病毒、抗炎、保肝等作用7，這三種化合物是雙黃連口服液中主要活性及藥效成分。目前用高效液相色譜法來測定雙黃連口服液中的有效成分是主要的檢測方式8-10，且指紋圖譜是國內(nèi)外公認(rèn)的鑒別中藥品種和評價(jià)中藥質(zhì)量的非常有效的手段。因此有必要對不同廠家及批次的制劑中這三種成分的含量及指紋圖譜進(jìn)行研究，為此建立了本文的研究方案，可能會對控制藥品質(zhì)量、保證人民用藥的安全有效起到積極的作用。1儀器與材料11儀器Agilent 1200高效液相色譜儀（包括四元泵，DAD 檢測器，柱溫箱，工作站，安捷倫科技有限公司）；AR2140型電子分析天平（上海奧豪斯公司）；METTLER AB135-S十

4、萬分之一電子天平（瑞士）；超聲提取儀（240W，50-60Hz，上海必能超聲儀器公司）。12材料連翹苷（批號：110821-201213）、綠原酸（批號：110753-201314）、黃芩苷（批號：110715-201117）等對照品購自中國食品藥品檢定研究院。純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司），甲醇等試劑均為色譜純。藥品見表1。2化學(xué)成分含量測定雙黃連口服液是由金銀花、黃芩、連翹三種藥材制成的中藥制劑，金銀花中有效成分主要為綠原酸、黃芩中有效成分主要為黃芩苷、連翹中有效成分主要為連翹苷，中國藥典也以這三種成分作為指標(biāo)性成分11，以3種成分為指標(biāo)，建立了雙黃連口服液的含量測定方法。21色譜條件梯

5、度洗脫：08min，A（15%30%）-B（85%70%）；815min，A（30%35%）-B（70%65%）；1520min，A（35%53%）-B（65%47%）；2045min，A（53%63%）-B（47%37%）；4565min，A（63%100%）-B（37%0%）；檢測波長：280nm。22對照品溶液制備分別精密稱取綠原酸、連翹苷、黃芩苷對照品，用50%甲醇制成01822、0053、118mg/mL的混合對照品溶液，045m微孔濾膜濾過，即得。23供試品溶液制備分別取10支雙黃連口服液的等量內(nèi)容物混合，精密量取05mL，置于10mL量瓶中，加入50%甲醇定容，搖勻，045m微孔

6、濾膜濾過，即得。24陰性對照溶液制備取除去金銀花、連翹、黃芩藥材，按雙黃連口服液制備工藝制備陰性藥品，按供試品溶液制備方法操作，制成缺失金銀花、連翹、黃芩的陰性對照溶液，備用。25方法學(xué)考察251專屬性試驗(yàn)取金銀花、連翹、黃芩的陰性對照溶液、對照品溶液、供試品溶液分別注入液相色譜儀，測定色譜峰，結(jié)果顯示，金銀花、連翹、黃芩的陰性溶液色譜中在與供試品色譜中綠原酸、連翹苷、黃芩苷相同保留時間處，未見色譜峰，表明金銀花、連翹、黃芩的陰性溶液無干擾。結(jié)果見圖1、2、3。252線性關(guān)系考察精密量取上述混合對照品溶液2、4、8、10、14、16 L注入液相色譜儀，測定。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪

7、制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=18909X+63468，R=09997，線性范圍為236g1888g。精密量取上述混合對照品溶液5、75、10、15、20 L注入液相色譜儀，測定。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=12898X+19970，R=09998，線性范圍為0911g3644g。連翹苷標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=12152X+52111，R=09997，線性范圍為053106g。253中間精密度試驗(yàn)由3個不同實(shí)驗(yàn)人員，分別在3天，取雙黃連口服液（S-2），精密量取5mL，按“23” 項(xiàng)下制備供試品溶液，按“21”項(xiàng)下色譜條件，每人

8、重復(fù)測定2次，計(jì)算含量。結(jié)果顯示，RSD小于15%，表明中間精密度良好。254穩(wěn)定性試驗(yàn)取雙黃連口服液（S-2），按“23” 項(xiàng)下制備供試品溶液，按“21”項(xiàng)下色譜條件分別在提取后 0、2、4、6、8、10h取樣，分別注入色譜儀，測定色譜峰面積。結(jié)果表明，供試品溶液在配制完成后的10h內(nèi)色譜峰面積無明顯變化，表明在10h內(nèi)供試液溶液穩(wěn)定。255重復(fù)性試驗(yàn)取雙黃連口服液（S-2）6份，按“23” 項(xiàng)下制備供試品溶液，按“21”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測定色譜峰面積，計(jì)算含量，RSD小于3%，結(jié)果顯示，6次測定結(jié)果的重復(fù)性良好。 256準(zhǔn)確度試驗(yàn)精密量取6份已知含量的雙黃連口服液（S-2）025mL

9、，置10mL量瓶中，分別精密加入黃芩苷（118mg/mL）5mL、綠原酸（01822mg/mL）5mL和連翹苷（0053mg/mL） 5ml對照品溶液，按供試品溶液的制備方法制備，注入色譜儀，測定峰面積，計(jì)算回收率。結(jié)果顯示，3個成分的含量的回收率均在95%105%之間。27含量測定按“24”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)行測定，采用外標(biāo)法計(jì)算含量。11個不同廠家雙黃連口服液含量測定結(jié)果有一定差異，其黃芩苷含量在1505534614mg/mL范圍內(nèi)，連翹苷在05892072mg/mL范圍內(nèi)，綠原酸在06945781mg/mL范圍內(nèi)，均滿足中國藥典2015版一部的含量限度要求，其中S

10、-7（匯利）3種成分的總量最低。結(jié)果見表2。3雙黃連口服液指紋圖譜的建立31供試品溶液制備分別取10支雙黃連口服液的等量內(nèi)容物混合，精密量取05mL，置于10mL量瓶中，加入50%甲醇定容，搖勻，045m微孔濾膜濾過，即得。32參照物溶液制備分別精密稱取黃芩苷1401mg、綠原酸424mg、連翹苷503mg，置于10mL量瓶中，加入50%甲醇定容，搖勻，分別制得黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液1401mg/mL、綠原酸0424g/mL、連翹苷0503mg/mL。33陰性溶液的制備取除去雙黃連口服液，按供試品溶液制備方法操作，制備陰性對照溶液，備用。34色譜條件色譜柱：Agilent C18色譜柱（250mm4

11、6mm，5m）；流動相：甲醇（A）-025%冰乙酸（B）；梯度洗脫：08min，A（15%30%）-B（85%70%）；815min，A（30%33%）-B（70 %67 %）；1520min，A（33%40%）-B（67%60%）；2040min，A（40%43%）-B（60%57%）；4050min，A（43%47%）-B（57%53%）；5070min，A（47%100%）-B（53%0%）。流速：10mL/min；柱溫：30；進(jìn)樣體積： 10L；檢測波長：278nm。35參照物的確定通過測定11批不同廠家的雙黃連口服液供試品，制劑的色譜峰均在70min之內(nèi)出現(xiàn)，由于對照品黃芩苷、綠原酸

12、、連翹苷為已知成分，且11批制劑中均存在，因此選擇這3個峰作為雙黃連口服液的參照峰。參照色譜圖見圖4。36共有指紋峰的標(biāo)定分別測定陰性溶液與供試品溶液，并且進(jìn)行比較，排除陰性干擾峰，以黃芩苷、綠原酸、連翹苷為參照物，選擇11個廠家雙黃連口服液指紋圖譜中保留時間與參照物相對比的相對保留時間一致的峰做為共有指紋峰，在中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)中導(dǎo)入11批不同廠家雙黃連口服液的指紋圖譜，對保留時間進(jìn)行相似度評價(jià)。結(jié)果顯示，最終確定共有指紋峰12個，相似度均大于099，經(jīng)計(jì)算，每個廠家供試品溶液中色譜圖中的共有峰的峰面積之和大于90%，符合共有峰標(biāo)定要求，共有峰色譜圖見圖5、6、7，相似度評價(jià)見表

13、3。結(jié)果顯示不同廠家制劑的指紋圖譜存在差異性。37方法學(xué)考察371精密度試驗(yàn)取供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，考察共有峰相對保留時間和相對峰面積的值。結(jié)果表明，各共有峰的相對保留時間和相對峰面積RSD均小于3%，符合指紋圖譜分析要求。在中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)中導(dǎo)入色譜圖，得到6個圖譜的相似度。結(jié)果表明，圖譜的相似度均大于096，符合指紋圖譜分析要求，表明精密度良好。372穩(wěn)定性試驗(yàn)取雙黃連口服液，按供試品溶液制備方法制備，分別在0、2、4、6、8、10h進(jìn)樣，考察共有峰相對保留時間和相對峰面積的值。結(jié)果，各個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3%，符合指紋圖譜分析要求。在中藥色譜指

14、紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)中導(dǎo)入色譜圖，得到圖譜相似度。結(jié)果表明，10h內(nèi)圖譜相似度均大于096，符合指紋圖譜分析要求，表明穩(wěn)定性良好。373重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取同一批號雙黃連口服液6份，按供試品溶液制備方法處理，分別注入色譜儀，考察共有峰相對保留時間和相對峰面積的值。結(jié)果，各共有峰相對保留時間和相對峰面積RSD均小于3%，符合指紋圖譜分析要求。在中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)中導(dǎo)入色譜圖，得到圖譜相似度。結(jié)果表明，圖譜的相似度均大于097，符合指紋圖譜分析要求，表明重復(fù)性良好。4討論41分別以乙腈-水、甲醇-水等不同比例的流動相系統(tǒng)進(jìn)行等度和梯度洗脫試驗(yàn)。結(jié)果表明，用甲醇-025%冰乙酸水溶液進(jìn)行梯度洗脫

15、可同時將三個有效成分黃芩苷、連翹苷、綠原酸在同一個色譜條件下分開，且分離度較好，為此選用文中流動相。42本法對雙黃連口服液中3種成分同時測定，解決了中國藥典中采用3個色譜條件分別測定黃芩苷、連翹苷、綠原酸含量的方法的繁瑣性，操作簡便，提高了雙黃連口服液含量測定效率。43建立了雙黃連口服液指紋圖譜，標(biāo)定了12個共有峰，以9號峰（即黃芩苷）為參照，共有峰的相對保留時間分別為：1號（0200），2號（0220），3號（0287），4號（0358），5號（0447），6號（0554），7號（0713），8號（0859），9號（1000），10號（1285），11號（1321），12號（1465），方法

16、學(xué)考察符合規(guī)定，RSD均小于30%；以3號峰（即綠原酸）為參照，共有峰的相對保留時間分別為：1號（0692），2號（0760），3號（1），4號（1233），5號（1558），6號（1910），7號（2481），8號（2962），9號（3463），10號（4432），11號（4536），12號（5058），方法學(xué)考察符合規(guī)定，RSD均小于30%。以8號峰（即連翹苷）為參照，共有峰的相對保留時間分別為：1號（0234），2號（0257），3號（0338），4號（0416），5號（0526），6號（0645），7號（0837），8號（1），9號（1169），10號（1496），11號（1531），

17、12號（1707），方法學(xué)考察符合規(guī)定，RSD均小于30%。證明此方法可行。44從11批不同廠家雙黃連口服液指紋圖譜相似度結(jié)果可以看出，不同廠家的雙黃連口服液特征圖譜相似度較高。但是，各共有特征峰相對峰面積存在差異，說明不同廠家雙黃連口服液之間存在質(zhì)量差異。Reference1徐海瑛，王樹芳，王麗， 等. 雙黃連口服液聯(lián)合慶大霉素的體外抗菌作用研究 J. 醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2013，32 （1）：19-22.2 周雪夢，陸春妮，亓文寶，等. 清開靈和雙黃連口服液體內(nèi)抗禽流感病毒作用 J. 中草藥，2011，42（7）：1351-1355.3 吳成林，楊占秋，侯煒，等. 雙黃連口服液抗呼吸道合胞病毒的實(shí)驗(yàn)研究J. 數(shù)理醫(yī)藥學(xué)，2005，18（6）：592-594.4 鄒忠杰，龔夢鵑，王淑美，等. 雙黃連口服液抗炎作用的代謝組學(xué)研究 J. 中成藥，2013，35（1）：19.5 劉穎，郭明曄，白根本. 綠原酸的研究進(jìn)展J. 中藥材，2012，37（7）：1182-1183.6 辛文妤，宋俊科，何國榮，等. 黃芩素和黃芩苷的藥理作用及機(jī)制研究進(jìn)展J. 中國新藥，2013，22（6）： 647-652.7 魏晉寶，楊光義，陳歡，等. 連翹苷的提取方法、藥理毒理及藥動學(xué)研究進(jìn)展 J. 中國藥師，2015，18（12）： 2146.8