基于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析茉莉酸與果梅休眠的關(guān)系-第1篇

1、 基于液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法分析茉莉酸與果梅休眠的關(guān)系 韓馳仲文君高志紅霍希美李百健莊維兵倪照君Summary：建立了不同果梅（Prunus mumeSieb.etZuee）品種4個(gè)休眠時(shí)期花芽的茉莉酸（jasnlonieacid）含量的液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜（1iquidchrom atography-tandemtriplequadrupolemassspeetronletrie，LC-MS/MS）測(cè)定方法。樣品經(jīng)過(guò)甲醇提取，Agela CleanertSPE-NH2固相萃取小柱凈化。色譜分離采用c、。反相柱，以乙腈一水（水相含0.05%乙酸）為流動(dòng)相梯度洗脫，質(zhì)譜分析采用ESI離子源、二級(jí)串聯(lián)質(zhì)

2、譜、負(fù)離子模式下進(jìn)行檢測(cè)。測(cè)定結(jié)果，方法標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，茉莉酸r=0.9992，平均回收率范圍為78.18%97.49%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，n=3）為1.25%8.27%。該方法操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，選擇性好，回收率高，適合果梅花芽中茉莉酸的測(cè)定。結(jié)果表明，被測(cè)2個(gè)品種的果梅花芽中，休眠解除和生態(tài)休眠時(shí)期的茉莉酸含量高于內(nèi)休眠和抑制性休眠時(shí)期，推測(cè)內(nèi)源激素茉莉酸可能有抑制果梅休眠和促進(jìn)花芽正常生長(zhǎng)的作用。本試驗(yàn)對(duì)進(jìn)一步探討果梅休眠與內(nèi)源激素茉莉酸的關(guān)系打下了一定的基礎(chǔ)。Key：液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜；果梅；休眠；茉莉酸：O657.63 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ：1002-1302（2015）05-01

3、67-04季節(jié)性休眠包括抑制性休眠、內(nèi)休眠和生態(tài)休眠3種類(lèi)型，其中內(nèi)休眠又稱(chēng)為自然休眠。果樹(shù)在休眠過(guò)程中受到環(huán)境因素尤其是光周期和溫度的影響啟動(dòng)了一系列的生理生化反應(yīng)，涉及到植物激素、信號(hào)物質(zhì)和多基因的表達(dá)和調(diào)控。芽的休眠由內(nèi)源激素控制，休眠的起始、終止均受激素調(diào)節(jié)，環(huán)境因素（外部信號(hào)）也通過(guò)影響激素（內(nèi)部信號(hào)）的合成和運(yùn)輸來(lái)影響休眠進(jìn)程而改變低溫需求量。通常認(rèn)為，休眠是由內(nèi)源激素赤霉素、脫落酸、生長(zhǎng)素和乙烯中的促進(jìn)生長(zhǎng)物質(zhì)和抑制生長(zhǎng)物質(zhì)之間平衡狀態(tài)決定。近期研究報(bào)道植物休眠與生長(zhǎng)過(guò)程中也相繼發(fā)現(xiàn)了與茉莉酸代謝相關(guān)的基因。茉莉酸類(lèi)化合物在植物中具有多方面調(diào)節(jié)功能：（1）信號(hào)傳導(dǎo)作用。如在植物創(chuàng)

4、傷、脅迫、病蟲(chóng)害過(guò)程中，茉莉酸作為一種信號(hào)物質(zhì)在植物體內(nèi)傳遞生物或非生物脅迫的信號(hào)。（2）生理作用。如調(diào)節(jié)呼吸作用、花粉的發(fā)育、乙烯生物合成、果實(shí)的成熟、植物的光合作用和色素的形成、植物根系和植抹的生長(zhǎng)，以及植物次生代謝的調(diào)節(jié)等。（3）基因的調(diào)控作用。如茉莉酸生物合成和茉莉酸信號(hào)通路相關(guān)的AOS、AOC、OPR3、JMT、LOX2，以及JAZs、COH、MYC2等基因都可能受茉莉酸的調(diào)控。液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)作為一種新型的現(xiàn)代儀器分析手段，因其高靈敏性、高準(zhǔn)確性、高選擇性、分析檢測(cè)范圍寬、時(shí)間短以及定性定量方面的強(qiáng)大功能等特點(diǎn)，在分析檢測(cè)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。本研究通過(guò)液質(zhì)聯(lián)用方法來(lái)測(cè)定果梅不同休眠時(shí)

5、期花芽?jī)?nèi)的茉莉酸含量，以期明確果梅休眠與內(nèi)源激素茉莉酸的關(guān)系。1.材料與方法1.1儀器與試劑安捷倫1260液相色譜一（6530系列三級(jí)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀、Eppendorf/Centrifuge5810R冷凍離心機(jī)、真空冷凍干燥機(jī)（中國(guó)北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司生產(chǎn)）、氮吹儀（美國(guó)OrganomationAssociates公司生產(chǎn)）、高能量磨樣儀等。二氫茉莉酸（dihydrojasmonicacid）購(gòu)于TCI公司，茉莉酸購(gòu)于Sigma公司，均為色譜級(jí)，產(chǎn)品純度98%。甲醇、乙睛：色譜純，德國(guó)Merck公司產(chǎn)品，二氯甲烷（色譜級(jí)），乙酸（色譜級(jí)），市售純凈水（娃哈哈）。1.2試驗(yàn)材料供

6、試材料為果梅品種桃形梅、豐后，均采自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家果梅種質(zhì)資源圃。桃形梅為低需冷量的果梅品種，而豐后為高需冷量品種。分別采取不同果梅品種4個(gè)休眠時(shí)期的花芽，即抑制性休眠（A）、內(nèi)休眠（B）、生態(tài)休眠（c）、休眠解除（D）4個(gè)時(shí)期。每個(gè)品種的花芽分別采于3棵對(duì)應(yīng)品種的樹(shù)上。采樣日期的確定根據(jù)不同品種的需冷量和各自物候特征決定。在葉片脫落之前，花芽處于抑制性休眠階段；等待葉片脫落之后，剪取長(zhǎng)勢(shì)正常的枝條若干用5%蔗糖水放于光照培養(yǎng)箱中，測(cè)定萌發(fā)率。光照培養(yǎng)箱保持70%的相對(duì)濕度，溫度為（251），光一暗周期16h一8h。蔗糖溶液和新鮮的枝條每3d更換1次，當(dāng)芽尖端冒出綠色萼片時(shí)，即認(rèn)為萌發(fā)了。研

7、究結(jié)果，果梅花芽的萌發(fā)率與其需冷量呈正相關(guān)（r=0.9797）。光照培養(yǎng)箱中枝條的萌芽率小于50%時(shí)，此期間采取的花芽被認(rèn)為處于內(nèi)休眠階段；當(dāng)萌芽率大于50%時(shí)，則處于生態(tài)休眠階段。在大田中正常生長(zhǎng)的花芽萌發(fā)率達(dá)到50%時(shí)，此階段采取的花芽則處于休眠解除階段。1.3樣品處理1.3.1茉莉酸提取稱(chēng)取0.1g果梅花芽并加入400ng二氫茉莉酸作為內(nèi)標(biāo)物裝在2mL離心管中，樣品經(jīng)液氮冷凍磨成細(xì)粉末。用800bL80%冷甲醇提取3次，每次渦旋10min，412000r/min離心10min，收集上層液。氮吹濃縮蒸發(fā)至水相，用2mol/L的HCI調(diào)pH值至2.53.0。用等體積乙酸乙酯萃取3次，每次渦旋

8、10min，412000r/min離心10min，吸取上層有機(jī)相到同一管中，氮?dú)獯蹈桑M(jìn)一步純化。1.3.2純化提取步驟中的蒸干樣品用1mL二氯甲烷/甲醇（V：V=99：1）溶解淋洗離3次，并將同一重復(fù)的2份樣品溶解收集到同一管中。純化用Agela Cleanert SPENH2（500mg/6mL）固相萃取小柱。小柱用前用6mL二氯甲烷一甲醇（V：v=99：1）活化。全部6mL樣品上柱，棄去過(guò)柱廢液，用3ml二氯甲烷一甲醇（v：V=99：1）淋洗柱子，棄去淋洗液。用2%的乙酸甲醇溶液分3次洗脫，第1次用4mL，第2、第3次用3mL，用干凈的離心管收集洗脫液。洗脫液真空冷凍至干，用0.3mL

9、的0.05%乙酸水溶液一乙睛（V：V=80：20）溶解，再用0.22m微孔膜過(guò)濾，收集濾液-20條件下保存?zhèn)溆谩４郎y(cè)樣品分別標(biāo)號(hào)桃形梅A、桃形梅B、桃形梅c、桃形梅D、豐后A、豐后B、豐后c、豐后D，每個(gè)樣品設(shè)置3份重復(fù)。 1.4LC-MS條件1.4.1色譜條件色譜柱C18（2.150innl，1.8m，B型全多孔，安捷倫）；柱溫40qC；流動(dòng)相A1：O.1%甲酸水，流動(dòng)相B1：甲醇；流動(dòng)相A2：0.05%乙酸水，流動(dòng)相B2：乙睛。在已建立的質(zhì)譜條件下改變流動(dòng)相的配比和流速優(yōu)化目標(biāo)物分離的線性梯度洗脫程序。1.4.2質(zhì)譜條件對(duì)茉莉酸和二氫茉莉酸標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行質(zhì)譜掃描，確定其母離子與子離子。優(yōu)化毛細(xì)

10、管出口電壓、碰撞氣能量、干燥氣溫度、干燥氣流速、噴霧壓力等條件，確定其特征離子，選擇相對(duì)強(qiáng)度大、信號(hào)穩(wěn)定的碎片離子作為檢測(cè)離子。1.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制準(zhǔn)確配制0.75、1.25、2.50、5.00、10.00ng/L的茉莉酸標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，進(jìn)行儀器分析，以峰面積（_v）對(duì)濃度（x）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以保留時(shí)間、茉莉酸和二氫茉莉酸的母離子與子離子定性，以?xún)?nèi)標(biāo)法定量。2.結(jié)果與分析2.1色譜條件的建立色譜檢測(cè)時(shí)，最初5inn的洗脫液排入廢液池（防止對(duì)MS離子源帶來(lái)背景干擾和非揮發(fā)性的鹽污染質(zhì)譜儀）；流速0.4mL/min；檢測(cè)器DND，進(jìn)樣量為10L。因?yàn)榱鲃?dòng)相的組成對(duì)LC-MS/MS測(cè)定的信號(hào)強(qiáng)度會(huì)產(chǎn)生

11、很大的影響，我們對(duì)比了2種流動(dòng)相對(duì)于色譜行為的影響。結(jié)果表明，流動(dòng)相A2：0.05%乙酸水，流動(dòng)相B2：乙睛，出的峰更好，所以選擇了第2種流動(dòng)相為測(cè)定花芽中的茉莉酸含量。并且優(yōu)化了梯度洗脫程序（表1）。2.2質(zhì)譜條件的確定為了消除復(fù)雜基質(zhì)對(duì)檢測(cè)器靈敏度的影響，采用串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）技術(shù)，目標(biāo)物經(jīng)過(guò)液相色譜柱分離后，經(jīng)過(guò)一級(jí)質(zhì)譜對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量進(jìn)行篩選，電離后經(jīng)過(guò)二級(jí)質(zhì)譜對(duì)離子進(jìn)行篩選，從而提高了被分析物的信噪比，去除了共流出物的干擾，最大限度地排除雜質(zhì)背景，顯著提高實(shí)際樣品的靈敏度和定量分析的準(zhǔn)確性。質(zhì)譜條件見(jiàn)表2。2.3回歸方程及樣品的液相質(zhì)譜特征該方法所得茉莉酸的回

12、歸方程為y=44815.50 x+14125.83，r=0.9992，二氫茉莉酸的回歸方程為y=54299.44x+165045.08，r=0.9994，呈較好的線性關(guān)系。從圖1-a可見(jiàn)，茉莉酸的出峰時(shí)間為4.8min，其質(zhì)譜圖見(jiàn)圖1-b。從圖2-a可見(jiàn)，內(nèi)標(biāo)二氫茉莉酸的出峰時(shí)間為5.7min，其質(zhì)譜圖見(jiàn)圖2-b。2.4精密度與準(zhǔn)確度試驗(yàn)在桃形梅A、B、C、D和豐后A、B、C、D樣品中，分別加入茉莉酸標(biāo)樣10.0ng。按前述方法測(cè)定茉莉酸含量，重復(fù)3次，計(jì)算回收率結(jié)果見(jiàn)表3。從表3可以看出，該方法的平均回收率范圍為78.18%97.49%，RSD為1.25%8.27%。2.5樣品的測(cè)定運(yùn)用LC

13、-MS/MS法對(duì)2個(gè)品種不同休眠時(shí)期的花芽分別進(jìn)行檢測(cè)，茉莉酸含量結(jié)果分析見(jiàn)圖3、圖4。3.討論茉莉酸在植物界中普遍存在，廣泛分布于植物的幼嫩組織、花和發(fā)育的生殖器官中，通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育和應(yīng)激反應(yīng)。隨著研究的深入，茉莉酸的生物學(xué)作用越來(lái)越受關(guān)注。本研究通過(guò)測(cè)定不同品種果梅的花芽中茉莉酸的含量，初步探索果梅4個(gè)休眠時(shí)期與茉莉酸含量的內(nèi)在聯(lián)系。2個(gè)品種間，茉莉酸在抑制性休眠和內(nèi)休眠時(shí)期含量偏低，而在生態(tài)休眠期茉莉酸含量明顯高于內(nèi)休眠時(shí)期的。這一現(xiàn)象得出茉莉酸的合成在抑制性休眠和內(nèi)休眠時(shí)期被抑制，推測(cè)茉莉酸對(duì)果梅的休眠可能有抑制作用。茉莉酸與植物的發(fā)育密切相關(guān)，如種子的萌發(fā)和生長(zhǎng)、貯

14、藏蛋白的積累等。而生長(zhǎng)停止是植物進(jìn)入休眠的前提條件，也是多年生植物抵御冬季低溫的機(jī)制之一。所以在抑制性休眠和內(nèi)休眠時(shí)期，茉莉酸的含量偏低，則不利于植物的生長(zhǎng)與相關(guān)蛋白等的積累，但有利于植物休眠的順利進(jìn)行。生態(tài)休眠是植物休眠經(jīng)歷的第三個(gè)階段，它是由于外界不利的生長(zhǎng)條件而造成，如干旱或低溫等。一旦外界條件合適，植物可以很快恢復(fù)生長(zhǎng)，而內(nèi)休眠即使條件合適也不會(huì)恢復(fù)生長(zhǎng)，必須滿足其需冷量后才能在適宜條件下生長(zhǎng)。本試驗(yàn)中，供試的2個(gè)果梅品種花芽在生態(tài)休眠時(shí)期的茉莉酸含量比抑制性休眠和內(nèi)休眠時(shí)期有所增加。zhong等在數(shù)字基因表達(dá)譜研究中也發(fā)現(xiàn)茉莉酸相關(guān)基因在生態(tài)休眠期間的表達(dá)量高于內(nèi)休眠時(shí)期的。茉莉酸含

15、量的增大有利于花芽在生態(tài)休眠期間貯存蛋白積累，為促進(jìn)花芽萌發(fā)做準(zhǔn)備。在花的發(fā)育過(guò)程中，茉莉酸含量多少也與花粉育性有關(guān)。生態(tài)休眠期間，茉莉酸含量明顯增加另有一種解釋?zhuān)灿锌赡芘c果梅自身的防御系統(tǒng)相關(guān)。生態(tài)休眠本就是由于外界不利的生長(zhǎng)條件所造成，植物在遭遇不利環(huán)境因子脅迫時(shí)，自身增大了茉莉酸的合成量，加強(qiáng)了茉莉酸在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的信使作用，并誘導(dǎo)一系列植物防御基因的表達(dá)、防御反應(yīng)化學(xué)物質(zhì)的合成等，從而調(diào)節(jié)植物的免疫和應(yīng)激反應(yīng)。相關(guān)研究表明，茉莉酸合成途徑的激活對(duì)于應(yīng)激信號(hào)的傳遞和放大是必不可少的。從本試驗(yàn)結(jié)果可以看出，桃形梅和豐后花芽?jī)?nèi)的茉莉酸含量，在休眠解除時(shí)期明顯高于生態(tài)休眠時(shí)期。休眠解除，果樹(shù)正

16、常生長(zhǎng)，生理反應(yīng)開(kāi)始活躍，茉莉酸合成也大大增加。同時(shí)也說(shuō)明茉莉酸合成相關(guān)基因在前3個(gè)休眠時(shí)期可能被某種程度抑制了。相關(guān)報(bào)道指出，茉莉酸可以激活乙烯相關(guān)基因來(lái)調(diào)控休眠，乙烯合成在休眠期間也是被抑制的，表明茉莉酸在調(diào)控果梅休眠進(jìn)程上作用于乙烯存在著密切的關(guān)聯(lián)。這需要進(jìn)一步研究闡述。植物體內(nèi)的激素代謝途徑是相互交聯(lián)的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)?；?個(gè)果梅品種花芽的茉莉酸含量在生態(tài)休眠和休眠解除時(shí)期高于抑制性休眠和內(nèi)休眠時(shí)期，我們可以推測(cè)，茉莉酸含量增加是有利于芽的萌發(fā)與生長(zhǎng)，并促進(jìn)果梅花芽打破休眠。Rinne等在楊樹(shù)上研究表明，除了FT、CENLl等基因外，脂質(zhì)體相關(guān)的1，3-葡聚糖水解酶基因家族（GHl7）也參與了休眠調(diào)控，光周期、低溫、赤霉素3和赤霉素4均可上調(diào)該基因的表達(dá)，從而促進(jìn)FT和CENLl的表達(dá)，休眠芽停止休眠，重新恢復(fù)生長(zhǎng)。盡管GA3和GA4都可以促進(jìn)基因的表達(dá)，但只有GA4在實(shí)際中促進(jìn)休眠芽的萌發(fā)。本研究中，推測(cè)茉莉酸也可能具有GA4打破休眠的功能。Sasaki等通過(guò)基因芯片技術(shù)在擬南芥中發(fā)現(xiàn)，41個(gè)茉莉酸響應(yīng)的基因中有5個(gè)是茉莉酸合成途徑的基因，而JAs的合成途徑是屬于正反饋調(diào)控的。茉莉酸合成途徑基因的過(guò)量表達(dá)會(huì)促進(jìn)茉莉酸的合成，如番茄中AOC基因