微生物生理生化實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、實(shí)驗(yàn)十IMViC與硫化氫試驗(yàn)指導(dǎo)教師：李?；ㄖ芰谌M學(xué)號(hào)：060122010041姓名：宋天佳專(zhuān)業(yè)：2010級(jí)水產(chǎn)養(yǎng)殖學(xué)號(hào)：030212010025姓名：皇昊專(zhuān)業(yè)：2010級(jí)化學(xué)1班學(xué)號(hào)：060122010055姓名：續(xù)鵬輝專(zhuān)業(yè)：2010級(jí)水產(chǎn)養(yǎng)殖一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私釯MViC與硫化氫反應(yīng)的原理及其在腸道菌鑒定中的意義和方法。二、實(shí)驗(yàn)原理IMViC是I一吲哚（indoltest）、M甲基紅（methylredtest）、V伏-普（Voges-Prolauertest）和C一檸檬酸鹽（citratetest）4個(gè)實(shí)驗(yàn)的縮寫(xiě)。這4個(gè)實(shí)驗(yàn)主要用來(lái)快速鑒別產(chǎn)氣桿菌與大腸桿菌，多用于水的細(xì)菌檢查。大腸桿菌

2、雖非致病菌，但在飲用水時(shí)若超過(guò)一定指標(biāo)，則表示水質(zhì)受糞便污染。產(chǎn)氣桿菌也廣泛存在于自然界中，因此檢查水是要將兩者分開(kāi)。硫化氫（H2S）實(shí)驗(yàn)也是檢查腸道細(xì)菌的生化實(shí)驗(yàn)。（一）吲哚試驗(yàn)（indoltest）吲哚試驗(yàn)是用來(lái)檢測(cè)吲哚試驗(yàn)的產(chǎn)生，有些細(xì)菌分解培養(yǎng)基中的色氨酸生成吲哚（靛基質(zhì)），經(jīng)與試劑中的對(duì)二甲基氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚而呈紅色。色氨酸+H20色氨酸酶吲哚+NH3+丙酮酸吲哚+對(duì)二甲基氨基苯甲醛玫瑰吲哚（紅色）只有部分細(xì)菌能產(chǎn)生色氨酸酶，從而具有分解色氨酸產(chǎn)生吲哚的能力，因此吲哚實(shí)驗(yàn)可以作為一個(gè)生化檢測(cè)指標(biāo)。大腸桿菌產(chǎn)色氨酸酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性（紅色），產(chǎn)氣腸桿菌不產(chǎn)色氨酸酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰

3、性（無(wú)色）。（二）M-甲基紅試驗(yàn)（methylredtest）用來(lái)檢測(cè)由葡萄糖產(chǎn)生的有機(jī)酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。細(xì)菌代謝糖產(chǎn)生酸使培養(yǎng)基變酸（pH下降），使甲基紅指示劑變色：橘黃色（pH6.3）紅色（pH4.2）盡管，所有腸道微生物都能發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生有機(jī)酸，但大腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌有區(qū)別：兩者在培養(yǎng)早期產(chǎn)生有機(jī)酸，但大腸桿菌在培養(yǎng)后仍能維持酸性pH4,而產(chǎn)氣腸桿菌則將有機(jī)酸轉(zhuǎn)化為非酸性產(chǎn)物，使pH上升至6左右。因此，大腸桿菌為陽(yáng)性（紅色），產(chǎn)氣腸桿菌陰性（黃色）。（三）伏-普實(shí)驗(yàn)（Voges-Prolauertest）測(cè)定細(xì)菌利用葡萄糖產(chǎn)生非酸性或中性末端產(chǎn)物（如丙酮酸）的能力。丙酮酸進(jìn)行縮合

4、、脫羧生成乙酰甲基醇，此化合物在堿性條件下能被空氣中的氧氣氧化成二乙酰。二乙酰與蛋白胨中的精氨酸的胍基作用，生成紅色化合物，及伏-普反應(yīng)陽(yáng)性，不產(chǎn)生紅色化合物者為反應(yīng)陰性。堿性條件、加入少量含胍基的化合物可使反應(yīng)更明顯。大腸桿菌不產(chǎn)丙酮酸實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性（無(wú)色），產(chǎn)氣腸桿菌產(chǎn)丙酮酸實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性（紅色）。葡萄糖丙酮酸-CO2縮合乙酰乳酸-CO2脫羧乙酰甲基甲醇+0H-2H胍基+二乙酰紅色化合物（四）檸檬酸鹽試驗(yàn)（citratetest）用來(lái)檢測(cè)檸檬酸鹽是否被利用，有些細(xì)菌以檸檬酸鈉為碳源，培養(yǎng)基中的檸檬酸和磷酸銨被分解后，產(chǎn)生堿性化合物，使pH升高，當(dāng)加入1%溴麝香草酚藍(lán)指示劑時(shí)，培養(yǎng)基就會(huì)有綠

5、色轉(zhuǎn)變?yōu)樯钏{(lán)色，溴麝香草酚藍(lán)指示范圍：pHV6黃色，pH67綠色，pH7藍(lán)色。大腸桿菌不能利用檸檬酸鹽實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性（綠色），產(chǎn)氣腸桿菌能利用檸檬酸鹽實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性（藍(lán)色）。（五）硫化氫實(shí)驗(yàn)用來(lái)檢測(cè)硫化氫的產(chǎn)生，也是用于腸道細(xì)菌檢查的常用生化實(shí)驗(yàn)。含硫有機(jī)物（如胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸）能被部分細(xì)菌分解產(chǎn)生H2S，H2S和培養(yǎng)基中的鉛鹽或鐵鹽反應(yīng)，形成黑色的硫化鉛或硫化鐵沉淀。大腸桿菌不能分解含硫有機(jī)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性（無(wú)沉淀），產(chǎn)氣腸桿菌能分解含硫有機(jī)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性（黑色沉淀）。三、實(shí)驗(yàn)器材1、菌種：大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌斜面各一支。2、培養(yǎng)基：蛋白胨水培養(yǎng)基、葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基、檸檬酸鹽

6、培養(yǎng)基、硝酸鹽還原培養(yǎng)基、醋酸鉛培養(yǎng)基3、溶液和試劑：甲基紅指示劑，40%KOH，5%-萘酚溶液，乙醚，吲哚試劑4、儀器或其他用具：試管架，接種環(huán)等四、操作步驟一）實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基配制：蛋白胨3g，葡萄糖3g,磷酸氫二鉀1.2g，水600ml,溶解，調(diào)節(jié)Ph7.,0-7.2,分裝于70支試管中，112C滅菌30min。2檸檬酸鹽培養(yǎng)基配制：NH4H2PO40.2g,K2HPO40.2g,NaCllg,MgSO440mg,檸檬酸鈉0.4g，瓊脂4g,調(diào)節(jié)pH6.8,1%溴香草酚藍(lán)乙醇液2ml,水200ml,溶解，分裝于20支試管中，121C滅菌20min。（pH不宜偏高，以淡綠色為宜

7、）硝酸鹽還原培養(yǎng)基配制：蛋白胨1.25g，氯化鈉0.625g，硝酸鉀0.25g，水125ml,溶解，調(diào)節(jié)pH7.4左右，分裝于16支試管中，121C滅菌20min。硫化氫試驗(yàn)養(yǎng)基配制：蛋白胨5g,氯化鈉1.25g,檸檬酸鐵銨125mg,硫代硫酸鈉125mg,瓊脂5g,水250ml。先將瓊脂、蛋白胨融化，冷至60C時(shí)加入其他成分，調(diào)pH7.2左右，分裝于35支試管中，112C滅菌20min。二）接種與培養(yǎng)1穿刺法分別接種大腸桿菌、產(chǎn)氣桿菌于2支醋酸鉛培養(yǎng)基（H2S）,37C培養(yǎng)48h。2分別接種大腸桿菌、產(chǎn)氣桿菌于2支蛋白胨水培養(yǎng)基（I）、2支葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基（M&V）,37C培養(yǎng)2d。3劃

8、S曲線法分別接種大腸桿菌、產(chǎn)氣桿菌于2支檸檬酸鹽斜面培養(yǎng)基（C）,37C培養(yǎng)2d。三）結(jié)果觀察H2S實(shí)驗(yàn)：觀察是否有黑色硫化鉛沉淀產(chǎn)生。吲哚實(shí)驗(yàn)：2d后的培養(yǎng)物內(nèi)加34滴乙醚搖動(dòng)數(shù)次，靜至13min,待乙醚上升后,沿管壁徐徐滴加2滴吲哚試劑，在乙醚和培養(yǎng)物之間產(chǎn)生紅色環(huán)狀物者為陽(yáng)性反應(yīng)。3甲基紅實(shí)驗(yàn)：2d后的培養(yǎng)物內(nèi)加2滴甲基紅試劑，培養(yǎng)物變?yōu)榧t色者為陽(yáng)性，黃色者為陰性（注意甲基紅不要過(guò)量，以免出現(xiàn)假陽(yáng)性）。4伏一普實(shí)驗(yàn)：2d后的培養(yǎng)物內(nèi)加510滴40%KOH,然后加入等量的5%-萘酚溶液,用力振蕩，紅色為陽(yáng)性。5檸檬酸鹽實(shí)驗(yàn)：觀察2d后的培養(yǎng)物上有無(wú)細(xì)菌產(chǎn)生及其顏色，藍(lán)色為陽(yáng)性，綠色為陰性。

9、五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果將實(shí)驗(yàn)結(jié)果填入下表?！啊北硎娟?yáng)性反應(yīng)，“”表示陰性反應(yīng)。菌名IMViC試驗(yàn)h2s試驗(yàn)吲哚試驗(yàn)甲基紅試驗(yàn)伏普試驗(yàn)檸檬酸鹽試驗(yàn)大腸桿菌+產(chǎn)氣腸桿菌+六、討論吲哚試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、伏一普試驗(yàn)、檸檬酸鹽試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與理論結(jié)果一致。h2s試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與理論結(jié)果不一致，兩支醋酸鉛培養(yǎng)基中都產(chǎn)生黑色沉淀，均為陽(yáng)性反應(yīng)，可能的原因：接種操作時(shí)，先穿刺接種產(chǎn)氣腸桿菌，之后，接種針未充分加熱滅菌，再穿刺接種大腸桿菌時(shí)混入部分大腸桿菌；接種針在接種產(chǎn)氣腸桿菌時(shí)，接種針上不粘上了產(chǎn)氣腸桿菌，未被加熱滅菌，再接種大腸桿菌時(shí)，將產(chǎn)氣腸桿菌混入，使大腸桿菌產(chǎn)生假陽(yáng)性反應(yīng)。吲哚試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象不明顯，可能的原因

10、：培養(yǎng)基中的色氨酸含量不夠高；吲哚試劑加入的量不夠，一部分粘在試管壁上損失掉，之后補(bǔ)加時(shí)乙醚已揮發(fā)；滴加吲哚試劑時(shí)動(dòng)作不夠輕緩，破壞了紅色化合物的生成。為什么大腸桿菌是甲基紅反應(yīng)陽(yáng)性，而產(chǎn)氣腸桿菌為陰性？這個(gè)試驗(yàn)與伏普試驗(yàn)最初底物和最終產(chǎn)物有何異同？大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌都能發(fā)酵葡萄糖，在分解葡萄糖過(guò)程中產(chǎn)生丙酮酸，進(jìn)一步分解代謝途徑不同。大腸桿菌，可產(chǎn)生乳酸、琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產(chǎn)物，可使培養(yǎng)基PH值下降至PH4.5以下，使甲基紅指示劑變紅，即甲基紅反應(yīng)陽(yáng)性。產(chǎn)氣腸桿菌則使丙酮酸進(jìn)行縮合、脫羧生成乙酰甲基甲醇，此化合物在堿性條件下能被空氣中的氧氣氧化成二乙酰，二乙酰與蛋白胨中精氨酸的胍基作用，生成紅色化合物，即伏-普陽(yáng)性反應(yīng)。說(shuō)明在硫化氫試驗(yàn)中醋酸鉛的作用,可以用哪種化合物代替醋酸鉛？醋酸鉛培養(yǎng)基（試紙）可檢驗(yàn)硫化氫的產(chǎn)生，反應(yīng)為：Pb（Ac）2+H2S=PbS（+