細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

1、細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)講義（植物部分）姓名:學(xué)號(hào)：課程簡(jiǎn)介：本課程利用植物細(xì)胞和組織培養(yǎng)的理論，訓(xùn)練學(xué)生的植物細(xì)胞培養(yǎng)、組織培 養(yǎng)和組培苗繁殖技術(shù)。提高學(xué)生實(shí)踐動(dòng)手能力、科學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)芰?、組培苗工業(yè)化生產(chǎn)的組織管 理能力。強(qiáng)調(diào)動(dòng)手操作，訓(xùn)練和培養(yǎng)職業(yè)技能。實(shí)行單獨(dú)考核，考核方式實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)一植物培養(yǎng)基的配制一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、學(xué)習(xí)植物細(xì)胞和組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的規(guī)則，培養(yǎng)學(xué)生關(guān)于組織培養(yǎng)的無菌意識(shí)；2、通過MS培養(yǎng)基母液的配制與保存，掌握配制與保存培養(yǎng)基母液的基本技能。二、實(shí)驗(yàn)原理細(xì)胞和組織失去整體植物所具有的保護(hù)系統(tǒng)，需要無菌環(huán)境維持分裂和生長。植物細(xì)胞 和組織與整體植物在營養(yǎng)需求上基本一致，具體參見植物生理學(xué)

2、的礦質(zhì)營養(yǎng)部分。三、實(shí)驗(yàn)材料、器具和試劑75%酒精、洗滌劑、噴霧器、各種培養(yǎng)器皿、工作服、口罩和手套等。配制MS培養(yǎng)基母 液所需要的藥品、各類天平、燒杯、定容瓶、量筒、蒸鏘水、95%的酒精或0. Imol/L的NaOIK 0. Imol/L HCK母液瓶、標(biāo)簽紙、冰箱、高壓滅菌鍋。四、實(shí)驗(yàn)步驟1、地面、墻壁和工作臺(tái)的滅菌將配好的2%新潔爾滅（陽離子表面活性劑類廣譜殺菌劑，改變膜透性，使菌體內(nèi)物質(zhì) 外滲；殺菌滅藻）溶液倒入噴霧器中，對(duì)地面、墻壁、角落均勻地噴霧。在噴房頂時(shí)，注意 不要讓藥液滴入眼睛。注：對(duì)于正在使用中的組培間，此步驟可省去。2、無菌室和培養(yǎng)室的滅菌首先將房子關(guān)閉，然后用10mL甲

3、醛和5g高鎰酸鉀的配比液進(jìn)行熏蒸。操作時(shí)要戴好口 罩和手套，用甲醛與高鎰酸鉀配比時(shí)要注意避開煙霧。注：對(duì)于正在使用中的組培間，此步 驟可省去。3、培養(yǎng)器皿的洗滌與滅菌將培養(yǎng)器皿先用肥皂水或洗衣粉清洗干凈，然后用清水沖洗5遍，最后用蒸儲(chǔ)水沖5 遍，烘干后備用。4、母液的配制（注：要求不十分精確的情況下，以下溶液配制定容時(shí)用相應(yīng)體積的量筒定容即可。）（1）母液1的配制（大量元素）稱量：用電子天平稱取下列藥品，分別放入燒杯。NH4NO3 16. 5 g KNO3 19.0 g MgS04. 7H2O 3. 7 g混合：用少量蒸偏水將藥品分別溶解，然后依次混合。定容：加蒸儲(chǔ)水定容至2000 ml,成5

4、倍液。（2）母液2的配制（鈣鹽）稱量：用電子天平稱取CaCl2. 2H2O 22. Ogo定容：加蒸儲(chǔ)水定容至500 mL成100倍液。（3）母液3的配制（鉀鹽）稱量：用電子天平稱取KH2P8.5 go定容：加蒸儲(chǔ)水定容至500位成100倍液。（4）母液4的配制（鐵鹽）稱量：用電子天平稱取下列藥品，分別放入燒杯。Na2-EDTA 2H2O 1.86 gFeS04 7H2O 1.39go混合：用少量蒸儲(chǔ)水將藥品分別溶解后混合。定容：加蒸儲(chǔ)水定容至500mL成100倍液。注：分別溶解上述藥品，其中FeSOJIW溶液緩慢倒入Na2-EDTA2HzO溶液中,同時(shí)攪拌, 于棕色瓶中放置。（5）母液5的配

5、制（微量元素）稱量：用電子天平稱取下列藥品，分別放入燒杯。H3B03 0. 62 gNaMoO4. 211.0 0. 025gMnS04. 4H20 2 . 23 gCuSOi. 5H2O 0. 0025 gZnSOi. 7H20 0. 86 gCoCl2. 6H2O 0. 0025 gKI 0.083 g混合：用少量蒸儲(chǔ)水將藥品分別溶解，然后依次混合。定容：加蒸儲(chǔ)水定容至500 mL成100倍液。（6）母液6的配制（有機(jī)物）稱量：用電子天平稱取下列藥品，分別放入燒杯。肌醇5.0 g VB6 （鹽酸瞰哆醇）0. 025 g 甘氨酸 0. 1 gVB1 （鹽酸硫胺素）0. 004 g煙酸0. 0

6、25 g混合：用少量蒸儲(chǔ)水將藥品分別溶解后混合。定容：加蒸儲(chǔ)水定容至500 mL成100倍液。（7）母液7的配制（植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)）稱量：用電子天平稱取生長素或細(xì)胞分裂素50-100 mgo溶解：生長素用少量95%的酒精或 lmol/L的NaOH溶解，細(xì)胞分裂素用lmol/L HC1加熱溶解。定容：加蒸儲(chǔ)水定容至100 mL 配制成0.5T mg制L的溶液。5、母液的保存（1）裝瓶：將配制好的母液分別倒入瓶中，貼好標(biāo)簽，注明培養(yǎng)基名稱（MS母液1, 2, 3, 4, 5, 6）、母液倍數(shù)（5X,100X,500X）、配制者與配制日期。（2）儲(chǔ)藏：將母液放在4冰箱中備用。6、MS培養(yǎng)基的配制配制

7、工作液就是配制1義溶液,根據(jù)母液濃縮倍數(shù)稀釋即可。例如:配制lOOOmlMS培養(yǎng)基, 只需關(guān)注母液倍數(shù)，用需配制的體積除以母液倍數(shù)即可得到加入母液的體積。預(yù)配制工作液體積1000 niL,需要母液體積：母液1 (5X)200 ml母液 2 (100X)10 ml母液 3 (100X)10 ml母液 4 (100X)10 ml母液 5 (100X)10 ml母液 6 (100X)10 ml蔗糖30 g瓊脂8.0 g2, 4-D （2,4-二氯苯氧乙酸）6-BA（6-茉氨基腺喋吟）/NAA在1000 ml燒杯中加入一定量的蒸偏水（約800ml），加入蔗糖和瓊脂，加熱至半透明 狀，邊攪拌邊加入上述母

8、液1-7, lmol/L NaOII調(diào)節(jié)pH值至7 （滅菌后約5. 8）。定容至1L, 攪勻分裝，每瓶約35-40mL,放入滅菌鍋中設(shè)置參數(shù)121 , 18 min.五、實(shí)驗(yàn)預(yù)期結(jié)果：.學(xué)會(huì)維持植物組培室無菌狀態(tài)的方法，具備無菌培養(yǎng)意識(shí)；.能夠配制MS培養(yǎng)基。六、思考題.為什么配制培養(yǎng)基需要先配制母液？.母液分開配制的原因？3、鐵鹽母液裝在棕色瓶中的原因？實(shí)驗(yàn)二花卉快速擴(kuò)繁一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)花卉莖段快速擴(kuò)繁的基本方法和步驟。二、實(shí)驗(yàn)原理利用莖段的腋芽快速擴(kuò)繁植物，莖段在一定條件下可以誘導(dǎo)生根。三、實(shí)驗(yàn)材料、器具和試劑1、材料：植物莖段。2、儀器：超凈工作臺(tái)、滅菌鍋、顯微鏡、剪刀、長鎰子、燒杯(5

9、00 mL)、培養(yǎng)皿3、試劑：MS+2, 4-D (1.0mg/L)o四、實(shí)驗(yàn)步驟1、培養(yǎng)基的配制2、材料的選擇；選用的枝條要求表面光滑、無病蟲害。3、培養(yǎng)步驟：(1)材料的滅菌：選取長約2厘米的康乃馨或鴨跖草嫩枝條于2%的次氯酸鈉消毒10分鐘, 然后用無菌水沖洗3次。再用75 %酒精消毒30秒，無菌水洗3次。(2)用剪刀將滅菌后的枝條剪成1-15厘米長的小段，保留莖段，將枝條兩端由于消毒損 傷的細(xì)胞剪去，接種于培養(yǎng)基上。打開培養(yǎng)瓶蓋的正確方法：1火焰消毒鏡子，注意:鐐子要冷卻后再使用，避免燙傷莖 段。傾斜培養(yǎng)瓶，蓋掀開一點(diǎn)口，靠近酒精燈外焰，用鏡子夾住莖段，插入培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)完 成后對(duì)瓶口和瓶

10、蓋滅菌后再蓋上瓶蓋。(3)用記號(hào)筆在培養(yǎng)瓶上標(biāo)記好實(shí)驗(yàn)名稱+姓名+日期培養(yǎng)條件：培養(yǎng)物置于25。左右的培養(yǎng)室中，每天光照12小時(shí)，光照度為850-1200 Ixo 五、思考題.剪去莖段要取莖段部分，為什么？.為什么在培養(yǎng)基中放置莖段的時(shí)候，要保持形態(tài)學(xué)上端向上？實(shí)驗(yàn)三植物愈傷組織的誘導(dǎo)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)植物外植體愈傷組織的誘導(dǎo)技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理植物組織培養(yǎng)的理論依據(jù)是植物細(xì)胞具有全能性，所謂細(xì)胞全能性是指植物體任何一個(gè) 細(xì)胞都攜帶著一套發(fā)育成完整植株的全部遺傳信息，在離體培養(yǎng)情況下，這些信息可以表達(dá), 產(chǎn)生出完整植株。要使細(xì)胞所具有的全能性表達(dá)出來，除了生長以外，還要經(jīng)過脫分化和再 分化等過程。

11、已有特定結(jié)構(gòu)與功能的植物組織，在一定條件下，其細(xì)胞被誘導(dǎo)改變?cè)瓉淼陌l(fā) 育途徑，逐步逆轉(zhuǎn)其原有的分化狀態(tài)，轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂蟹稚芰Φ呐咝约?xì)胞，這個(gè)過程稱為脫分 化(dedifferentiation)o來自于植物各種器宮的外植體在離體培養(yǎng)條件下，細(xì)胞經(jīng)脫分化 等一系列過程，改變了它們?cè)械奶匦远D(zhuǎn)變形成一種能迅速增殖的無特定結(jié)構(gòu)和功能的細(xì) 胞團(tuán)，即愈傷組織。一般情況下，植物各器官和組織均有誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織的潛在可能性。植物生長調(diào)節(jié)劑是誘導(dǎo)愈傷組織形成的極為重要的因素。生長素常用的種類有2, 4-D , IAA和NAA,所需濃度在0.01-10 mg/L范圍內(nèi)；常用的細(xì)胞分裂素是激動(dòng)素、玉米素和 6-B

12、A,使用的濃度范圍在0.110 mg/Lo 三、實(shí)驗(yàn)材料、器具和試劑1、材料：植物無菌苗或無菌植物組織，如煙草葉片、石吊蘭和石斛等著名花卉葉片、 胡蘿卜根、大豆和油菜的子葉等。2、器具：超凈工作臺(tái)、滅菌鍋、剪刀、長鑲子、電磁爐、平底鍋、燒杯、量筒、培養(yǎng) 瓶、移液管、玻璃棒、濾紙、pH試紙或pH計(jì)、紗布、脫脂棉等。3、試劑:MS+6-BA (l.Omg/L) +2, 4-D (1.0 mg/L)Oo四、實(shí)驗(yàn)步驟1、培養(yǎng)基的配制2、接種：用消過毒的鏡子將外植體分別接種于培養(yǎng)基上。3、培養(yǎng)觀察：接種后將材料放置培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，溫度為25C,光強(qiáng)1000-3000 lx,每 日光照12小時(shí)。注意觀察

13、愈傷組織或綠苗的發(fā)生情況并作好記錄。綠苗與不定根不是同時(shí) 發(fā)生，因此待綠苗增至一定數(shù)量，苗高3厘米時(shí)應(yīng)轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根。五、實(shí)驗(yàn)預(yù)期結(jié)果：外植體長出愈傷組織，操作正確的情況下，污染率較低六、思考題L常用滅菌方法有哪些？2 ,簡(jiǎn)述無菌操作過程中注意事項(xiàng)？實(shí)驗(yàn)四愈傷組織的分化一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)和掌握愈傷組織分化培養(yǎng)的基本方法。二、實(shí)驗(yàn)原理植物細(xì)胞全能性。詳見實(shí)驗(yàn)二的實(shí)驗(yàn)原理部分。三、實(shí)驗(yàn)材料、器具和試劑1、材料：上個(gè)實(shí)驗(yàn)獲得的愈傷組織。2、儀器：光學(xué)顯微鏡、超凈工作臺(tái)、滅菌鍋、顯微鏡、解剖刀、長鐐子、電爐、燒杯、培 養(yǎng)皿、移液管等。3、試劑：MS+ 2, 4-D (0. 1 mg/L) +6-

14、BA (1 mg/L)0四、方法步驟1、外植體的接種與培養(yǎng)：點(diǎn)燃酒精燈，取1瓶含愈傷組織的培養(yǎng)瓶，瓶口滅菌后，用無菌 鏡子將愈傷組織在無菌條件下接種于接種在新的無菌培養(yǎng)基中。2、貼好標(biāo)簽，培養(yǎng)溫度為25左右，每天光照10小時(shí)，光強(qiáng)1000-1500 lx。五、實(shí)驗(yàn)預(yù)期結(jié)果愈傷組織分化出幼苗(圖3)。六、思考題為什么愈傷組織能夠長出完整的植株？如何選擇愈傷組織誘導(dǎo)的激素和濃度？實(shí)驗(yàn)五組培苗的馴化與移栽一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康陌褵o菌苗從培養(yǎng)基中移至土壤中，實(shí)現(xiàn)在自然環(huán)境中正常生長。本實(shí)驗(yàn)要求掌握組培苗 的馴化和移栽方法。二、實(shí)驗(yàn)原理組織培養(yǎng)中培育出來的苗通常稱為組培苗或試管苗。由于試管苗是在無菌、有營養(yǎng)供給、

15、 適宜光照和溫度近100%的相對(duì)濕度環(huán)境條件下生長的，因此，在生理、形態(tài)等方面都與自 然條件生長的正常小苗有著很大的差異。所以必須通過煉苗，例如通過控水、減肥、增光、 降溫等措施，使它們逐漸地適應(yīng)外界環(huán)境，從而使生理、形態(tài)、組織上發(fā)生相應(yīng)的變化，使 之更適合于自然環(huán)境，只有這樣才能保證試管苗順利移栽成功。三、實(shí)驗(yàn)材料、器具和試劑1、材料：草莓、菊花、百合、非洲菊、大巖桐等任何一種組培苗。2、試劑與用具：蛭石、珍珠巖、腐殖土，草炭土、砂子、噴壺、育苗盤、塑料缽等四、方法步驟1、移栽基質(zhì)的配制：用珍珠巖，蟀石，草炭土或腐殖土比例為1 ： 1 ： 0.5o也可用砂子： 草炭土或腐殖土為1 ： 1。這

16、些介質(zhì)在使用前應(yīng)高壓滅菌。2.移栽前的煉苗移栽前可將培養(yǎng)物不開口移到自然光照下鍛煉2-3天，讓試管苗接受強(qiáng)光的照射，使其長 得壯實(shí)起來，然后再開口煉苗1-2天，經(jīng)受較低濕度的處理，以適應(yīng)將來自然濕度的條件。 3.移栽和幼苗的管理a.篩選幼苗：從試管中取出發(fā)根的小苗，選取根較粗大的幼苗較好生長。b.清洗根部培養(yǎng)基：用自來水洗掉根部粘著的培養(yǎng)基，要全部除去，以防殘留培養(yǎng)基滋生 雜菌，同時(shí)也防止根部因培養(yǎng)基的殘留而無法從土壤中吸收營養(yǎng)。但要輕輕除去，應(yīng)避免造 成傷根。C.插孔與移栽：栽植時(shí)用一個(gè)筷子粗的竹簽在基質(zhì)中插一小孔，然后將小苗插入，注意幼 苗較嫩，防止弄傷，栽后把苗周圍基質(zhì)壓實(shí)，栽前基質(zhì)要澆

17、透水。五、思考題.為什么需要煉苗后才能移栽？.移栽注意哪些問題？動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程一、細(xì)胞名稱：Hela （人宮頸癌細(xì)胞）二、生長特性：貼壁1、細(xì)胞生長條件：DMEM培養(yǎng)基，胎牛血清，青霉素，鏈霉素，0.25%胰蛋白酶（含0.02%的 EDTA）, PBS等2、培養(yǎng)器具：培養(yǎng)瓶、燒杯、鐐子、酒精棉、離心管、移液槍等。3、實(shí)驗(yàn)設(shè)備：二氧化碳培養(yǎng)箱、光學(xué)顯微鏡、無菌操作臺(tái)、恒溫水浴鍋、酒精燈。培養(yǎng)基90% DMEM血清10% FBS溫度37 空氣條件5% 82，95% AIR生長代數(shù)P4-5凍存條件培養(yǎng)基50%、血清40%、DMSO 10%三、細(xì)胞接收后的操作流程與注意事項(xiàng).細(xì)胞收到后建議在培養(yǎng)箱穩(wěn)

18、定4小時(shí)左右再依據(jù)細(xì)胞密度，換液培養(yǎng)或傳代。.如果細(xì)胞為貼壁細(xì)胞，而收到時(shí)呈懸浮或者部分懸浮的狀態(tài)，請(qǐng)將懸浮的細(xì)胞及時(shí)離心, 加15%血清的完全培養(yǎng)基到新的培養(yǎng)皿/瓶中繼續(xù)培養(yǎng)3天；同時(shí)原培養(yǎng)瓶中剩下的貼 壁細(xì)胞更換為15%血清的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)2-3天。.貼壁細(xì)胞生長緩慢：適當(dāng)提高血清濃度（最高不超過20%）,或可根據(jù)該細(xì)胞生長密度， 考慮胰酶消化后，轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)。.生長不均：貼壁細(xì)胞若出現(xiàn)生長不均，成島狀生長，可將細(xì)胞進(jìn)行消化，重新打散細(xì)胞, 加入新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)傳代流程（嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作）.取密度80%左右的Hela細(xì)胞，吸去舊的培養(yǎng)基，用PBS或者Trypsin消化液潤洗細(xì)胞 以減少殘留的血清對(duì)Trypsin的抑制作用。.吸去PBS或者Trypsin,加入Trypsin消化液，于37消化24分鐘，于倒置顯微鏡下 觀察，當(dāng)細(xì)胞之間出現(xiàn)間時(shí)或者變圓時(shí)，吸掉Trypsin消化液。（也可以直接加入適量含血清的新鮮培 養(yǎng)基終