制藥過程與工藝(完整精致資料)ppt-武漢科技大學(xué)

1、制藥過程與工藝主講教師：左振宇武漢科技大學(xué) 化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院 生物工程專業(yè)二零 年 十 月1課程介紹制藥工藝學(xué)是研究藥物的工業(yè)生產(chǎn)過程共性規(guī)律及其應(yīng)用，包括制備原理、工藝路線、質(zhì)量控制。制藥工藝學(xué)是綜合應(yīng)用化學(xué)系列、生物系列、機(jī)械設(shè)備與工程單元操作等課程的專門知識，深化理解并掌握工藝原理，充分考慮藥品的特殊性，針對生產(chǎn)條件、所需環(huán)境等的具體要求，研究藥物制造原理、工藝路線與過程優(yōu)化、中試放大、生產(chǎn)技術(shù)與質(zhì)量控制，從而分析和解決生產(chǎn)過程的實(shí)際問題。從工業(yè)生產(chǎn)角度，改造、設(shè)計(jì)和開發(fā)藥物的生產(chǎn)工藝，制定相應(yīng)的操作規(guī)程。 制藥工藝學(xué)課程的知識體系由三個(gè)知識領(lǐng)域、眾多知識單元和知識點(diǎn)三個(gè)層次組成。第一

2、領(lǐng)域?yàn)樯锛夹g(shù)制藥工藝；第二領(lǐng)域?yàn)榛瘜W(xué)制藥工藝；第三領(lǐng)域?yàn)橹扑幑に嚨墓残曰A(chǔ)。每個(gè)知識領(lǐng)域進(jìn)一步分解成若干個(gè)知識單元，每個(gè)知識單元又包涵若干個(gè)知識點(diǎn)，最后形成的制藥工藝學(xué)課程體系。2課程介紹課程內(nèi)容第1章 導(dǎo)論第2章 微生物發(fā)酵制藥工藝第3章 基因工程制藥工藝第4章 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)制藥工藝第5章 化學(xué)藥物工藝路線的設(shè)計(jì)和選擇第6章 合成藥物工藝研究第7章 典型化學(xué)制藥工藝 第8章 手性藥物合成第9章 中試放大與生產(chǎn)工藝規(guī)程 共30學(xué)時(shí)，講授28學(xué)時(shí)，答疑2學(xué)時(shí)考核方法理論考試占80%；平時(shí)占20%3課程介紹參考書元英進(jìn). 現(xiàn)代制藥工藝學(xué)，化學(xué)工業(yè)出版社，2004年齊香君. 生物制藥工藝學(xué)，化學(xué)工

3、業(yè)出版社，2003年Heinrich Klefenz. Industrial Pharmaceutical Biotechnology. Wiley-VCH, 20024第一章 緒論5本章內(nèi)容1.1 制藥工藝學(xué)課程地位和性質(zhì)1.2 天然提取制藥技術(shù)發(fā)展1.3 生物技術(shù)制藥發(fā)展1.4 化學(xué)合成制藥技術(shù)發(fā)展1.5 制藥工業(yè)的發(fā)展1.6 制藥技術(shù)展望61.1 制藥工藝學(xué)課程地位和性質(zhì)7一 課程性質(zhì)和地位制藥業(yè)發(fā)展與挑戰(zhàn)90年1752億USD00年4775億USD增長大于8%全球4496億元,年增長大于12 制藥業(yè)集中度 原料藥生產(chǎn)大國制藥技術(shù)和裝備整體水平低中國8國外制藥工程教育1995年，NSF

4、新澤西州立大學(xué)Rutgers分校制藥工程研究生教育密西根大學(xué)等高校也相繼設(shè)立制藥工程專業(yè)：The California State University, Fullerton ; New Jersey Institute of Technology; Columbia University, New York; Ecole Polytechnique of Montreal; The University of Leeds; University of Pennsylvania; University of Alabama除美國外，加拿大、英國和德國、日本和印度等國家的部分高校也已設(shè)立制藥工程

5、教育計(jì)劃。9國內(nèi)制藥工程教育1998年中國教育部調(diào)整新設(shè)置制藥工程工科本科專業(yè)化學(xué)制藥生物制藥中藥制藥制藥工程10制藥工程制藥工藝學(xué)、制藥分離工程、藥品質(zhì)量管理工程、制藥設(shè)備等厚基礎(chǔ)，寬口徑，注重培養(yǎng)全面素質(zhì)與創(chuàng)新能力制藥過程共性規(guī)律、技術(shù)、學(xué)科基礎(chǔ)、發(fā)展需求化學(xué)制藥生物制藥微生物制藥中藥制藥工業(yè)制劑生物化工制藥工程專業(yè)與原專業(yè)的關(guān)系11二 研究對象與內(nèi)容制藥工藝：從發(fā)現(xiàn)-藥物上市發(fā)現(xiàn)臨床前臨床毒理注冊生產(chǎn)GLPGCPGMP化學(xué)化學(xué)生物生物中藥劑型開發(fā)過程開發(fā)工業(yè)制藥工業(yè)制藥技術(shù)開發(fā)技術(shù)開發(fā)GLP藥物非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范GCP 藥物臨床試驗(yàn)質(zhì)量管理規(guī)范GMP 藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范121 研究

6、對象藥物生產(chǎn)過程共性規(guī)律及其應(yīng)用，包括 制備原理+工藝路線+質(zhì)量控制重要性： “安全、有效、均勻、可控”的保證 藥物產(chǎn)業(yè)化的橋梁與瓶頸 貫穿整個(gè)藥物研發(fā)過程132 主要內(nèi)容綜合應(yīng)用化學(xué)系列、生物系列、機(jī)械設(shè)備與工程單元操作等課程的專門知識深化理解并掌握工藝原理，去分析和解決研發(fā)和生產(chǎn)過程的實(shí)際問題。從工業(yè)生產(chǎn)角度，改造、設(shè)計(jì)和開發(fā)藥物的生產(chǎn)工藝，制定相應(yīng)的操作規(guī)程。14主要內(nèi)容實(shí)驗(yàn)室（小試）工藝中試放大工藝在車間生產(chǎn)若干批號后，制定生產(chǎn)工藝規(guī)程15制藥工藝的類別（藥物分類）化學(xué)合成藥物(synthetic drug)布洛芬、雷尼替丁、氧氟沙星生物合成藥物(biosynthetic drug)重

7、組人胰島素、重組人紅細(xì)胞生成素中藥(traditional chinese medicine)速效救心丸、復(fù)方丹參滴丸16按照典型藥物生產(chǎn)過程,分為4類：化學(xué)制藥工藝學(xué)生物制藥工藝學(xué)中藥制藥工藝學(xué)制劑工藝學(xué)171.2 天然提取制藥技術(shù)發(fā)展18天然提取制藥是指直接從天然材料中使用分離純化等技術(shù)制備藥物。現(xiàn)代藥物最初來源于植物、動(dòng)物和微生物，而且以提取分離為先導(dǎo)。 19發(fā)展歷史1517世紀(jì)，歐洲有了金雞納、愈創(chuàng)木、藥喇叭根、古柯果和可可等。 19世紀(jì)，掀起了天然提取分離藥物的熱潮，從植物中分離出純的有效化學(xué)物質(zhì)。從鴉片中提取出嗎啡結(jié)晶；從吐根中分離得活性成份吐根堿。從金雞納樹皮分離得到了奎寧，成為

8、最早用于治療瘧疾的藥物。從莨菪中提取了阿托品，從古柯葉取得了可卡因；從洋地黃葉子獲得洋地黃甙晶體。20世紀(jì)50年代后，對動(dòng)物臟器的有效成分和生理活性物質(zhì)的全面了解，生產(chǎn)技術(shù)提高，改變了原來的混合制劑，生產(chǎn)單一特異性組分的生化藥物制劑。如豬牛胰島素、前列腺酶及輔酶、激素、脂類、蛋白質(zhì)和核酸及其降解產(chǎn)物等。生化藥物品種迅速增加，已成為一類重要的藥物。 20由于合成工藝、技術(shù)等因素的限制，仍然有些氨基酸、維生素、核苷酸、酶、多糖、脂類等仍然不能合成生產(chǎn)，必須直接從天然材料中提取。還有一些手性藥物和半合成藥物的中間原料也必須從天然材料中直接提取。211.3 生物技術(shù)制藥發(fā)展22一 相關(guān)定義生物技術(shù)藥物

9、（biotechnology medicine）是利用生物機(jī)體、組織、細(xì)胞，生產(chǎn)制造或從中分離得到的具有預(yù)防、治療和診斷功能的藥品，包括多肽、蛋白質(zhì)、酶和核酸以及具有生物活性的初級代謝和次級代謝產(chǎn)物、天然活性化合物及其類似物。生物技術(shù)藥物（biotechnology medicine）、生物技術(shù)產(chǎn)品（biotechnology product）、生物技術(shù)制品（product of pharmaceutical biotechnology）有時(shí)候也互換使用。在相關(guān)法規(guī)中，經(jīng)常出現(xiàn)的術(shù)語是生物制品 (biologics，biologic product, 中國、美國使用)、生物醫(yī)藥產(chǎn)品（biolo

10、gical medicinal product，歐盟使用）。 23中國生物制品規(guī)程對生物制品的定義：以微生物、寄生蟲、動(dòng)物毒素、生物組織為起始材料，采用生物學(xué)工藝或分離純化技術(shù)制備，并以生物學(xué)技術(shù)和分析技術(shù)控制中間產(chǎn)物和成品質(zhì)量制成的生物活性制劑，包括菌苗、疫苗、毒素、類毒素、免疫血清、血液制品、免疫球蛋白、抗原、抗體、變態(tài)反應(yīng)原、細(xì)胞因子、激素、酶、發(fā)酵產(chǎn)品、單克隆抗體、DNA重組產(chǎn)品和體外免疫診斷制品等。分為預(yù)防用生物制品、治療用生物制品和診斷用品三類。預(yù)防用生物制品包括疫苗、菌苗和類毒素；治療用生物制品包括抗血清與抗毒素、血液制品、細(xì)胞因子與抗體；診斷用品包括細(xì)菌學(xué)試劑、免疫試劑、臨床化

11、學(xué)試劑。 24二 生物制藥的類型微生物發(fā)酵制藥采用微生物發(fā)酵生產(chǎn)藥物。第二次世界大戰(zhàn)期間誕生了以抗生素為代表的次級代謝產(chǎn)物的工業(yè)發(fā)酵，很快應(yīng)用到其他藥物的發(fā)酵生產(chǎn)，如氨基酸、維生素、甾體激素等。微生物藥物主要為抗生素(antibiotic)、氨基酸(amino acid)、維生素(vitamin)、核苷酸和核苷 (nucleotide, nucleoside)、酶(enzyme)、酶抑制劑(enzyme inhibitor)、免疫調(diào)節(jié)劑(immunomodulator)和受體拮抗劑(receptor antagonist)等。 酶工程技術(shù)制藥酶工程技術(shù)在制藥工業(yè)上的主要應(yīng)用是（1）生物酶用于制

12、備手性藥物；（2）生物轉(zhuǎn)化，給已有藥物添加基團(tuán)，增加藥效和功能 。 25細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)制藥動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)(cell culture)是在離體條件下人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)動(dòng)植物細(xì)胞，使之生長繁殖并發(fā)育。主要應(yīng)用于生產(chǎn)人畜病毒疫苗、單克隆抗體、重組基因工程產(chǎn)品等。 基因工程技術(shù)制藥基因工程（gene engineering）制藥是在體外通過重組DNA技術(shù)，對生物的遺傳物質(zhì)基因進(jìn)行剪切、拼接、重新組合，與適宜的載體連接，構(gòu)成完整的基因表達(dá)系統(tǒng)，然后導(dǎo)入宿主生物細(xì)胞內(nèi)，與原有遺傳物質(zhì)整合或以質(zhì)粒形式單獨(dú)在細(xì)胞中繁殖，并表達(dá)活性蛋白質(zhì)、多肽或核酸等藥物。 通過基因工程改造微生物細(xì)胞的代謝過程，還可提高抗生素、維

13、生素、氨基酸、核酸、輔酶、甾體激素等藥物的生產(chǎn)能力。 26三、生物藥物的用途1 作為治療藥物按藥理作用主要有以下：內(nèi)分泌障礙治療劑：胰島素、生長素、甲狀腺素等。維生素類藥物：主要起營養(yǎng)作用，用于維生素缺乏癥。中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物：L多巴，人工牛黃、腦啡肽。血液及造血系統(tǒng)藥物：常見的有抗貧血藥（血紅素）、抗凝藥（肝素）、纖溶劑抗血栓藥（尿激酶）等。呼吸系統(tǒng)藥物：平喘藥（PGE、腎上腺素）、祛痰劑（乙酰半胱氨酸）、鎮(zhèn)咳藥（蛇膽、雞膽）。心血管系統(tǒng)藥物：抗高血壓藥（激肽釋放酶）、降血脂藥（彈性蛋白酶，豬去氧膽酸）、冠心病防治藥（硫酸軟骨素A）27消化系統(tǒng)藥物：助消化藥（多酶片）、潰瘍抑制劑（胃膜素、維生

14、素U）、止瀉藥（鞣酸蛋白）。抗病毒藥物：抑制病毒核酸的合成，如碘苷抑制病毒合成酶，如阿糖腺苷調(diào)節(jié)免疫功能，如干擾素抗腫瘤藥物：主要有核酸類抗代謝物（阿糖胞苷，5-氟尿嘧啶）、抗癌天然大分子（天冬酰胺酶，香菇多糖PSK，灰樹花多糖）、提高免疫力抗癌劑（白介素2,干擾素）抗輻射藥物：如超氧歧化酶（SOD）計(jì)劃生育用藥：口服避孕藥（復(fù)方炔諾酮）生物制品類治療藥： 各種免疫蛋白、抗毒素、抗血清（蛇毒抗血清）。282 作為預(yù)防藥物常見的預(yù)防藥物有菌苗、疫苗、類毒素及冠心病防治藥物。3 作為診斷藥物（1）免疫診斷試劑利用高度特異性和敏感性的抗原機(jī)體反應(yīng)，檢測樣品中有無相應(yīng)的抗原或抗體，可作為臨床診斷的依據(jù)

15、。主要有診斷抗原和診斷血清。診斷抗原：細(xì)菌類，如傷寒病毒類，如SARS，乙肝病毒毒素類，如鏈球菌溶血素O29 診斷血清：細(xì)菌類病毒類腫瘤類抗毒素類激素類血型及人類白細(xì)胞抗原診斷血清其它（2）酶診斷試劑利用酶反應(yīng)的專一性和快速靈敏的特點(diǎn)，定量測定體液內(nèi)的某一成分變化作為病情診斷的參考。 目前有40余種酶診斷試劑盒。30（3）器官功能診斷藥物利用某些藥物對器官功能的刺激作用，排泄速度等已檢查器官的功能損害程度。如甘露醇等。（4）放射性核素診斷藥物放射性核素診斷藥物有聚集于不同組織或器官的特性，故加入體內(nèi)后，可檢測其在體內(nèi)的吸收、分布、轉(zhuǎn)運(yùn)、利用及排泄等情況，從而顯示器官功能及其形態(tài)，以供疾病的診斷

16、。（5）診斷用單克隆抗體（McAb）McAb的特點(diǎn)之一是專一性強(qiáng)，一個(gè)B細(xì)胞所產(chǎn)生的抗體只針對抗原分子上的一個(gè)特定抗原決定族。31（四）用作其它生物醫(yī)藥用品生化試劑 如細(xì)胞培養(yǎng)基、電泳試劑等生物醫(yī)學(xué)材料 手術(shù)縫合線、人造骨頭等。營養(yǎng)保健品和美容化妝品321.4 化學(xué)合成制藥技術(shù)發(fā)展33全合成制藥磺胺嘧啶、阿司匹林半合成制藥 多烯紫杉醇、頭孢類抗生素手性制藥 阿托伐他汀、阿奇霉素34化學(xué)制藥工藝的要求最安全：易燃易爆、有毒的原料與中間體最經(jīng)濟(jì)：成本最低最便捷：工藝路線最短，最簡，易于組織生產(chǎn)綠色工藝：三廢，廢水、氣、渣351.5 制藥工業(yè)的發(fā)展36一 全球制藥工業(yè)的發(fā)展 制藥工業(yè)（pharmac

17、eutical industry）的歷史大約70多年，但一開始就發(fā)展很快，目前全世界制藥企業(yè)超過10000家，生產(chǎn)制造5000多種藥物，其中約100家為跨國公司。20世紀(jì)初所用藥物只有四種：洋地黃用于治療各種心血管疾病，奎寧用于治療瘧疾，吐根屬植物提取物（活性成分為生物堿）用于治療痢疾，水銀用于治療梅毒，但當(dāng)時(shí)缺乏安全性和有效性。 20世紀(jì)70年代以后，出現(xiàn)現(xiàn)代生物技術(shù)制藥公司。目前，全世界生物技術(shù)公司4400多家，主要集中在歐美，美國1444家，歐洲1815家，加拿大472家，亞太地區(qū)685家。年產(chǎn)值超過10億美元的生物技術(shù)公司有20余家。 37世界制藥行業(yè)具有以下特征并購風(fēng)云不斷，重組形成

18、更大集團(tuán)，強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)合優(yōu)勢互補(bǔ)，戰(zhàn)略性驅(qū)動(dòng)，企業(yè)經(jīng)營的專業(yè)化，企業(yè)間的合作。并購數(shù)量增加，藥品生產(chǎn)的集中度不斷提高。研發(fā)費(fèi)用持續(xù)上升，投入繼續(xù)增大，國際10大制藥公司的年均投入占銷售額的16左右。1個(gè)新藥的研發(fā)費(fèi)用約810億美元，但新藥批準(zhǔn)上市的數(shù)目在下降。研發(fā)的難度越來越大，新產(chǎn)品是行業(yè)的希望。重磅炸彈藥物數(shù)目持續(xù)增加，從1995年到2004年，增長了近4倍?？鐕靖嘁蕾囉谥匕跽◤椝幬?，是企業(yè)的主要利潤來源。生物技術(shù)藥物異軍突起。20世紀(jì)80年代以前是治療性藥物，20世紀(jì)90年代是改善生命質(zhì)量的藥物，而進(jìn)入21世紀(jì)，將是靶向的蛋白質(zhì)、多肽和核酸類治療性藥物。 38二 我國制藥工業(yè)發(fā)展 中國制

19、藥工業(yè)的發(fā)展經(jīng)歷了從藥店到廠房，再到現(xiàn)代化企業(yè)和集團(tuán)的過程。20世紀(jì)2030年代，上海、廣州是我國近代制藥工業(yè)的發(fā)祥地，但制藥工業(yè)十分落后。1949年新中國成立初期，重視醫(yī)藥工業(yè)的發(fā)展，確定了“以發(fā)展原料藥為主”的方針。同時(shí)，積極發(fā)展藥物制劑生產(chǎn)。1951年試制出第一批結(jié)晶青霉素，1958年，以生產(chǎn)抗生素為主的華北制藥廠建成投產(chǎn)；至1959年，中國建立起化學(xué)制藥工業(yè)。 20世紀(jì)80年代后，走上了按正規(guī)制藥工業(yè)管理和發(fā)展的道路。 391.6 制藥技術(shù)展望40制藥行業(yè)是一個(gè)集約化、國際化程度極高的產(chǎn)業(yè)。國外公司在中國設(shè)立研發(fā)機(jī)構(gòu)，并把生產(chǎn)制造中心向中國轉(zhuǎn)移?！笆晃濉睍r(shí)期乃至更長時(shí)間我國醫(yī)藥市場需

20、求將繼續(xù)保持旺盛勢頭。中國醫(yī)藥市場今后5年內(nèi)將以1520的速度發(fā)展，到2010年將達(dá)到240億美元，成為繼美國、日本、德國和法國之后的世界第5大醫(yī)藥市場，2020年將達(dá)到1200億美元，超過美國成為全球第一大市場。從制藥業(yè)各子行業(yè)看，未來510年期間，我國醫(yī)藥市場將繼續(xù)保持以化學(xué)藥為主，生物技術(shù)制藥已經(jīng)成為制藥行業(yè)的新領(lǐng)域，天然提取制藥有很大發(fā)展空間。 主要途徑為：創(chuàng)新藥物研究、抗體工程制藥技術(shù)、制藥工藝新技術(shù)及其改造。41創(chuàng)新藥物研究 加大制藥的科研開發(fā)投入，研究并擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的藥物和技術(shù)。我國現(xiàn)有常用西藥4 000多種，其中97屬于仿制國外產(chǎn)品或進(jìn)口藥。采用組合生物化學(xué)、生物分子芯片、

21、細(xì)胞組織和動(dòng)物模型等高通量的方法篩選天然藥物，發(fā)現(xiàn)新型治療藥物。利用人類基因組和蛋白質(zhì)組以及病原生物體的基因組的最新成果，計(jì)算機(jī)技術(shù)，把生物信息學(xué)、分子生物學(xué)、基礎(chǔ)醫(yī)藥學(xué)、藥物化學(xué)、藥理學(xué)等的技術(shù)綜合起來，通過突變、生物展示、嵌合、質(zhì)譜分析等，進(jìn)行新型藥物的輔助設(shè)計(jì)和藥物篩選，獲得創(chuàng)新性藥物。 通過基因工程技術(shù)，改變重組蛋白類藥物的結(jié)構(gòu)，從而增強(qiáng)活性，延長體內(nèi)的半衰期。 利用生物分子修飾化學(xué)藥物。如利用人白蛋白制成的納米顆粒結(jié)合紫杉醇注射制劑，代替?zhèn)鹘y(tǒng)的紫杉醇制劑可避免過敏反應(yīng)，加強(qiáng)了紫杉醇的臨床效果和安全性。42抗體工程制藥技術(shù) FDA批準(zhǔn)上市的生物藥物中，抗體類藥物所占比例越來越大，200

22、4 年有11 個(gè)，3個(gè)為全新藥物，其它為新適應(yīng)癥。抗體類藥物一上市就成為年銷售額逾億美元的重磅炸彈藥 (blockbuster drug)。基于單克隆抗體的治療劑主要的應(yīng)用領(lǐng)域是癌癥，上市的抗體藥物一半都在營利。預(yù)計(jì)單抗藥物的全球銷售額將從2004年的50多億美元增至2010年的150億美元，平均年增長30%。 43制藥工藝新技術(shù)及其改造 應(yīng)用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)改造我國傳統(tǒng)的醫(yī)藥工業(yè)，使我國制藥行業(yè)的經(jīng)濟(jì)實(shí)現(xiàn)由速度型向效益型、由粗放型向集約型的根本轉(zhuǎn)變，用先進(jìn)的制造技術(shù)進(jìn)行藥物生產(chǎn)。研究適用于大規(guī)模藥物生產(chǎn)的動(dòng)植物和微生物表達(dá)系統(tǒng)，提高藥物生產(chǎn)效率的新途徑。大力開發(fā)手性藥物及外消旋藥物的手性轉(zhuǎn)化。加

23、強(qiáng)環(huán)境保護(hù)與質(zhì)量意識。 44本章結(jié)束45第2章 微生物發(fā)酵制藥工藝46本章內(nèi)容2.1 微生物發(fā)酵與制藥2.2 制藥微生物生長與生產(chǎn)關(guān)系2.3 制藥微生物菌種的建立2.4 培養(yǎng)基制備2.5 滅菌工藝2.6 微生物發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)2.7 發(fā)酵工藝過程的控制2.8 抗生素生產(chǎn)工藝2.9 氨基酸發(fā)酵生產(chǎn)工藝2.10 維生素生產(chǎn)工藝472.1 微生物發(fā)酵與制藥48一 發(fā)酵概念發(fā)酵概念：通過微生物培養(yǎng)而獲得產(chǎn)物的過程。發(fā)酵種類：用產(chǎn)品說明，冠以產(chǎn)物名而成，如青霉素發(fā)酵，維生素發(fā)酵；發(fā)酵工程按需氧分為好氧發(fā)酵和厭氧發(fā)酵。 初級代謝產(chǎn)物：在初級代謝過程中形成的產(chǎn)物，包括各種小分子前體、單體和多糖、蛋白質(zhì)、脂肪、核

24、酸等。生長所必須的。幾乎所有生物初級代謝基本相同。氨基酸，核苷酸，有機(jī)酸。次級代謝產(chǎn)物：比較復(fù)雜的化合物，不是細(xì)胞生長必需的，對生命活動(dòng)有意義（抗逆境條件）?？股?，毒素，色素。49發(fā)酵制藥種類微生物菌體發(fā)酵微生物菌體發(fā)酵是以獲得微生物菌體為目的，如：面包的酵母發(fā)酵、單細(xì)胞蛋白發(fā)酵（利用各種碳源）、真菌類（各種蘑菇、冬蟲夏草）、生物防治劑（蘇云金桿菌，伴孢晶體可以毒殺鱗翅目、雙翅目害蟲）。微生物酶發(fā)酵微生物酶發(fā)酵是以獲得酶為目的的發(fā)酵，如青霉素?；福糜诎牒铣汕嗝顾貢r(shí)，制備中間體6氨基青霉烷酸。微生物代謝產(chǎn)物發(fā)酵初級代謝產(chǎn)物：氨基酸，核苷酸，維生素，有機(jī)酸。次級代謝產(chǎn)物：最主要的是抗生素。微

25、生物轉(zhuǎn)化發(fā)酵利用微生物的一種或多種酶把一種化合物轉(zhuǎn)變?yōu)榻Y(jié)構(gòu)相關(guān)的更有價(jià)值的產(chǎn)物的生化反應(yīng)為轉(zhuǎn)化發(fā)酵。 50制藥微生物的種類 生產(chǎn)藥物的天然微生物主要包括細(xì)菌、放線菌和絲狀真菌三大類。細(xì)菌主要生產(chǎn)環(huán)狀或鏈狀多肽類抗生素，如芽孢桿菌(Bacillus)產(chǎn)生桿菌肽（bacitracin），多黏芽孢桿菌（Bacillus polymyxa）產(chǎn)生黏菌肽（colistin）和多黏菌素（polymyxin）。細(xì)菌還可以產(chǎn)生氨基酸和維生素，如黃色短桿菌（Brevibacterium flarum）產(chǎn)生谷氨酸，大小菌生產(chǎn)維生素C。放線菌主要產(chǎn)生各類抗生素，以鏈霉菌屬最多，諾卡菌屬較少，還有小單孢菌屬。生產(chǎn)的抗生

26、素主要有氨基糖苷類（鏈霉素、新霉素、卡那霉素等）、四環(huán)類（四環(huán)素、金霉素、土霉素等）、放線菌素類（放線菌素D）大環(huán)內(nèi)酯類（紅霉素、螺旋霉素、柱晶白霉素）和多烯大環(huán)內(nèi)酯類（制霉菌素、抗滴蟲霉素等）。酸性、堿性和中性，但以堿性為多。真菌的曲菌屬產(chǎn)生桔霉素，青霉素菌屬產(chǎn)生青霉素和灰黃霉素等，頭孢菌屬產(chǎn)生頭孢霉素等。脂環(huán)芳香類或簡單的氧雜環(huán)類，多為酸性化合物。 51發(fā)酵制藥的基本過程 菌種選育發(fā)酵工段提煉工段成品工段孢子制備種子制備發(fā)酵控制預(yù)處理分離提取濃縮純化成品工段包裝原料藥實(shí)驗(yàn)室、種子庫發(fā)酵車間提煉車間包裝車間522.3 制藥微生物菌種的建立53新藥生產(chǎn)菌的選育 自然分離 自然選育 誘變育種 雜

27、交育種 基因工程技術(shù)育種 基因組shuffling技術(shù) 542.8 抗生素生產(chǎn)工藝以青霉素為例55一 概述發(fā)現(xiàn)1929: Fleming在葡萄球菌培養(yǎng)皿中，污染的霉菌周圍出現(xiàn)透明的抑菌圈。殺菌物質(zhì)，斷言太不穩(wěn)定，無法分離并用作藥物。1939：牛津病理家Howard Florey化學(xué)家Ernst Chain,Norman Heatley。發(fā)酵瓶培養(yǎng)霉菌，培養(yǎng)里提取，測活性，青霉素結(jié)晶。56發(fā)展1940：8只鼠注射鏈球菌，提取物對4只治療。未經(jīng)治療鼠在24小時(shí)內(nèi)死亡，治療鼠存活數(shù)天至數(shù)周。1941年2月開始治療第一批人類病人。1943：威斯康辛大學(xué)小組，取得突破生產(chǎn)菌表面培養(yǎng)：幾十個(gè)單位。深層培養(yǎng)

28、產(chǎn)黃青霉：100U/ml。X、UV誘變育種：10001500U/ml。不產(chǎn)色素變種：6600070000U/ml目前：85000U/ml。57概述作用機(jī)理細(xì)胞壁合成中的肽多糖合成的第三階段肽多糖的D-丙氨酰-D-丙氨酸二肽類似物競爭性與轉(zhuǎn)肽酶結(jié)合，使轉(zhuǎn)肽酶不能催化多肽鏈之間的交聯(lián)。生長中的細(xì)胞有效，靜止細(xì)胞無效高效、安全的抗細(xì)菌感染藥物58概述應(yīng)用臨床抗感染治療：大多數(shù)革蘭氏陽性菌和某些革蘭氏陰性細(xì)菌及螺旋體等。毒性小，但需要皮試。各種半合成抗生素的原料：氨芐青霉素，磺芐青霉素，乙氧萘青霉素頭孢菌素母核。59二 青霉素生產(chǎn)菌的生物學(xué)特性 產(chǎn)黃青霉：Penicillium chrosogenum

29、孢子:綠色和黃色菌落：平坦或皺褶，圓形。青霉穗:分生孢子鏈狀深層培養(yǎng)菌絲：球狀和絲狀兩種。60發(fā)酵條件下的生長過程 第1期：分生孢子萌發(fā)，形成芽管，原生質(zhì)未分化，具有小泡。第2期：菌絲繁殖，原生質(zhì)體具有嗜堿性，類脂肪小顆粒。第3期：形成脂肪包涵體，機(jī)理貯藏物，沒有空泡，嗜堿性很強(qiáng)。第4期：脂肪包涵體形成小滴并減少，中小空泡，原生質(zhì)體嗜堿性減弱，開始產(chǎn)生抗生素。第5期：形成大空泡，有中性染色大顆粒，菌絲呈桶狀，脂肪包涵體消失，青霉素產(chǎn)量最高。第6期：出現(xiàn)個(gè)別自溶細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)無顆粒，仍然桶狀。釋放游離氨，pH上升。第7期：菌絲完全自溶，僅有空細(xì)胞壁。 61鏡檢規(guī)定時(shí)間取樣，顯微鏡觀察7個(gè)時(shí)期的形態(tài)

30、變化，控制發(fā)酵。14期為菌絲生長期，3期的菌體適宜為種子。45期為生產(chǎn)期，生產(chǎn)能力最強(qiáng)，通過工程措施，延長此期，獲得高產(chǎn)。在第六期到來之前結(jié)束發(fā)酵。 62三 發(fā)酵工藝過程631 生產(chǎn)孢子制備工斜面種子：砂土孢子用甘油、葡萄糖、蛋白胨組成的固體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。米孢子：移植到小米或大米固體培養(yǎng)基上，生長7天，25。注意：每批孢子必需進(jìn)行嚴(yán)格搖瓶試驗(yàn)，測定效價(jià)及雜菌情況。642 種子罐培養(yǎng)工藝一級種子發(fā)酵：發(fā)芽罐，孢子萌發(fā)，形成菌絲。培養(yǎng)基：葡萄糖，玉米漿，碳酸鈣，玉米油，消沫劑等?？諝饬髁?：3（體積比）；300-350rpm；pH自然，溫度271, 40h二級種子罐：繁殖罐，大量繁殖。接種量10

31、培養(yǎng)基：葡萄糖、玉米漿，玉米油，消沫劑等。1:1-1.5；250-280rpm；pH自然，251。10-14h質(zhì)量：菌絲致密，菌絲粗壯，III期，倍增期6-8h653 生產(chǎn)罐培養(yǎng)工藝三級罐：生產(chǎn)罐；接種量20。培養(yǎng)基：花生餅粉，葡萄糖，尿素，硝酸銨，硫代硫酸鈉，苯乙酰胺，CaCO3, 玉米油, 硅油。參數(shù)條件：通氣量1：0.8-1.2；150-200r/min；前60小時(shí):pH6.4-6.6，26；60小時(shí)后: pH6.7, 24。664 發(fā)酵培養(yǎng)與過程控制操作方式：反復(fù)分批式發(fā)酵。發(fā)酵罐：100M3，裝料80M3。帶放: 6-10次，帶放量10，間隔24h。發(fā)酵周期：180-220h。67（

32、1）過程控制補(bǔ)料分批操作控制基質(zhì)濃度前40小時(shí)：培養(yǎng)基中的主要營養(yǎng)物40小時(shí)后：低速連續(xù)補(bǔ)加葡萄糖、氮源和苯乙酸等，維持一定的最適濃度。半饑餓狀態(tài)：延長合成期，提高產(chǎn)量。碳源占成本12以上，采用糖化液流加,降低成本。糖與6APA結(jié)合形成糖基-6APA，影響青霉素產(chǎn)量。68流加碳源控制根據(jù)殘?zhí)?、pH、尾氣中CO2和O2含量。葡萄糖的波動(dòng)范圍較窄，濃度過低使抗生素合成速度減慢或停止，過高則導(dǎo)致呼吸活性下降，甚至引起自溶。殘?zhí)?.3-0.6左右，pH開始升高時(shí)流加糖。濃度：500kg/m3，流速:1.0-2.5kg/m3h。69流加氮源控制玉米漿: 最好，含有多種氨基酸及其前體苯乙酸和衍生物。補(bǔ)加無

33、機(jī)氮源：硫酸銨、氨水、尿素。氨基氮濃度：0.01-0.05%。70鹽離子控制無機(jī)鹽：硫、磷、鎂、鉀等。鐵對青霉素合成有毒，30-40 ug/ml以下。罐壁涂環(huán)氧樹脂保護(hù)層。71（2）添加青霉素側(cè)鏈前體時(shí)期：合成階段。種類：苯乙酸及其衍生物，苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸。毒性：抑制細(xì)胞生長和青霉素合成。策略：低濃度流加。濃度：苯乙酸0.1%，苯乙酰胺0.05-0.08%。控制：保持供應(yīng)速率略大于生物合成需要。72提高產(chǎn)量的其他物質(zhì)流加表面活性劑：新潔爾滅、聚氧乙烯、山梨糖醇酐、單油酸酯、單月桂酸酯、三油酸酯可溶性高分子化合物：聚乙烯醇、聚丙烯酸鈉、聚乙二胺、聚乙烯吡咯烷醇其他：剪切保護(hù)劑；分散

34、劑73（3）溫度控制適宜菌絲生長溫度30，分泌青霉素20。20青霉素破壞少，周期很長。變溫控制，不同階段不同溫度。生長階段:較高溫度，縮短生長時(shí)間；生產(chǎn)階段適當(dāng)降低溫度，以利于青霉素合成。前期控制26左右，后期降溫控制24。74（4）pH控制合成適宜pH6.46.6左右，避免超過7.0直接加酸或堿：自動(dòng)控制流加葡萄糖：恒速；變速，依賴pH變化快慢。pH下降：補(bǔ)加CaCO3、通氨、尿素或提高通氣量pH上升：補(bǔ)加糖、生理酸性物質(zhì)（硫酸銨、油脂）75（5）溶氧控制30飽和度，產(chǎn)率急劇下降；10，造成不可逆的損害。臨界溶氧濃度：30。通氣比：1：0.81.5 。適宜的攪拌速度:保證氣液混合，提高溶氧。

35、調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速:各階段的生長和耗氧量不同。76（6）消沫天然油脂：玉米油；化學(xué)消沫劑：泡敵。策略：少量多次。注意：前期不宜多加入，影響呼吸代謝。77四 提煉工藝過程青霉素不穩(wěn)定，遇酸、堿、熱分解失活水溶液中不穩(wěn)定，非極性溶劑中穩(wěn)定易溶于有機(jī)溶劑，水中溶解度很小青霉素鹽很穩(wěn)定；降解產(chǎn)物具有致敏性防止降解，條件溫和、快速。781 預(yù)處理青霉素的存在部位：發(fā)酵液。濃度較低：1030kg/m3。含有大量雜質(zhì)：菌體細(xì)胞、核酸、雜蛋白質(zhì)、細(xì)胞壁多糖等、殘留的培養(yǎng)基、色素、鹽離子、代謝產(chǎn)物等。目的：濃縮目的產(chǎn)物，去除大部分雜質(zhì)，改變發(fā)酵液的流變學(xué)特征，利于后續(xù)的分離純化過程。預(yù)處理:發(fā)酵液加少量絮凝劑沉淀蛋白

36、。792 過濾鼓式真空過濾機(jī)過濾：一次濾液：pH6.2-7.2，略渾，棕黃或綠色，蛋白質(zhì)含量0. 5-2.0%。板框式過濾機(jī)過濾：硫酸調(diào)節(jié)pH4.5-5.0，加入0.07%溴代十五烷吡啶，0.07%硅藻土為助慮劑。二次濾液：澄清透明，用于提?。ㄊ章?0）803、溶劑萃取原理：青霉素游離酸易溶于有機(jī)溶劑，而霉素鹽易溶于水。萃取劑：青霉素分配系數(shù)高的有機(jī)溶劑。工業(yè)上通常用：醋酸丁酯和醋酸戊酯。除去蛋白質(zhì)：加0.05-0.1%乳化劑PPB。萃?。?3次。81逆流萃取過程正相萃?。核峄痯H1.8-2.0，濾液：醋酸丁酯1：0.3，碟片式離心機(jī)分離（濃縮1.5-2.1）反相萃取：pH6.8-7.4（磷酸

37、鹽、碳酸鹽緩沖液）。把青霉素從丁酯中提取到緩沖液中。反復(fù)萃取23次，達(dá)到結(jié)晶要求。萃取條件：10下。萃取罐冷凍鹽水冷卻。824 脫色萃取液中添加活性炭，除去色素。過濾，除去活性炭。835 結(jié)晶直接結(jié)晶加醋酸鈉乙醇溶液反應(yīng)：得到結(jié)晶鈉鹽。加醋酸鉀乙醇溶液：得到青霉素鉀鹽。845 結(jié)晶共沸蒸餾結(jié)晶萃取液，再用0.5 M NaOH萃取pH6.4-6.8下得到鈉鹽水濃縮液。加3-4倍體積丁醇，16-26，真空0.67-1.3KPa）下蒸餾。水和丁醇形成共沸物而蒸出。鈉鹽結(jié)晶析出。結(jié)晶經(jīng)過洗滌、干燥（60真空16h），磨粉，裝桶，得到青霉素產(chǎn)品。852.9 氨基酸發(fā)酵生產(chǎn)工藝86一 氨基酸類藥物得基本概

38、念氨基酸87氨基酸及其衍生物在醫(yī)藥中的應(yīng)用氨基酸的營養(yǎng)價(jià)值及其與疾病治療的關(guān)系必需氨基酸人和哺乳動(dòng)物自身不能合成，需要由食物供應(yīng)，稱為必需氨基酸。賴氨酸，色氨酸，苯丙氨酸，蛋氨酸，蘇氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸等8種。治療消化道疾病的氨基酸及其衍生物谷氨酸及其鹽酸鹽，谷氨酰胺，乙酰谷酰胺鋁，甘氨酸及其鋁鹽，硫酸甘氨酸鐵，維生素U及組氨酸鹽酸鹽等。治療肝病的氨基酸及其衍生物精氨酸鹽酸鹽，磷葡精氨酸，鳥天氨酸，谷氨酸鈉，蛋氨酸，乙酰蛋氨酸，瓜氨酸，賴氨酸鹽酸鹽，及天冬氨酸等。88治療腦及神經(jīng)系統(tǒng)疾病的氨基酸及其衍生物谷氨酸鈣鹽及鎂鹽，氫溴酸谷氨酸，色氨酸，5羥色氨酸、左旋多巴等。用于腫瘤治療的氨

39、基酸及其衍生物偶氮絲氨酸，氯苯丙氨酸，磷天冬氨酸及重氮氧代正亮氨酸等。其它氨基酸類藥物的臨床應(yīng)用89二 氨基酸類藥物的生產(chǎn)方法1 發(fā)酵法2 水解法3 酶法轉(zhuǎn)化90L異亮氨酸的制備培養(yǎng)液滅菌滅菌培養(yǎng)液菌種培養(yǎng)接種發(fā)酵發(fā)酵液過濾上層液酸化濾液離子交換洗脫液減壓蒸餾濃縮液活性炭脫色濾液減壓濃縮濃縮液氨水中和沉淀水結(jié)晶干燥L(fēng)異亮氨酸成品1 發(fā)酵法91工藝過程1）菌種培養(yǎng)種子培養(yǎng)基組成（）為：葡萄糖2，尿素0.3，玉米漿2.5，豆餅水解液0.1，pH6.5。二級種子培養(yǎng)基加菜籽油，其余同一級種子培養(yǎng)基。一級種子培養(yǎng)：1000ml三角燒瓶中培養(yǎng)基裝量為200ml，接種一環(huán)牛肉膏斜面AS1.998菌種，搖床

40、3016h。二級種子培養(yǎng)：接種量3.5，培養(yǎng)8h。逐級放大。2）滅菌、發(fā)酵發(fā)酵培養(yǎng)液組成（）：硫酸銨4.5，豆餅水解液0.4，玉米漿2.0，碳酸鈣4.5，pH7.2，淀粉水解還原糖粗糖濃度11.5。滅菌，接種1菌種（v/v），攪拌，發(fā)酵。923）除菌體，酸化發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液加熱至100并維持10min，冷卻過濾，濾液加工業(yè)硫酸和草酸至pH3.5，過濾除沉淀。4）離子交換、吸附分離上述濾液每分鐘以樹脂量1.5的流速進(jìn)H型732離子交換柱（40 100cm), 以100L去離子水洗柱，再以60,0.5mol/L氨水按3L/min的流速進(jìn)行洗脫。分部收集洗脫液。5）濃縮趕氨6）脫色、濃縮、中和7）

41、精制，烘干931 水解法（一）基本原理蛋白質(zhì)水解方法酸水解法、堿水解法、酶水解法氨基酸分離方法溶解度法、特殊試劑沉淀法、吸附法、離子交換法氨基酸精制方法結(jié)晶，重結(jié)晶94L胱氨酸的制備：人發(fā)或豬毛水解液L半胱氨酸粗品濾液L半胱氨酸粗品濾液L半胱氨酸鹽酸水解氫氧化鈉中和鹽酸，活性炭氫氧化鈉中和鹽酸，活性炭中和，氨水水解法舉例95延胡索酸NH3固定化天冬氨酸酶轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化液LAsp粗品分離L-Asp精品轉(zhuǎn)化液固定化LAsp脫羧酶濃縮結(jié)晶LAla粗品LAla精品精制3 酶法轉(zhuǎn)化天冬氨酸和丙氨酸的制備96工藝過程1）菌種培養(yǎng)大腸桿菌（E. coli） AS 1.881 的培養(yǎng)斜面培養(yǎng)基為普通肉汁培養(yǎng)基搖瓶培

42、養(yǎng)基成分（）：玉米漿7.5，反丁烯二酸2.0，硫酸鎂（7水）0.02，氨水調(diào)pH6.0，煮沸后過濾，500ml三角燒瓶中裝液量50-100ml。從新鮮斜面上或液體中培養(yǎng)種子，接種子于搖瓶培養(yǎng)基中，37振搖培養(yǎng)24h，逐級擴(kuò)大培養(yǎng)至10002000ml規(guī)模。培養(yǎng)結(jié)束后用1mol/L HCl調(diào)pH5.0，升溫至45并保溫1h，冷卻至室溫，離心收集菌體。德阿昆哈假單胞（Pseudomonas dacunhae）68變異株的培養(yǎng)斜面培養(yǎng)基組成（）為蛋白胨0.25，牛肉膏0.52，酵母膏0.25，NaCl0.5，pH7.0，瓊脂2.0。種子培養(yǎng)基與斜面培養(yǎng)基，不加瓊脂，250ml三角燒瓶中培養(yǎng)基裝量40

43、ml。搖瓶培養(yǎng)基組成（）為L谷氨酸3.0，蛋白胨，酪蛋白水解液0.5，磷酸二氫鉀0.05，MgSO4.7H2O 0.01，用氨水調(diào)pH7.2，500ml三角燒瓶中培養(yǎng)基裝量為80ml。將培養(yǎng)24h的新鮮斜面菌種接種于種子培養(yǎng)基中，30振搖培養(yǎng)8h，再接種于搖瓶培養(yǎng)基中， 30振搖培養(yǎng)24h，逐級放大。972）細(xì)胞固定化E coli的細(xì)胞固定化取濕菌體20kg，懸浮于生理鹽水中，保溫至40，再加入90L保溫至40的12明膠溶液及10L1.0戊二醛溶液，充分?jǐn)嚢杈鶆颍胖美鋮s凝固，再浸入0.25戊二醛溶液中。于5過夜后，切成35mm的立體小方塊，浸入0.25戊二醛溶液5過夜，蒸餾水充分洗滌，濾干得

44、含天冬氨酸酶得固定化。假單胞菌體固定取濕菌體20kg，加生理鹽水?dāng)嚢柚料♂屩?0L，另取溶于生理鹽水的5角叉菜膠溶液85L，兩液均保溫至45后混合，冷卻至5成膠。浸于600L2KCl和0.2mol/L已二胺的0.5mol/L pH7.0的磷酸緩沖液中，5下攪拌10min，加戊二醛至0.6mol/L濃度， 5攪拌30min，取出切成35mm的立體方塊，用2KCl溶液充分洗滌后，濾去洗滌液，即得固定化脫羧細(xì)胞。983）生物反應(yīng)堆的制備4）轉(zhuǎn)化反應(yīng)5）產(chǎn)品純化與精制99L脯氨酸4 化學(xué)合成法100L谷氨酸乙醇硫酸三乙胺L谷氨酸乙酯KBH4還原LPro反應(yīng)液五氯酚沉淀氨水解析濾液活性炭濾液乙醚固形物精

45、制L脯氨酸成品1012.10 維生素生產(chǎn)工藝102一 概述 維生素是一類生物生長發(fā)育起調(diào)節(jié)作用的、化學(xué)結(jié)構(gòu)不同的、小分子有機(jī)化合物，人體內(nèi)不能合成，必須從食物等中攝取。人體需求量很少，但不足時(shí)，出現(xiàn)相應(yīng)的缺乏癥。已知維生素13種，根據(jù)溶解性，一般分為水溶性和脂溶性維生素兩類。主要維生素的生產(chǎn)有三種方法。2002年我國維生素原料產(chǎn)量達(dá)8.2萬噸，其中維生素C超過5萬噸，成為世界上最大的原料藥生產(chǎn)國和出口國。維生素制劑年產(chǎn)量260280億支/片/瓶，以片劑、注射液和膠囊為主。 1032 維生素C生產(chǎn)工藝 目前，工業(yè)上生產(chǎn)維生素C采用二步發(fā)酵法，此法是在1975年由中國科學(xué)院上海生物技術(shù)研究所研究出

46、來的，屬我國首創(chuàng)。發(fā)酵法生產(chǎn)維生素C可以分為發(fā)酵、提取和轉(zhuǎn)化三大步驟。即先從D-山梨醇發(fā)酵，提取出維生素C前體2-酮基-L-古龍酸，再用化學(xué)法轉(zhuǎn)化為維生素C。第一步發(fā)酵黑醋酸菌（Acetobacter suboxydans）經(jīng)種子擴(kuò)大培養(yǎng)，接入發(fā)酵罐，種子和發(fā)酵培養(yǎng)基主要包括山梨醇、玉米漿、酵母膏、碳酸鈣等成份，pH 5.05.2。醇濃度控制在2427%，培養(yǎng)溫度2930 ，發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液經(jīng)低溫滅菌，移入第二步發(fā)酵罐作原料。D-山梨醇轉(zhuǎn)化L-山梨糖的生物轉(zhuǎn)化率達(dá)98%以上。104第二步發(fā)酵氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacter oxydans，小菌)和巨大芽孢桿菌(Bacillus

47、megaterium，大菌)混合培養(yǎng)。生產(chǎn)維生素C的發(fā)酵罐均在100 m3以上，瘦長型，無機(jī)械攪拌，采用氣升式攪拌。種子和發(fā)酵培養(yǎng)基的成份類似,主要有L-山梨糖、玉米漿、尿素、碳酸鈣、磷酸二氫鉀等，pH 值為7.0。大、小菌經(jīng)二級種子擴(kuò)大培養(yǎng)，接入含有第一步發(fā)酵液的發(fā)酵罐中，2930 下通入大量無菌空氣攪拌，培養(yǎng)72h左右結(jié)束發(fā)酵，L-山梨糖生成2-酮基-L-古龍酸的轉(zhuǎn)化率可達(dá)7085%。 2-酮基-L-古龍酸的分離提純經(jīng)二步發(fā)酵法兩次發(fā)酵以后，發(fā)酵液中僅含8%左右的2-酮基-L-古龍酸，且殘留菌絲體、蛋白質(zhì)和懸浮的固體顆粒等雜質(zhì)，常采用加熱沉淀法、化學(xué)凝聚法、超濾法分離提純。傳統(tǒng)工藝是加熱沉

48、淀法，發(fā)酵液經(jīng)靜置沉降后通過732氫型離子交換樹脂柱，調(diào)節(jié)pH至蛋白質(zhì)等電點(diǎn)，并加熱使蛋白質(zhì)凝固，然后用高速離心機(jī)分離出菌絲、蛋白和微粒，清液再次通過陽離子交換柱，酸化為2-酮基-L-古龍酸的水溶液，濃縮結(jié)晶后得到2-酮基-L-古龍酸。 1052-酮基-L-古龍酸的化學(xué)轉(zhuǎn)化將維生素C前體2-酮基-L-古龍酸轉(zhuǎn)化為維生素C，常采用堿轉(zhuǎn)化法。2-酮基-L-古龍酸在甲醇中用濃硫酸催化酯化生成2-酮基-L-古龍酸甲酯，加NaHCO3轉(zhuǎn)化生成維生素C鈉鹽，經(jīng)氫型離子交換樹脂酸化得到維生素C。粗品經(jīng)結(jié)晶精制得維生素C成品。1063 維生素B2生產(chǎn)工藝維生素B2（vitamin B2）又稱核黃素(ribof

49、lavin)，國內(nèi)約有l(wèi)0家核黃素生產(chǎn)商。目前國內(nèi)外廣泛采用微生物發(fā)酵法工業(yè)生產(chǎn)維生素B2。能夠產(chǎn)生維生素B2 的微生物有細(xì)菌、真菌和霉菌，工業(yè)生產(chǎn)中主要以阿舒假囊酵母(Eremotherecium ashbyii)為生產(chǎn)菌種。維生素B2 的工業(yè)發(fā)酵一般為二級發(fā)酵，發(fā)酵液先沉淀再氧化進(jìn)行分離提純。 107發(fā)酵培養(yǎng)基中以植物油、葡萄糖、糖蜜或大米等作為主要碳源，植物油中以豆油對維生素B2產(chǎn)量的促進(jìn)效果最為顯著,有機(jī)氮源以蛋白胨、骨膠、魚粉、玉米漿為主，無機(jī)鹽有NaCl、K2HPO4、MgSO4。種子擴(kuò)大培養(yǎng)和發(fā)酵的通氣量要求均比較高，通氣比一般在1.0，罐壓0.05 MPa左右，攪拌功率要求比較

50、高。阿舒假囊酵母的最適生長溫度在2830 ，種子培養(yǎng)3438h后接入發(fā)酵罐，發(fā)酵培養(yǎng)40h后開始連續(xù)流加補(bǔ)糖，發(fā)酵液的pH值控制在5.46.2,發(fā)酵周期為150160h。維生素B2的產(chǎn)量在50 g/L左右。維生素B2的分離提取與純化發(fā)酵液酸化后加熱,然后加入黃血鹽、硫酸鋅沉淀蛋白，過濾后濾液調(diào)pH 1.52.0酸化，靜置2040h沉淀，壓濾后將沉淀物酸溶，加入硝酸銨，氧化抽提，氧化液經(jīng)結(jié)晶、過濾后，濕晶在80 以下干燥20h，得到維生素B2成品。 108本章結(jié)束109第3章 基因工程制藥工藝110本章內(nèi)容3.1 基因工程制藥微生物表達(dá)系統(tǒng)3.2 基因工程大腸桿菌的構(gòu)建技術(shù)3.3 基因工程菌的發(fā)

51、酵培養(yǎng)與控制3.4 重組人干擾素生產(chǎn)工藝1113.1 基因工程制藥微生物表達(dá)系統(tǒng)112基因工程菌：微生物為操作對象，通過基因工程技術(shù)獲得的表達(dá)外源基因或過量或抑制表達(dá)自身基因的工程生物體。種類：細(xì)菌和酵母是重要的表達(dá)重組藥物的制藥生物。113一 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)1 大腸桿菌（Eschericlia coli）形態(tài)特征細(xì)胞：G，單細(xì)胞，桿狀。鞭毛，無芽孢，一般無莢膜。裂殖。菌落:白色至黃白色，光滑，直徑23mm。1142 生化與遺傳特性能在僅有碳水化合物和氮、磷及微量元素的無機(jī)鹽的極限培養(yǎng)基上生長，發(fā)酵糖，產(chǎn)氣產(chǎn)酸?；蚬こ讨惺褂镁辏篕12株的衍生菌株?；蚪M：4.6 Mb，3000多種蛋白質(zhì)

52、。染色體DNA為環(huán)狀雙鏈，核外遺傳物質(zhì)為質(zhì)粒。1153 質(zhì)粒載體復(fù)制起始點(diǎn)選擇標(biāo)記多克隆位點(diǎn)116質(zhì)粒類型嚴(yán)緊型質(zhì)粒：在每個(gè)宿主細(xì)胞只能復(fù)制少數(shù)幾個(gè)拷貝的質(zhì)粒，pSC101；松弛型質(zhì)粒：在每個(gè)細(xì)胞中能復(fù)制幾十至幾百個(gè)拷貝數(shù)的質(zhì)粒，pMB1和colE1；克隆質(zhì)粒：用于克隆和擴(kuò)增外源基因；測序質(zhì)粒：用于基因測序；整合質(zhì)粒：用于外源基因與宿主染色體整合；穿梭質(zhì)粒：能在兩種宿主細(xì)胞存在；表達(dá)質(zhì)粒：能表達(dá)基因產(chǎn)物1174 產(chǎn)物表達(dá)形式不溶性蛋白質(zhì)：細(xì)胞質(zhì)內(nèi)形成包涵體；可溶性蛋白質(zhì)：存在于細(xì)胞質(zhì)；周質(zhì)表達(dá)：外源蛋白被運(yùn)輸分泌到周質(zhì)，可溶性。有利于分離和減少蛋白酶降解，避免N端附加蛋氨酸；胞外分泌表達(dá)：胞內(nèi)

53、可溶性蛋白質(zhì)分泌到胞外的培養(yǎng)液中。1185 優(yōu)點(diǎn)和不足發(fā)展最早、應(yīng)用最廣泛的經(jīng)典的表達(dá)系統(tǒng)。具有遺傳背景清楚、目標(biāo)基因表達(dá)水平高（高達(dá)70），培養(yǎng)周期短，抗污染能力強(qiáng)。不能用于加工修飾化（糖基化、酰胺化）蛋白表達(dá)。細(xì)胞死亡后，細(xì)胞壁脂多糖游離出來，形成內(nèi)毒素，具有抗原性，產(chǎn)生熱源。N端增加的蛋氨酸也容易引起免疫反應(yīng)。1196 應(yīng)用大量外源基因能超量的表達(dá)，18種藥物上市。多肽類2種（甲狀旁腺激素(1-34)、利尿鈉肽）激素：胰島素及2種突變體、8種生長素(1種PEG化)細(xì)胞因子類：5種干擾素（1種PEG化）、干擾素和，2種G-CSF(1種PEG化)，白介素-2、白介素-11、白介素-1拮抗劑溶

54、栓酶類：rPA白喉毒素-IL 2融合蛋白、OspA脂蛋白（疫苗）等。120二 酵母表達(dá)系統(tǒng)1 形態(tài)特征細(xì)胞：單細(xì)胞真核生物，球形、橢圓形、卵形。繁殖：芽殖、裂殖。在特定條件下才產(chǎn)生子囊孢子。菌落：乳白色，有光澤，邊沿整齊。1212 生長與遺傳特征孢子萌發(fā)產(chǎn)生單倍體細(xì)胞，兩個(gè)性別不同的單倍體細(xì)胞結(jié)合形成二倍體接合子或營養(yǎng)細(xì)胞，進(jìn)行芽殖。能發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、半乳糖等。生長繁殖迅速，倍增期約2小時(shí)。釀酒酵母有17條染色體1996年完成其全基因組測序，遺傳背景已相當(dāng)清楚?；蚪M：120.68Mb，5887個(gè)ORF，編碼約6000個(gè)基因。1223 優(yōu)點(diǎn)與不足優(yōu)點(diǎn)五種類型的載體，安全、無毒。營養(yǎng)缺

55、陷選擇外來質(zhì)粒。培養(yǎng)條件簡單、大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)成熟。亞細(xì)胞器分化，進(jìn)行蛋白質(zhì)的翻譯后正確修飾和加工，并具有良好的蛋白質(zhì)分泌能力。缺點(diǎn)釀酒酵母發(fā)酵產(chǎn)生乙醇，制約了高密度發(fā)酵。修飾的蛋白質(zhì)糖基化側(cè)鏈過長，會(huì)引起副作用。1234 應(yīng)用1981年Hitzman等：酵母表達(dá)人干擾素激素類：6種人胰島素及1種突變體，尿酸水解酶和水蛭素細(xì)胞因子：GM-CSF和血小板衍生生長因子多肽類：高血糖素2種乙肝疫苗等。8種產(chǎn)品1243.2 基因工程大腸桿菌的構(gòu)建技術(shù)125一 工程菌構(gòu)建流程目標(biāo)基因克隆表達(dá)載體構(gòu)建遺傳轉(zhuǎn)化與篩選工程菌PCR、文庫、化學(xué)合成酶切、連接外源基因?qū)肱c培養(yǎng)126二 表達(dá)載體構(gòu)建表達(dá)載體設(shè)計(jì)目標(biāo)

56、基因的定位克隆酶切反應(yīng)連接反應(yīng)轉(zhuǎn)化篩選與鑒定127三 基因工程菌的建立過程適宜宿主菌的轉(zhuǎn)化篩選鑒定，遺傳穩(wěn)定性等。目標(biāo)獲得質(zhì)粒能穩(wěn)定遺傳、基因能高效和定向表達(dá)的載體，確保藥物的生物活性。128表達(dá)篩選與產(chǎn)物鑒定不同菌種的表達(dá)篩選誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間和誘導(dǎo)強(qiáng)度的篩選產(chǎn)物存在形式和存在場所的鑒定表達(dá)部位胞外，周質(zhì)，胞內(nèi)；包涵體，可溶性蛋白表達(dá)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)與活性鑒定電泳，SDSPAGE，等電點(diǎn)電泳免疫雜交，末端測序，質(zhì)譜分析分析與目標(biāo)產(chǎn)物的同一性1293.3 基因工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)與控制130一 培養(yǎng)基組成與控制碳源氮源無機(jī)鹽選擇劑誘導(dǎo)物1311 碳源大腸桿菌：蛋白胨等蛋白質(zhì)的降解物作為碳源；酵母：利用葡萄糖、半

57、乳糖等單糖類物質(zhì)。添加低濃度的單糖和雙糖及其他有機(jī)物如甘油等對菌體生長具有一定的促進(jìn)作用。濃度稍高后就表現(xiàn)出底物抑制作用。葡萄糖優(yōu)先利用會(huì)造成培養(yǎng)基的酸化。1322 氮源直接很好地吸收利用銨鹽等，一般不能利用硝態(tài)氮。幾乎都能利用有機(jī)氮源。不同工程菌對氮源利用能力差異很大，具有很高的選擇性。大腸桿菌：利用大分子有機(jī)氮源，酵母粉等。酵母：利用氨基酸為氮源1333、無機(jī)鹽磷、硫、鉀、鈣、鎂、鈉等大量元素和鐵、銅、鋅、錳、鉬等微量元素的鹽離子形態(tài)基因工程菌生長提供必需的礦物質(zhì)。1344 選擇劑selective agent維持工程菌的純正性和質(zhì)粒的穩(wěn)定性的化合物。發(fā)酵培養(yǎng)過程中質(zhì)粒容易丟失，使之成為宿

58、主菌。為了保證質(zhì)粒的穩(wěn)定性、不丟失，根據(jù)質(zhì)粒上的營養(yǎng)缺陷或選擇性標(biāo)記基因，添加或缺陷選擇劑。135選擇劑種類營養(yǎng)缺陷互補(bǔ)和抗生素抗性。工程大腸桿菌：卡那霉素、氨芐青霉素、氯霉素、博來霉素等抗生素作為選擇劑；工程酵母菌：氨基酸營養(yǎng)缺陷型，缺陷亮氨酸、組氨酸、賴氨酸、色氨酸等。1365 誘導(dǎo)物誘導(dǎo)表達(dá)型工程菌：在細(xì)胞生長到一定階段，必需添加誘導(dǎo)物，以解除目標(biāo)基因的抑制狀態(tài)，活化基因，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯，生成產(chǎn)物。誘導(dǎo)物成為產(chǎn)物表達(dá)必不可少的。Lac啟動(dòng)子表達(dá)系統(tǒng)：IPTG誘導(dǎo)。甲基營養(yǎng)型酵母：加入甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)。1376 培養(yǎng)基組成對質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響營養(yǎng)較豐富的培養(yǎng)基，質(zhì)粒穩(wěn)定性高于合成培養(yǎng)基；限制性基

59、質(zhì)對基因工程菌的比生長速率有不同影響；大腸桿菌對葡萄糖和磷酸鹽限制易發(fā)生質(zhì)粒不穩(wěn)定，有一些質(zhì)粒對氮源、鉀、硫等表現(xiàn)不穩(wěn)定；對于酵母，極限培養(yǎng)基比豐富培養(yǎng)基更有利于維持質(zhì)粒穩(wěn)定性；培養(yǎng)基中添加酵母提取物和谷氨酸等有利于提高質(zhì)粒穩(wěn)定性。138二 培養(yǎng)工藝與控制溫度溶解氧pH1391 溫度對工程菌發(fā)酵的影響生長大腸桿菌和釀酒酵母生長最低溫度為10；大腸桿菌生長最適溫度為37，最高溫度為45；釀酒酵母生長最適溫度為30，最高溫度為40。生產(chǎn)生長與生產(chǎn)溫度不一致；較高溫度表達(dá)包涵體，較低溫度下有利于表達(dá)可溶性蛋白質(zhì)；對于熱敏感的蛋白質(zhì)，生產(chǎn)期可采用先高溫，然后低溫，變溫表達(dá)，避免蛋白質(zhì)降解。140溫度控

60、制兩段變溫發(fā)酵培養(yǎng)：前期：較高溫度發(fā)酵，獲得足夠高的菌體密度；后期：較低溫培養(yǎng)發(fā)酵，對菌體合成目標(biāo)產(chǎn)物的抑制不明顯，但可有效抑制目標(biāo)產(chǎn)物的降解和包涵體形成，總體提高工程菌的生產(chǎn)能力。溫度誘導(dǎo)型大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)：生長期維持37，生產(chǎn)期提高溫度42。1412 pH值對發(fā)酵的影響細(xì)菌喜歡偏堿性：大腸桿菌適宜pH為6.57.5，真菌喜歡微酸性：酵母適宜pH為5.06.0。影響產(chǎn)物穩(wěn)定性，最適生長和最適生產(chǎn)pH不同。干擾素是在酸性條件下穩(wěn)定，而在堿性條件下容易降解。酸性環(huán)境有利于發(fā)揮菌株生產(chǎn)能力。乙酸的產(chǎn)生使菌體生長速率下降，也抑制基因表達(dá)。142pH控制了解發(fā)酵過程中各個(gè)階段的適宜pH以后，需要進(jìn)一步