我的-第四章 蛋白質(zhì)工程與食品產(chǎn)業(yè)課件

1、第四章 蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用概述 蛋白質(zhì)是對(duì)生命至關(guān)重要的一類生物大分子物質(zhì)，各種生命功能、生命現(xiàn)象、生命活動(dòng)都和蛋白質(zhì)有關(guān)。在生命有機(jī)體催化、運(yùn)動(dòng)、結(jié)構(gòu)、識(shí)別和調(diào)節(jié)等許多方面，起著關(guān)鍵的作用。酶.幾乎全都是蛋白質(zhì)。肌肉收縮、精子移動(dòng)、細(xì)胞分裂過(guò)程中的染色體移動(dòng)。高等生物的有序生長(zhǎng)和分化過(guò)程?？贵w蛋白能識(shí)別和結(jié)合特異性的外源物質(zhì)，使人體具備抵抗各種細(xì)菌、真菌和病毒的能力。血紅蛋白具有結(jié)合和釋放氧的能力，是血液中氧、二氧化碳和氫離子的攜帶者。另外，人體的毛發(fā)和指甲屬于角蛋白，而血栓是由血纖蛋白單體聚合而成的。蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能1.催化功能：酶2.調(diào)節(jié)功能：激素3.結(jié)構(gòu)功能：皮、毛、骨

2、、牙、細(xì)胞骨架4.運(yùn)輸功能：血紅蛋白5.免疫功能：免疫球蛋白6.運(yùn)動(dòng)功能：鞭毛、肌肉蛋白7.儲(chǔ)藏功能：酪蛋白8.生物膜功能：物質(zhì)運(yùn)輸、神經(jīng)傳導(dǎo)等第一節(jié)、蛋白質(zhì)概述 蛋白質(zhì)分子的生物功能，與蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)密不可分。決定蛋白質(zhì)這種特殊生物功能的關(guān)鍵因素是它的分子構(gòu)象 。肽:氨基酸通過(guò)肽鍵連結(jié)起來(lái)的化合物二肽:兩個(gè)氨基酸形成的肽三肽:三個(gè)氨基酸形成的肽多肽:許多氨基酸形成的肽蛋白質(zhì):大多為100個(gè)以上氨基酸組成的多肽幾個(gè)概念蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu) 二級(jí)結(jié)構(gòu)是指多肽鏈借助于氫鍵沿一維方向排列成具有周期性結(jié)構(gòu)的構(gòu)象，是多肽鏈局部的空間結(jié)構(gòu)（構(gòu)象）。主要形式：-螺旋、-折疊、 -轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)卷曲等蛋白質(zhì)分子的二級(jí)

3、結(jié)構(gòu) 螺旋折疊轉(zhuǎn)角自由回轉(zhuǎn)（1）氫鍵：氫原子與負(fù)電性強(qiáng)的原子（如氧、氮等）間形成。對(duì)蛋白質(zhì)分子三維構(gòu)象的維護(hù)很重要。（2）靜電引力：正負(fù)帶電基團(tuán)之間的吸引力。對(duì)蛋白質(zhì)分子三維構(gòu)象的穩(wěn)定貢獻(xiàn)不是很大，也稱為離子鍵或鹽鍵（3）范德華力：原子團(tuán)相互接近時(shí)誘導(dǎo)所致。它變化多樣，對(duì)維持蛋白質(zhì)活性中心的構(gòu)象影響很大維持蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的化學(xué)鍵（4）疏水相互作用：是非極性基團(tuán)為了避開水相而群集在一起的作用力。疏水作用是維持蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的重要因素。（5）二硫鍵：作用很強(qiáng)，對(duì)穩(wěn)定蛋白質(zhì)構(gòu)象起重要作用。氫鍵、離子鍵、疏水作用和范德華力等次級(jí)鍵是非共價(jià)鍵肽鍵、二硫鍵、酯鍵等被稱之為共價(jià)鍵蛋白質(zhì)工程就是以蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)

4、與功能為基礎(chǔ)，利用基因工程的手段，按照人類自身的需要，定向地改造天然的蛋白質(zhì)，甚至創(chuàng)造新的、自然界本不存在的、具有優(yōu)良特性的蛋白質(zhì)分子。蛋白質(zhì)工程的概念 1983年，美國(guó)生物學(xué)家額爾默首先提出了“蛋白質(zhì)工程”的概念。蛋白質(zhì)工程的實(shí)踐依據(jù)DNA指導(dǎo)合成蛋白質(zhì)，因此，人們可以根據(jù)需要對(duì)負(fù)責(zé)編碼某種蛋白質(zhì)的基因進(jìn)行重新設(shè)計(jì)，使合成出來(lái)的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變得符合人們的要求。蛋白質(zhì)工程主要包括4大類研究：第一，利用已知的蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的信息開發(fā)應(yīng)用研究。第二，定量確定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系。這是目前蛋白質(zhì)工程研究的主體，它包括蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模型的建立，酶催化的性質(zhì)、蛋白質(zhì)折疊和穩(wěn)定性研究等。第三，從混雜變異體

5、庫(kù)中篩選具有特定結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的蛋白質(zhì)。第四，根據(jù)已知結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的蛋白質(zhì)，用人工方法合成及其變異體。蛋白質(zhì)工程與酶工程的關(guān)系 絕大多數(shù)酶都是蛋白質(zhì)，酶工程與蛋白質(zhì)工程有什么區(qū)別？ 酶工程就是指將酶所具有的生物催化作用，借助工程學(xué)的手段，應(yīng)用于生產(chǎn)、生活、醫(yī)療診斷和環(huán)境保護(hù)等方面的一門科學(xué)技術(shù)。概括，酶工程是由酶制劑的生產(chǎn)和應(yīng)用兩方面組成的。酶工程的應(yīng)用主要集中于食品工業(yè)、輕工業(yè)以及醫(yī)藥工業(yè)中。 第二節(jié) 蛋白質(zhì)工程的基本步驟 與改造策略 一、蛋白質(zhì)工程的基本步驟（1）分離純化目的蛋白，使之結(jié)晶,進(jìn)行分析,得到其空間結(jié)構(gòu)的盡可能多的信息。（2）對(duì)目的蛋白的功能作詳盡的研究，確定它的功能域。（3

6、）通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)、空間結(jié)構(gòu)和功能之間的相互關(guān)系分析，找出關(guān)鍵的基團(tuán)和結(jié)構(gòu)。(4)圍繞這些關(guān)鍵的基團(tuán)和結(jié)構(gòu)提出對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行改造的方案，并用基因工程的方法去實(shí)施。(5)對(duì)經(jīng)過(guò)改造的蛋白質(zhì)進(jìn)行功能性測(cè)定。3、應(yīng)注意保留潛在的N糖基化位點(diǎn)(Asn-X-SerThr-X-Pro)中的Asn(天門冬酰胺)、Set(絲氨酸)或Thr(蘇氨酸)。 4、對(duì)于含有內(nèi)含子的序列，可以刪除某一外顯子或外顯子組合，因?yàn)閱蝹€(gè)外顯子通常編碼獨(dú)立折疊的結(jié)構(gòu)域，刪去該結(jié)構(gòu)域后可能不會(huì)影響蛋白其余部分的正確折疊。5、構(gòu)建兩個(gè)同源蛋白的嵌合體時(shí)，應(yīng)盡量使其接合部位處在具有相同或相近功能的氨基酸序列中；而當(dāng)兩個(gè)非同源蛋白組成

7、嵌合體時(shí)，則應(yīng)使接合部分盡量位于所預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)的邊緣。 6、如果對(duì)目的蛋白的三維結(jié)構(gòu)一無(wú)所知，那么可以在目的序列中隨機(jī)插入六聚體接頭以鑒定功能性結(jié)構(gòu)域。插入六聚體接頭后，在原蛋白質(zhì)序列中添加兩個(gè)氨基酸，比插入更多的氨基酸對(duì)蛋白質(zhì)整體功能的破壞要輕。7、進(jìn)行缺失突變時(shí)，應(yīng)避免直接利用天然存在的限制性酶切位點(diǎn)進(jìn)行刪除。 蛋白質(zhì)工程的基本途徑預(yù)期的蛋白質(zhì)功能設(shè)計(jì)預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)推測(cè)應(yīng)有的氨基酸序列找到相對(duì)應(yīng)的脫氧核苷酸序列（基因）第三節(jié) 、蛋白質(zhì)改造方法 在基因水平上對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行改造，按改造的規(guī)模和程度可以分為：初級(jí)改造：個(gè)別氨基酸的改變和一整段氨基酸序列的刪除、置換或插入高級(jí)改造：蛋白質(zhì)分子的剪裁，如

8、結(jié)構(gòu)域的拼接從頭設(shè)計(jì)合成新型蛋白質(zhì) 一、初級(jí)改造通過(guò)基因突變方法，以達(dá)到改變氨基酸進(jìn)而改造蛋白質(zhì)的目的。目前，主要采用的基因突變方法：基因定位突變盒式突變。 基因定位突變根據(jù)三聯(lián)體密碼，編碼DNA（目的基因）的確定位點(diǎn)，改變其組成核苷酸的順序或種類，使基因發(fā)生定向變異，使其控制合成的氨基酸種類、順序發(fā)生改變，合成出具有預(yù)期氨基酸序列的修飾蛋白質(zhì)。這種通過(guò)造成一個(gè)或幾個(gè)堿基定點(diǎn)突變，以達(dá)到修飾蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)目的的技術(shù)，稱為基因定點(diǎn)突變技術(shù)?；蚨ㄎ煌蛔兊幕具^(guò)程：首先使目的基因由環(huán)狀載體折成單鏈，再對(duì)指定的位點(diǎn)用寡聚核苷酸誘導(dǎo)或置入合成的寡聚核苷酸產(chǎn)生定位突變基因，最后將突變基因?qū)脒m宜的表達(dá)系

9、統(tǒng)(如大腸桿菌等)即可產(chǎn)生突變體蛋白質(zhì)。這是目前定向改造蛋白質(zhì)的基本手段。 （一）M13-DNA寡聚核苷酸介導(dǎo)誘變技術(shù) （二）寡核苷酸介導(dǎo)的PCR誘變技術(shù) （三）隨機(jī)誘變技術(shù) （四）盒式突變技術(shù) 二、蛋白質(zhì)分子的高級(jí)改造（結(jié)構(gòu)域的拼接） 研究證明，在二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)之間還有一個(gè)結(jié)構(gòu)層次，即結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)域由螺旋、折疊等二級(jí)結(jié)構(gòu)單位按一定的拓?fù)鋵W(xué)規(guī)則構(gòu)成的三維結(jié)構(gòu)實(shí)體。結(jié)構(gòu)域是蛋白質(zhì)分子中一種基本的結(jié)構(gòu)單位，結(jié)構(gòu)域拼接是通過(guò)基因操作把位于兩種不同蛋白質(zhì)上的幾個(gè)結(jié)構(gòu)域連接在一起，形成融合蛋白，它兼有原來(lái)兩種蛋白的性質(zhì)。 三、全新蛋白質(zhì)的設(shè)計(jì)與構(gòu)建 上述兩種蛋白質(zhì)改造方法，通常是從一個(gè)已知順序、結(jié)構(gòu)和

10、功能的蛋白質(zhì)出發(fā)，根據(jù)一定的目標(biāo)和設(shè)計(jì)方案，使用多肽合成或者基因工程的方法，改變它的結(jié)構(gòu)，以期達(dá)到改變其性質(zhì)的目的。如果要從頭設(shè)計(jì)和構(gòu)建一個(gè)自然界不存在的蛋白質(zhì)，則需要借助多功能模板和蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)元件組裝成某種具有特定功能的人工蛋白質(zhì)分子。 第四節(jié) 蛋白質(zhì)工程在食品中的應(yīng)用 蛋白質(zhì)工程自問(wèn)世以來(lái)，短短十幾年的時(shí)間，已取得了引人矚目的進(jìn)展，在醫(yī)學(xué)和工業(yè)用酶方面也獲得了良好的應(yīng)用前景。 提高蛋白的穩(wěn)定性包括以下幾個(gè)方面：延長(zhǎng)酶的半衰期；提高酶的熱穩(wěn)定性；延長(zhǎng)藥用蛋白的保存期；抵御由于重要氨基酸氧化引起的活性喪失。 一、消除酶的被抑制特性 1985年，美國(guó)的埃斯特爾借助寡核苷酸介導(dǎo)的定位突變技術(shù)，

11、用19種其他氨基酸分別替代枯草芽孢桿菌蛋白酶分子第222位殘基上易氧化的Met，獲得了一系列活性差異很大的突變酶。發(fā)現(xiàn)除了用Cys代替Met的突變體以外，其他突變體的酶活性都降低了。 二、引入二硫鍵，改善蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性 溶菌酶：由一條肽鏈構(gòu)成，并在空間上折疊形成二個(gè)相對(duì)獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域，酶活性中心位于二個(gè)結(jié)構(gòu)域之間。該酶分子在第97位和54位殘基上是兩個(gè)未形成二硫鍵的半胱氨酸由于二硫鍵是一種穩(wěn)定蛋白質(zhì)分子空間結(jié)構(gòu)的重要共價(jià)化學(xué)鍵，有如建筑所用的鋼筋一樣，因而能將分子中的不同部位牢固地聯(lián)結(jié)在一起。因此，提高酶熱穩(wěn)定性最常用的辦法是在分子中增加一對(duì)或數(shù)對(duì)二硫鍵。 在高溫下Asn和Gln容易脫氨形成A

12、sp和Glu，而導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的改變，使蛋白質(zhì)失去活性。對(duì)釀酒酵母的磷酸丙糖異構(gòu)酶進(jìn)行誘變改造。這種酶有兩個(gè)相同的亞基，每個(gè)亞基含有2個(gè)Asn，由于它們都位于亞基之間的界面上，可能對(duì)酶的熱穩(wěn)定性起決定性作用。通過(guò)寡核苷酸介導(dǎo)的定向誘變技術(shù)，將第14位和第78位上的2個(gè)Asn分別轉(zhuǎn)變成Thr(蘇氨酸)和Ile(異亮氨酸)殘基，大幅度提高突變酶的熱穩(wěn)定性。 三、轉(zhuǎn)化氨基酸殘基，改善蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性 四、改變酶的最適pH值條件 葡萄糖異構(gòu)酶最適pH為堿性，在80穩(wěn)定，而在堿性條件下， 80時(shí)使高果糖漿焦化產(chǎn)生有害物質(zhì)，反應(yīng)只能在60進(jìn)行。采用盒式突變技術(shù)將葡萄糖異構(gòu)酶分子中酸性氨基酸(Glu或As

13、p)集中的區(qū)域置換為堿性氨基酸(Arg或Lys)，可使葡萄糖異構(gòu)酶的最適pH值變?yōu)樗嵝裕纯稍诟邷叵逻M(jìn)行反應(yīng)。五、提高酶的催化活性 酶的催化活性由酶分子上的必需基團(tuán)決定如對(duì)酪氨酸-tRNA合成酶進(jìn)行定點(diǎn)突變?cè)谔烊粻顟B(tài)下，酪氨酸-tRNA合成酶分子內(nèi)第51位蘇氨酸殘基的羥基能與底物酪氨酰腺嘌呤核苷酸戊糖環(huán)上的氧原子形成氫鍵，這個(gè)氫鍵的存在影響酶分子與另一底物ATP的親和力。因此，利用定向誘變技術(shù)將酶分子第51位蘇氨酸殘基改變?yōu)楦彼釟埢?，?Pro-51)與ATP的親和力被增加了近100倍，而且最大反應(yīng)速度亦大幅度提高。 六、修飾酶的催化特異性 利用定點(diǎn)突變技術(shù)葡萄糖淀粉酶的催化特性。如將活性中心的GLu、Asp被Gln、Asn取代時(shí)