超聲酶法提取黃柏中小檗堿的工藝研究

1、超聲酶法提取黃柏中小檗堿的工藝研究【關(guān)鍵詞】黃柏小檗堿纖維素酶超聲波ExtratinStudyfBerberinefrrtexPhelldendribyUltrasniave-ellulaseShlfBisieneandTehnlgy，ShenyangAgriulturalUniversity,Shenyang110161,hinaAbstrat：bjetiveTstudytheappliatineffetnextratinfberberinefrrtexphelldendribyultrasniave-ellulase.ethdsBasednthesinglefatrstestandrthg

2、naltesttheeffetfdifferentfatrsnextratinfberberinefrrtexphelldendribyultrasniave-ellulaseasstudied,andextratingnditinsasptiized.ResultsThebestextratinnditinasthattieas2.5h,theperfultrasniaveas80,thevluefellulaseas25l,teperatureas60.nlusinTheberberinefrtexPhelldendriisextratedbyUltrasniave-ellulase,hi

3、hansavetieandenhaneextrat-effiieny,saverganislventandreduetheusefenergy.Keyrds：rtexPhelldendri;Berberine;ellulase;Ultrasniave黃柏是蕓香科植物黃皮樹(shù)或黃檗的枯燥樹(shù)皮，黃柏具有抗病原微生物、抗?jié)?、降壓、抗心律失常等藥理作用。臨床常用于治療中耳炎、皮膚感染、燒傷、慢性前列腺炎、急性細(xì)菌性痢疾、急性胃腸炎等病癥1。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明小檗堿是其主要成分之一。本實(shí)驗(yàn)主要利用正交設(shè)計(jì)研究纖維素酶、超聲波對(duì)黃柏中小檗堿提取量的影響。1材料與儀器1.1材料黃柏購(gòu)自沈陽(yáng)東北大藥房，纖維素酶由沈陽(yáng)

4、農(nóng)業(yè)大學(xué)生物工程實(shí)驗(yàn)室自制。所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。1.2儀器722-型光柵分光光度計(jì)山東高密彩虹分析儀器,KQ3200DE型醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器)。2方法與結(jié)果2.1纖維素酶活力的測(cè)定2.1.1酶液配制準(zhǔn)確稱(chēng)取500g纖維素酶，溶解后定容至100l容量瓶中，此酶液濃度為5g/l。2.1.2葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制準(zhǔn)確稱(chēng)取100g分析純無(wú)水葡萄糖，用蒸餾水溶解后，轉(zhuǎn)移至100l容量瓶中，定容至刻度，搖勻。2.1.3葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取8支20l刻度試管標(biāo)號(hào)后按表1參加各試劑。表1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作略將上述溶液混勻后，在沸水浴中煮沸5in，冷卻后定容至20l，搖勻。將分光光度計(jì)調(diào)

5、零，在540n下測(cè)其A值。以每個(gè)試管中葡萄糖毫克數(shù)為橫坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)的A值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.1.5濾紙酶活力計(jì)算濾紙酶活力U/g根據(jù)公式：濾紙酶活力U/g=葡萄糖生成量g酶液定容總體積5.56/反響液中酶液參加量l樣品重g時(shí)間h，1g葡萄糖換算成l：1000g/180g=5.56l,經(jīng)實(shí)驗(yàn)測(cè)得，纖維素酶作用后，3個(gè)試管的A值為0.013，0.011，0.012。取其平均值為0.012，通過(guò)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線查得葡萄糖生成量為0.123g帶入公式得：濾紙酶活力=547.104U/g2.2小檗堿的提取及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制2.2.1粗提將黃柏5g碎成粉狀，置燒杯中，參加1/10量的生石灰細(xì)粉，加水溶

6、脹30in后，再參加30倍量水浸泡24h后紗布過(guò)濾，再用10%的鹽酸將濾液pH值調(diào)至23，然后參加濾液體積10%的Nal，放置過(guò)夜后抽濾，得到鹽酸小檗堿的粗提物，此時(shí)還含有雜質(zhì)。將鹽酸小檗堿的粗提物用熱水溶解并趁熱抽濾，濾液冷卻靜止1h抽濾得到鹽酸小檗堿與掌葉防己堿等的混合物，至此黃柏的粗提完畢2。2.2.2鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精細(xì)稱(chēng)取鹽酸小檗堿純品10g，置50l容量瓶中，加95%的乙醇溶解并定容至刻度，作為鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)溶液。精細(xì)稱(chēng)取此液0.2，0.4，0.8，1.6，2.0l于50l容量瓶中，繼續(xù)加95%乙醇至刻度并在348n下測(cè)定吸光度值，y=0.8055x-0.0097。2.3纖

7、維素酶-超聲波對(duì)鹽酸小檗堿提取率的影響取兩組黃柏各5g，粉碎。在一組樣品中參加150l石灰水，在另一組中參加130l石灰水和20l濃度為5g/l的酶液。第一組樣品浸泡24h后雙層紗布過(guò)濾，第二組樣品在60，功率為60%的超聲波清洗器里超聲清洗90in后雙層紗布過(guò)濾，兩組濾液用10%的鹽酸調(diào)pH23，最后參加濾液體積10%的Nal，放置過(guò)夜，抽濾，得兩組鹽酸小檗堿樣品。用乙醇溶解并分別定容至50l，在348n下分別測(cè)其吸光度值，并在鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出各自的鹽酸小檗堿。2.4提取條件的單因素考察2.4.1水浴溫度對(duì)提取效果的影響稱(chēng)取枯燥的黃柏粗粉5g左右，分別于20，40，60，80，100

8、時(shí)參加20l酶液，作用1.5h，結(jié)果在60時(shí)提取量比擬高。2.4.2水浴時(shí)間確實(shí)定稱(chēng)取枯燥的黃柏粗粉5g左右，于60時(shí)參加20l酶液，分別作用0.5，1.0，1.5，2.0，2.5h，結(jié)果水浴1.5h時(shí)提取量比擬高。表2纖維素酶-超聲波對(duì)鹽酸小檗堿提取率的影響略2.4.3加酶量確實(shí)定稱(chēng)取枯燥的黃柏粗粉5g左右，于60時(shí)參加酶液10，15，20，25，30l，分別作用1.5h,結(jié)果加酶量為25l時(shí)提取量比擬高。2.4.4超聲功率確實(shí)定稱(chēng)取枯燥的黃柏粗粉5g左右，于60時(shí)參加酶液20l，超聲時(shí)間1.5h，超升功率分別為40%，50%，60%，70%，80%，結(jié)果超聲功率范圍為60%時(shí)，提取量比擬高

9、。2.5正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)根據(jù)黃柏中鹽酸小檗堿的提取條件，選定加酶量、溫度、時(shí)間、超聲功率4個(gè)因素，以L934正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)系統(tǒng)進(jìn)展實(shí)驗(yàn)。因素程度見(jiàn)表3,正交表見(jiàn)表4。表3因素及程度略表4正交實(shí)驗(yàn)略以上分析可以得出結(jié)論:各因素對(duì)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)(含量)的影響按大小次序來(lái)說(shuō)應(yīng)當(dāng)是(水浴時(shí)間)、D(超聲功率)、A(加酶量)、B(水浴溫度)，最好的實(shí)驗(yàn)方案應(yīng)當(dāng)是3A2D3B2,即水浴時(shí)間2.5h,超聲功率80%,加酶25l,水浴溫度60。2.6利用薄層色譜法檢測(cè)纖維素酶、超聲波對(duì)鹽酸小檗堿成分的影響制備硅膠薄層板一塊，取鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)樣品、未用纖維素酶提取的鹽酸小檗堿樣品、用纖維素酶提取的鹽酸小檗堿樣品和用纖維素酶

10、-超聲波提取的鹽酸小檗堿樣品各0.5l，點(diǎn)樣。按Hl3eH冰HA=712的比例配制展開(kāi)劑，將點(diǎn)樣后的薄層板放入層析缸中，待展開(kāi)至規(guī)定間隔 時(shí)取出晾干。在可見(jiàn)與紫外燈下觀察，未用纖維素酶提取的鹽酸小檗堿樣品、用纖維素酶提取的鹽酸小檗堿樣品和用纖維素酶-超聲波提取的鹽酸小檗堿樣品薄層色譜圖一樣。說(shuō)明，用纖維素酶提取的鹽酸小檗堿的成分無(wú)變化。3討論3.1為什么纖維素酶不會(huì)影響鹽酸小檗堿的成分纖維素酶是一組可以降解纖維素生成葡萄糖的酶的總稱(chēng)。纖維素酶只是破壞黃柏細(xì)胞的細(xì)胞壁，其細(xì)胞內(nèi)部物質(zhì)并不含有纖維素類(lèi)物質(zhì)，因此纖維素酶對(duì)其內(nèi)容物的成分沒(méi)有任何影響。所以，提取出來(lái)的鹽酸小檗堿的成分并不會(huì)變化。3.2為什么超聲提取會(huì)使黃柏中小檗堿的提取量增加且不影響其成分超聲提取法是基于超聲波的空化作用來(lái)加速物質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)的頻率和速度、增加溶劑穿透才能，以進(jìn)步藥物溶出速度和溶出次數(shù)，從而有利于植物有效成分的浸出提取，而它的次級(jí)效