食品衛(wèi)生細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)PPT

1、關(guān)于食品衛(wèi)生細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第一張，PPT共七十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月學(xué)習(xí)目標(biāo)掌握學(xué)習(xí)食品中菌落總數(shù)檢測(cè)程序和方法。掌握學(xué)習(xí)食品中大腸菌群檢測(cè)程序和方法。掌握食品中菌落總數(shù)和大腸菌群檢測(cè)結(jié)果的報(bào)告方式。第二張，PPT共七十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月主要內(nèi)容食品中菌落總數(shù)的測(cè)定S1食品中大腸菌群的測(cè)定S2第三張，PPT共七十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 S1 菌落總數(shù)的測(cè)定 第四張，PPT共七十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月一、菌落總數(shù) 是指食品檢樣經(jīng)過(guò)處理，在一定條件下培養(yǎng)后,所得1mL(g)或1cm2面積檢樣中所含菌落的總數(shù). 以菌落形成單位（colony forming unit CFU）表示

2、。 第五張，PPT共七十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月二、菌落總數(shù)測(cè)定的意義1、判定食品被細(xì)菌污染的程度及衛(wèi)生質(zhì)量。2、預(yù)測(cè)食品存用的期限長(zhǎng)短。3、了解細(xì)菌在食品中的繁殖動(dòng)態(tài)。第六張，PPT共七十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月三、菌落總數(shù)測(cè)定的方法 平板傾注法平板表面涂布法平板表面點(diǎn)滴法第七張，PPT共七十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月四、平板傾注法測(cè)定菌落總數(shù)檢驗(yàn)步驟(程序)： 檢樣稀釋處理做平板培養(yǎng)菌落計(jì)數(shù)報(bào)告結(jié)果第八張，PPT共七十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（一）、樣品稀釋及做平板1ml1ml1ml1ml1:101:10001:1001:100001ml1ml1ml加入46營(yíng)養(yǎng)瓊脂1215ml25g

3、/ml樣品生理鹽水第九張，PPT共七十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月Note： 檢樣從開(kāi)始稀釋到傾注最后一個(gè)平皿所用時(shí)間不宜超過(guò)20min，以防止細(xì)菌有所死亡或繁殖第十張，PPT共七十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（二）培養(yǎng)普通食品:37 48h 倒放平板清涼飲料、調(diào)味品、糕點(diǎn)、酒類： 37 24h 水產(chǎn)品: 30 48h第十一張，PPT共七十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（三）計(jì)數(shù)和報(bào)告 到達(dá)規(guī)定培養(yǎng)時(shí)間，應(yīng)立即計(jì)數(shù)。如果不能立即計(jì)數(shù)，應(yīng)將平板放置于04，但不得超過(guò)24h。第十二張，PPT共七十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（1）、單個(gè)菌做一個(gè)菌落計(jì)（2）、呈鏈狀生長(zhǎng)的菌落之間無(wú)任何明顯界限，作為一個(gè)菌落計(jì)

4、，如存在有幾條不同來(lái)源的鏈，則每條鏈均應(yīng)按一個(gè)菌落計(jì)算。（3）、如片狀菌落不到平板一半，而另一半又分布均勻，則可以半個(gè)平板的菌落數(shù)乘2代表全平板的菌落數(shù)。1. 菌落的選擇第十三張，PPT共七十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2、平板菌落計(jì)數(shù)的選擇 （1）、選取菌落數(shù)在30300之間的平板（SN標(biāo)準(zhǔn)要求為25250個(gè)菌落），若有二個(gè)稀釋度均在30300之間時(shí)，比值小于或等于2取平均數(shù)，比值大于2則其較小數(shù)字。第十四張，PPT共七十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（2）、如均大于300，則取最高稀釋度的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告（3）、如均小于30，則以最低稀釋度的平均菌落數(shù)乘稀釋倍數(shù)報(bào)告（4）、如菌落數(shù)有的

5、大于300，有的又小于30，不在30300之間，以最接近300或30的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告（5）、如所有稀釋度均無(wú)菌落生長(zhǎng)，則應(yīng)按小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報(bào)告。 第十五張，PPT共七十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月3、菌落數(shù)的報(bào)告菌落數(shù)在1100時(shí)，按實(shí)有數(shù)字報(bào)告，如大于100時(shí)，則報(bào)告前面兩位有效數(shù)字，第三位數(shù)按四舍五入計(jì)算。固體檢樣以克（g)為單位報(bào)告，液體檢樣以毫升（ml）為單位報(bào)告，表面涂擦則以平方厘米（cm2）報(bào)告。 第十六張，PPT共七十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月(四)、檢驗(yàn)注意事項(xiàng)1、對(duì)照平板出現(xiàn)幾個(gè)菌落時(shí)，要追加對(duì)照平板；2、吸管進(jìn)出瓶子或試管時(shí)，吸管口不得觸及瓶口、管口的外圍

6、部分；3、吸管插入試樣液內(nèi)的深度不得小于2.5cm,調(diào)整時(shí)要使管尖與容器內(nèi)壁緊貼;4、進(jìn)行稀釋時(shí),吸管口不得與稀釋液接觸;5、檢樣從開(kāi)始稀釋到傾注最后一個(gè)平皿所用時(shí)間不宜超過(guò)20min.6、稀釋倍數(shù)愈高菌落數(shù)愈少，稀釋倍數(shù)愈低菌落數(shù)愈多。如出現(xiàn)逆反現(xiàn)象，不可作為檢樣計(jì)數(shù)報(bào)告的依據(jù)。第十七張，PPT共七十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月食品衛(wèi)生細(xì)菌的檢測(cè)技術(shù) 三、嗜熱菌（芽孢）計(jì)數(shù) （一）儀器用具 冰箱、培養(yǎng)箱、高壓滅菌鍋、恒溫水浴鍋、托盤(pán)天平、可調(diào)式電爐、吸管、廣口瓶、三角瓶、平皿、試管等。 （二）培養(yǎng)基和試劑 1葡萄糖-胰蛋白胨瓊脂 （同上） 2亞硫酸鹽瓊脂 將胰蛋白胨10g、硫酸鈉1g、硫乙醇酸

7、鈉5g溶解于1000mL蒸餾水中，加入5檸酸酸鐵10mL，加入瓊脂，加熱煮沸，使瓊脂溶化，pH自然。分裝燒瓶，121高壓滅菌20min。 3去氧肝湯第十八張，PPT共七十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月食品衛(wèi)生細(xì)菌的檢測(cè)技術(shù) （三）操作步驟 將檢樣25g加入到盛有225mL無(wú)菌水的三角燒瓶?jī)?nèi)，迅速煮沸5min以殺死細(xì)菌繁殖體及耐熱性低的芽孢，然后將燒瓶浸于冷水中冷卻。 1平酸菌計(jì)數(shù) 在5只無(wú)菌培養(yǎng)皿中各注入2mL樣液，用葡萄糖-胰蛋白瓊脂做傾注平板，凝固后在5055培養(yǎng)4872h，計(jì)算5個(gè)平板上菌落的平均數(shù)。 平酸菌在葡萄糖-胰蛋白瓊脂平板上的菌落為圓形，直徑25mm，具不透明的中心及黃色暈，暈很狹

8、，產(chǎn)酸弱的細(xì)菌其菌落周圍不存在，或不易觀察到。平板從培養(yǎng)箱內(nèi)取出后應(yīng)立即進(jìn)行計(jì)數(shù)，因?yàn)辄S色會(huì)很快消退。如在培養(yǎng)48h后不易辨別是否產(chǎn)酸，則可培養(yǎng)到72h。第十九張，PPT共七十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月食品衛(wèi)生細(xì)菌的檢測(cè)技術(shù) 2不產(chǎn)生硫化氫的嗜熱性厭氧菌檢驗(yàn) 將已處理過(guò)的樣品加入等量新制備的去氧肝湯（總量為20mL）于試管中，以2無(wú)菌瓊脂封頂，先加熱到5055，然后在55中培養(yǎng)72h，當(dāng)有氣體生成（瓊脂塞破裂，氣味似干酪）時(shí)，可以認(rèn)為有嗜熱性厭氧菌存在。 3產(chǎn)生硫化氫的嗜熱性厭氧菌計(jì)數(shù) 將已處理過(guò)的樣品加入到已熔化的亞硫酸鹽瓊脂試管中（總量為20mL），共6份。將試管浸于冷水中，培養(yǎng)基固化后，

9、加熱到5055，然后在55培養(yǎng)48h。能產(chǎn)生硫化氫的細(xì)菌會(huì)在亞硫酸鹽瓊脂管內(nèi)形成特征性的黑小片（因?yàn)榱蚧瘹浔晦D(zhuǎn)化為硫化鐵等硫化物）。計(jì)算黑小片數(shù)目。某些嗜熱菌不生成硫化氫，但代之以生成強(qiáng)大還原性氫，使全部培養(yǎng)基變黑色。第二十張，PPT共七十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月食品衛(wèi)生細(xì)菌的檢測(cè)技術(shù) 四、厭氧菌計(jì)數(shù) （一）儀器用具 冰箱、培養(yǎng)箱、高壓滅菌鍋、恒溫水浴鍋、托盤(pán)天平、可調(diào)式電爐、吸管、廣口瓶、三角瓶、平皿、試管等。 （二）培養(yǎng)基和試劑 硫乙醇酸鹽瓊脂的配制： 將胰消化干酪素15g、L-胱氨酸0.5g、酵母浸膏5g、葡萄糖5g、氯化鈉2.5g、硫乙醇酸鈉0.5g、刃天青0.001g溶解于1000

10、mL蒸餾水中，加入瓊脂15g，加熱煮沸，使瓊脂溶化。調(diào)pH為7.07.1，分裝燒瓶、試管中，121高壓滅菌15min。第二十一張，PPT共七十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月食品衛(wèi)生細(xì)菌的檢測(cè)技術(shù) （三）操作步驟 1傾注平板 將檢樣稀釋液lmL，注入于已溶化并晾至4550的硫乙醇酸鈉瓊脂管內(nèi)，搖勻，傾注平板。 2疊一層瓊脂 冷凝后，在其上再疊一層3無(wú)菌瓊脂。 3培養(yǎng)、計(jì)數(shù) 凝固后，在37培養(yǎng)96h，然后取出進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。 第二十二張，PPT共七十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月食品衛(wèi)生細(xì)菌的檢測(cè)技術(shù) 五、革蘭氏陰性菌計(jì)數(shù) （一）儀器用具 冰箱、培養(yǎng)箱、高壓滅菌鍋、恒溫水浴鍋、托盤(pán)天平、可調(diào)式電爐、吸管、廣

11、口瓶、三角瓶、平皿、試管等。 （二）培養(yǎng)基和試劑 VRB瓊脂的制備： 將胰蛋白胨7g、酵母浸膏5g、氯化鈉5g、乳糖10g、膽鹽1.5 g溶解于1000mL蒸餾水中，加入瓊脂15g，加熱煮沸，使瓊脂溶化，再加入中性紅0.03g、結(jié)晶紫0.002g，再煮沸2min。pH7.40.2 （三）操作步驟 1制備營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板 傾注1520mL營(yíng)養(yǎng)瓊脂于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，凝固后，在37烘去表面水分。第二十三張，PPT共七十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月食品衛(wèi)生細(xì)菌的檢測(cè)技術(shù) 2涂布 吸注檢樣稀釋液0.1mL于平板上，共2份，立即用無(wú)菌L形玻棒涂開(kāi)，放置片刻。 3層疊VRB瓊脂 層疊已溶化并涼到4550的VRB瓊脂

12、34mL。 4培養(yǎng)、計(jì)數(shù) 在30培養(yǎng)48h后，計(jì)數(shù)菌落。第二十四張，PPT共七十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月食品衛(wèi)生細(xì)菌的檢測(cè)技術(shù) S2 大腸菌群的測(cè)定 第二十五張，PPT共七十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月一、大腸菌群 1、 什么是大腸菌群？指一群需氧及兼性厭氧，在37能分解乳糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣的革蘭氏染色陰性無(wú)芽胞桿菌。2、大腸菌群的組成:大腸埃希氏菌發(fā)屬、檸檬酸桿菌屬、產(chǎn)氣克雷伯氏菌屬和陰溝腸桿菌。第二十六張，PPT共七十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月屬代表種致病性埃希氏菌屬 （Escherichia） 大腸埃希氏菌 (E.coli) 腸道外感染， 急性腹瀉 志賀氏菌屬 （Shigella） 痢疾志賀氏

13、菌 (Sh.dysenteriae) 細(xì)菌性痢疾愛(ài)德華氏菌屬 （Edwardsiella） 遲純愛(ài)德華氏菌 (E.tarda) 蛇類等血?jiǎng)游锏恼Ｄc道寄居菌，偶見(jiàn)于健康人或腹瀉者糞便內(nèi)沙門(mén)氏菌屬 （Salmonella） 傷寒沙門(mén)氏菌 (S.typhi) 腸熱癥、急性腸炎、敗血癥枸櫞酸桿菌屬 (Citrobacter) 弗勞地氏枸櫞酸桿菌 (C.freundii) 條件致病菌，引起繼發(fā)性感染克雷伯氏菌屬 (Klebsiella) 肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae) 肺炎，泌尿系、創(chuàng)傷感染 敗血癥等 陰溝腸桿菌(Enterobacter) 產(chǎn)氣桿菌 (E.aerogenes) 很少引起原

14、發(fā)性感染哈夫尼亞菌屬 (Hafnia) 蜂窩啥夫尼亞菌 (H.alvei) 對(duì)人無(wú)致病性沙雷氏菌屬 (Serrati) 粘質(zhì)沙雷氏菌 (S.marcescens) 條件致病菌，引起泌尿系， 呼吸道及創(chuàng)傷感染 變形桿菌屬 (Proteus) 普通變形桿菌 (P.vulgaris) 食物中毒，泌尿系、呼吸道感染 等耶爾森氏菌屬 (Yersinia) 鼠疫耶爾森氏菌 (Y.pestis) 鼠疫歐文氏菌屬 (Erwinia) 草原居民歐文氏菌 (E.herbicola) 植物寄生菌，曾從人體腸道及化膿扁桃體中分離到第二十七張，PPT共七十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1、糞便污染的指標(biāo)菌：大腸菌群或大腸桿

15、菌2、以大腸菌群作為糞便指標(biāo)菌原因在糞便中數(shù)量最大；在外環(huán)境中存活的時(shí)間與致病菌大體相同；檢測(cè)方法簡(jiǎn)便容易。二、大腸菌群的測(cè)定意義第二十八張，PPT共七十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月3、大腸菌群的測(cè)定意義（1）、判斷食品中否受到糞便污染。（2）、有利于控制腸道傳染病的發(fā)生和流行。（3）、有利于控制食品在生產(chǎn)加工、運(yùn)輸、保存等過(guò)程中的衛(wèi)生狀況。第二十九張，PPT共七十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月三、大腸菌群的生物學(xué)特性1.形態(tài)與染色：革蘭氏染色陰性，無(wú)芽胞桿菌。2.發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣 3.培養(yǎng)特性：在瓊脂上的典型菌落:呈深紫黑色或中心深紫色，圓形，稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，常有金屬光澤；在麥康凱瓊脂

16、上的典型菌落:呈桃紅色或中心桃紅、圓形，扁平，光滑濕潤(rùn)。第三十張，PPT共七十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月EMB平板照片及原理第三十一張，PPT共七十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月麥康凱瓊脂平板Age of culture is 24 h第三十二張，PPT共七十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月大腸桿菌、大腸菌群選擇性顯色培養(yǎng)基-COLI ID用于在37下對(duì)食品中大腸菌群和大腸桿菌進(jìn)行檢測(cè)、計(jì)數(shù)及大腸桿菌的鑒定本培養(yǎng)基含有兩種顯色物質(zhì)，可以直接識(shí)別大腸菌群（coliforms）和鑒定大腸桿菌（Escherichia coli）,而不需附加任何試劑。菌落顏色 玫瑰紅 藍(lán)色 透明.-葡萄糖苷酶 + - - .-

17、半乳糖苷酶 + + - .大腸桿菌 其它大腸菌群 其它革蘭氏陰性菌 .-半乳糖苷酶（+）大腸菌群存在 -半乳糖苷酶（+）大腸菌群存在-葡萄糖苷酶（+）大腸桿菌存在 -葡萄糖苷酶（-）無(wú)大腸菌群存在第三十三張，PPT共七十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月大腸桿菌平板菌落照片腸桿菌掃描電鏡照片.第三十四張，PPT共七十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月食品衛(wèi)生細(xì)菌的檢測(cè)技術(shù) 一、乳糖發(fā)酵法 （一）原理 由于大腸菌群指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關(guān)的細(xì)菌，即：需氧及兼性厭氧、在37能分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌。因此大腸菌群的檢測(cè)一般都是按照它的定義進(jìn)行的。 （二）設(shè)備和材料 恒溫恒濕培養(yǎng)箱（36

18、1）、冰箱（04）、顯微鏡、天平、高壓滅菌鍋。恒溫水?。?4.50.5）。均質(zhì)器或乳缽、酒精燈、試管架、平皿（直徑為90mm）、試管、吸管、廣口瓶或三角燒瓶（500mL）、玻璃珠（直徑約5mm）、載玻片、蓋玻片等。第三十五張，PPT共七十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月食品衛(wèi)生細(xì)菌的檢測(cè)技術(shù) （三）培養(yǎng)基和試劑 1 乳糖膽鹽發(fā)酵管 成分： 蛋白胨 20g、膽鹽（豬或?；蜓颍?g、乳糖10g、0.04%溴甲酚紫水溶液25mL、蒸餾水1000 mL。 制法：將蛋白胨、膽鹽、乳糖溶于水中，校正pH7.4，加入指示劑溴甲酚紫，分裝于試管，并倒放入一個(gè)小試管（杜拉姆發(fā)酵管），在121高壓滅菌15min，備用。

19、 2伊紅美藍(lán)瓊脂平板（EMB） 成分： 乳糖10g、蛋白胨10g、磷酸氫二鉀2g、瓊脂17g、2%伊紅Y溶液20mL、0.65%美藍(lán)溶液10mL、蒸餾水1000 mL。 制法： 先將瓊脂加到900mL蒸餾水中，加熱溶解，然后加入磷酸氫二鉀、蛋白胨，混勻，使之溶解。再以蒸餾水補(bǔ)足至1000mL。校正pH值為7.27.4，分裝于燒瓶?jī)?nèi)，121、15min高壓滅菌備用。臨用時(shí)加入乳糖并加熱融化瓊脂。冷至60左右以無(wú)菌手續(xù)加入滅菌的指示劑伊紅Y溶液和美藍(lán)溶液，搖勻。傾注平皿，備用。第三十六張，PPT共七十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月食品衛(wèi)生細(xì)菌的檢測(cè)技術(shù) 3 乳糖發(fā)酵管 成分： 蛋白胨20g、乳糖10g

20、、0.04%溴甲酚紫水溶液25mL、蒸餾水1000 mL。 制法： 將蛋白胨、乳糖溶于水中，校正pH7.4，加入指示劑溴甲酚紫，分裝于試管，并倒放入一個(gè)小試管（杜拉姆發(fā)酵管），在121高壓滅菌15min，備用。 4EC肉湯 成分： 胰蛋白胨20g、膽鹽（3號(hào)或混合膽鹽）1.5g、乳糖5g、磷酸氫二鉀4g、磷酸二氫鉀1.5g、氯化鈉5g、蒸餾水1000 mL。 制法： 將上述成分混合溶解后，分裝在有發(fā)酵倒管的試管中，在121高壓滅菌15min，最終pH為6.90.2，備用。第三十七張，PPT共七十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月食品衛(wèi)生細(xì)菌的檢測(cè)技術(shù) 5磷酸鹽緩沖稀釋液 成分： 磷酸二氫鉀34g、1m

21、ol/L氫氧化鈉溶液175 mL、蒸餾水825 mL。 制法： 先將磷酸鹽溶解于500 mL蒸餾水中，用1mol/L氫氧化鈉溶液校正pH7.2后，再用蒸餾水稀釋至1000 mL，制成儲(chǔ)存液。 取磷酸鹽緩沖儲(chǔ)存液1.25 mL，用蒸餾水稀釋至1000 mL。分裝每瓶100mL或每管10 mL，在121高壓滅菌15min，備用。6. 生理鹽水。第三十八張，PPT共七十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月食品衛(wèi)生細(xì)菌的檢測(cè)技術(shù) 7.革蘭氏染色液 （1）結(jié)晶紫染色液 成分： 結(jié)晶紫1g、95%乙醇20mL、1%草酸銨水溶液80mL。 制法： 將結(jié)晶紫溶解于乙醇中，然后與草酸銨溶液混合。 （2）革蘭氏碘液 成分：

22、 碘1g、碘化鉀2g、蒸餾水300mL。 制法： 將碘與碘化鉀進(jìn)行混合，加入蒸餾水少許，充分振搖，待完全溶解后，再加蒸餾水至300 mL。 （3）沙黃復(fù)染液 成分： 沙黃0.25g、95%乙醇10mL、蒸餾水90mL。 制法： 將沙黃溶解于乙醇中，然后用蒸餾水稀釋。第三十九張，PPT共七十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月食品衛(wèi)生細(xì)菌的檢測(cè)技術(shù) 8蛋白胨水（作靛基質(zhì)試驗(yàn)用） 成分： 蛋白胨（或胰蛋白胨） 20g、氯化鈉5g、蒸餾水1000mL。 制法： 將上述成分加熱熔化，調(diào)pH值為7.07.2，分裝小試管，高壓滅菌121、15min。 9靛基質(zhì)試劑 柯凡克試劑：將5g對(duì)二甲氨基苯甲醛溶解于75mL戊

23、醇中，然后緩慢加入濃鹽酸25mL。 試驗(yàn)方法：接種細(xì)菌于蛋白胨水中，于44培養(yǎng)24h。沿管壁加柯凡克試劑0.30.5mL，輕搖試管。陽(yáng)性者于試劑層顯深玫瑰紅色。第四十張，PPT共七十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 （四）大腸菌群檢驗(yàn)程序圖7-3 大腸菌群乳糖發(fā)酵法檢驗(yàn)程序第四十一張，PPT共七十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月食品衛(wèi)生細(xì)菌的檢測(cè)技術(shù) （五）操作步驟 1檢樣稀釋 （1）以無(wú)菌操作將檢樣25mL（或g）放于含有225mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶?jī)?nèi)（瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠）或滅菌乳缽內(nèi)，經(jīng)充分振搖或研磨做成1:10的均勻稀釋液。固體檢樣最好用均質(zhì)器，以8 00010000r/mi

24、n的速度處理1min，做成1:10的均勻稀釋液。 （2）用1mL滅菌吸管吸取1:10稀釋液1mL，注入含有9mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內(nèi)，振搖試管混勻，做成1:100的稀釋液。 （3）另取1mL滅菌吸管，按上條操作依次做10倍遞增稀釋液，每遞增稀釋一次，換用1支1mL滅菌吸管。 （4）根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)z樣污染情況的估計(jì)，選擇三個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種3管。第四十二張，PPT共七十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月食品衛(wèi)生細(xì)菌的檢測(cè)技術(shù) 2乳糖發(fā)酵試驗(yàn) 將待檢樣品接種于乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，接種量在1mL以上者，用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管，1mL及1mL以下者，用單料乳糖膽鹽發(fā)酵管。每一稀釋度接種

25、3管，置361溫箱內(nèi)，培養(yǎng)242h，觀察是否產(chǎn)氣。如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)氣，則可報(bào)告為大腸菌群陰性，如有產(chǎn)氣者，則按下列程序進(jìn)行。 3分離培養(yǎng) 將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別轉(zhuǎn)種在伊紅美藍(lán)瓊脂平板（EMB）上，置361溫箱內(nèi)，培養(yǎng)1824h，然后取出，觀察菌落形態(tài)，并做革蘭氏染色和證實(shí)試驗(yàn)。第四十三張，PPT共七十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月食品衛(wèi)生細(xì)菌的檢測(cè)技術(shù) 4證實(shí)試驗(yàn) 在上述平板上，挑取可疑大腸菌群菌落12個(gè)進(jìn)行革蘭氏染色，同時(shí)接種乳糖發(fā)酵管，置361溫箱內(nèi)培養(yǎng)24 h2h，觀察產(chǎn)氣情況。凡乳糖管產(chǎn)氣、革蘭氏染色為陰性的無(wú)芽胞桿菌，即可報(bào)告為大腸菌群陽(yáng)性。 5結(jié)果報(bào)告 （1）記錄 詳細(xì)記錄試驗(yàn)現(xiàn)

26、象。 （2）報(bào)告 根據(jù)證實(shí)為大腸菌群陽(yáng)性的管數(shù)，查表7-2“大腸菌群最可能數(shù)（MPN）檢索表”，報(bào)告每100mL（g）大腸菌群的MPN值。第四十四張，PPT共七十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月食品衛(wèi)生細(xì)菌的檢測(cè)技術(shù)第四十五張，PPT共七十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月食品衛(wèi)生細(xì)菌的檢測(cè)技術(shù)第四十六張，PPT共七十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月食品衛(wèi)生細(xì)菌的檢測(cè)技術(shù) （六）糞大腸菌群（faecal coliferm）的檢驗(yàn) 糞大腸菌群： 指一群能在44，24h內(nèi)發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣和利用色氨酸產(chǎn)生靛基質(zhì)，需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌，屬大腸埃希氏菌型。 糞大腸菌群的唯一來(lái)源是糞便，所以它是糞便污染的確切

27、指標(biāo)。在被檢樣品中，如果有糞大腸菌群存在，在大腸菌群檢驗(yàn)中也被計(jì)入，大腸菌群數(shù)實(shí)際上就是總大腸菌群數(shù)。 一般，大腸菌群和糞大腸菌群數(shù)均高，多考慮為近期污染；如果大腸菌群數(shù)高，而糞大腸菌群數(shù)低，則應(yīng)著重考慮糞便的遠(yuǎn)期污染。 第四十七張，PPT共七十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月食品衛(wèi)生細(xì)菌的檢測(cè)技術(shù) 1.檢樣稀釋 （1）以無(wú)菌操作將檢樣25mL（或g）放于含有225mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶?jī)?nèi)（瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠）或滅菌乳缽內(nèi)，經(jīng)充分振搖或研磨做成1:10的均勻稀釋液。固體檢樣最好用均質(zhì)器，以8 00010000r/min的速度處理1min，做成1:10的均勻稀釋液。 （2）用1

28、mL滅菌吸管吸取1:10稀釋液1mL，注入含有9mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內(nèi)，振搖試管混勻，做成1:100的稀釋液。 （3）另取1mL滅菌吸管，按上條操作依次做10倍遞增稀釋液，每遞增稀釋一次，換用1支1mL滅菌吸管。 （4）根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)z樣污染情況的估計(jì)，選擇三個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種3管。第四十八張，PPT共七十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月食品衛(wèi)生細(xì)菌的檢測(cè)技術(shù) 2. 44乳糖發(fā)酵試驗(yàn) 取10mL 1:10稀釋的檢樣，以無(wú)菌操作接種于10mL雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)（1mL及 1mL以下者，用單料管），置440.5水浴內(nèi)，培養(yǎng)24 h2h，經(jīng)培養(yǎng)后，如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)

29、氣，則可報(bào)告為陰性。如有產(chǎn)氣者，則按下列程序進(jìn)行。 3. 證實(shí)試驗(yàn) 將所有產(chǎn)氣發(fā)酵管分別劃線轉(zhuǎn)種到伊紅美藍(lán)瓊脂平板（EMB）上，置361溫箱內(nèi)，培養(yǎng)1824h，同時(shí)取該培養(yǎng)液12滴接種到蛋白胨水中，置440.5培養(yǎng)24 h2h。 經(jīng)培養(yǎng)后取出平板，觀察有無(wú)典型菌落生長(zhǎng)。大腸菌群在伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上的典型菌落呈深紫黑色，圓形，邊緣整齊，表面光滑濕潤(rùn)，常具有金屬光澤。（也有的呈紫黑色，不帶或略帶金屬光澤，或粉紫色，中心較深的菌落。亦常為大腸菌群，均應(yīng)注意挑選）。 挑取上述可疑菌落，涂片作革蘭氏染色鏡檢。 在蛋白胨水培養(yǎng)液中，加入靛基質(zhì)試劑約0.5mL，觀察靛基質(zhì)反應(yīng)。陽(yáng)性者液面呈玫瑰紅色；陰性反

30、應(yīng)液面呈試劑本色。第四十九張，PPT共七十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月食品衛(wèi)生細(xì)菌的檢測(cè)技術(shù) 4結(jié)果評(píng)定 凡平板上有典型菌落，革蘭氏陰性短桿菌，靛基質(zhì)試驗(yàn)陽(yáng)性者，則證實(shí)為糞大腸菌群陽(yáng)性，則可報(bào)告被檢樣品中檢出糞大腸菌群。 5結(jié)果報(bào)告 根據(jù)證實(shí)為糞大腸菌群陽(yáng)性管數(shù)，查表7-2“大腸菌群最可能數(shù)MPN檢索表”，報(bào)告每100mL（g）糞大腸菌群的最可能數(shù)。第五十張，PPT共七十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月食品衛(wèi)生細(xì)菌的檢測(cè)技術(shù) （七）說(shuō)明 1MPN檢索表 MPN 為最大可能數(shù)（Most Probable Number）的簡(jiǎn)稱。這種方法，對(duì)樣品進(jìn)行連續(xù)系列進(jìn)行稀釋，加入培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，從規(guī)定的反應(yīng)呈陽(yáng)性管

31、數(shù)的出現(xiàn)率，用概率論來(lái)推算樣品中菌數(shù)最近似的數(shù)值。 MPN檢索表只給了三個(gè)稀釋度，如改用不同的稀釋度，則表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低或增加10倍。 2 初發(fā)酵和證實(shí)試驗(yàn) 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的三步法，是利用了乳糖發(fā)酵管進(jìn)行了兩次發(fā)酵試驗(yàn)，為了證實(shí)培養(yǎng)物是否符合大腸菌群的定義，即“在37分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣”。 初發(fā)酵陽(yáng)性管，不能肯定就是大腸菌群細(xì)菌，經(jīng)過(guò)證實(shí)試驗(yàn)后，有時(shí)可能成為陰性。有數(shù)據(jù)表明，食品中大腸菌群檢驗(yàn)步驟的符合率，初發(fā)酵與證實(shí)試驗(yàn)相差較大。因此，在實(shí)際檢測(cè)工作中，證實(shí)試驗(yàn)是必需的。第五十一張，PPT共七十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月食品衛(wèi)生細(xì)菌的檢測(cè)技術(shù) 3乳糖發(fā)酵試驗(yàn) 乳糖發(fā)酵試驗(yàn)使用乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基，細(xì)

32、菌分解糖類是依靠細(xì)菌細(xì)胞所產(chǎn)生的各種酶類的作用，細(xì)菌產(chǎn)生的分解糖的酶隨細(xì)菌種類不同而異，可以此鑒別細(xì)菌。 大腸桿菌能分解乳糖而產(chǎn)生酸，使培養(yǎng)基的pH降低（指示劑變色）。這一現(xiàn)象可作為觀察結(jié)果的指標(biāo)。大腸桿菌細(xì)胞在酸性環(huán)境中，由于甲酸脫氫酶的作用，可使甲酸分解成C02和H2，在培養(yǎng)基中產(chǎn)生大量氣體而進(jìn)入倒管中，以觀察產(chǎn)氣。第五十二張，PPT共七十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月食品衛(wèi)生細(xì)菌的檢測(cè)技術(shù) 產(chǎn)氣量與倒管： 在乳糖發(fā)酵試驗(yàn)中，經(jīng)?？梢钥吹皆诎l(fā)酵倒管內(nèi)有極微量的氣泡，（有時(shí)比小米粒還小），有時(shí)可以遇到在初發(fā)酵時(shí)產(chǎn)酸或沿管壁有緩緩上浮的小氣泡。類似這樣的情況能否算產(chǎn)氣陰性？一般來(lái)說(shuō)產(chǎn)氣量與大腸菌群

33、檢出率呈正相關(guān)，但產(chǎn)氣量小不一定大腸菌群都是陰性，因此應(yīng)慎重處理。實(shí)驗(yàn)表明，大腸菌群的產(chǎn)氣量，多者可以使發(fā)酵倒管全部充滿氣體，少者可以產(chǎn)生比小米粒還小的氣泡。如果對(duì)產(chǎn)酸但未產(chǎn)氣的乳糖發(fā)酵如有疑問(wèn)時(shí)，可以用手輕輕打動(dòng)試管，如有氣泡沿管壁上浮，即應(yīng)考慮可能有氣體產(chǎn)生，而應(yīng)作進(jìn)一步試驗(yàn)。第五十三張，PPT共七十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月食品衛(wèi)生細(xì)菌的檢測(cè)技術(shù) 4挑選菌落 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法規(guī)定伊紅美藍(lán)平板為分離培養(yǎng)基，需要對(duì)初發(fā)酵陽(yáng)性培養(yǎng)物接種于伊紅美藍(lán)平板分離，對(duì)典型和可疑菌落進(jìn)行觀察和證實(shí)試驗(yàn)。在該平板上，大腸菌群細(xì)菌發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸，使伊紅美藍(lán)結(jié)合成黑色化合物，故菌落呈黑紫色，有時(shí)還可產(chǎn)生金屬光澤。而不

34、發(fā)酵乳糖的細(xì)菌如沙門(mén)氏菌、志賀氏菌等則為無(wú)色菌落。 由于大腸菌群是一群細(xì)菌的總稱，在平板大腸菌群菌落的色澤、形態(tài)等方面較大腸菌更為復(fù)雜和多樣，而且與大腸菌群的檢出率密切相關(guān)。大腸菌群或糞大腸菌群菌落呈黑紫色有光澤或無(wú)光澤時(shí)，檢出率最高；紅色、粉紅色菌落檢出率較低。第五十四張，PPT共七十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月食品衛(wèi)生細(xì)菌的檢測(cè)技術(shù) 另外，挑取菌落數(shù)與大腸菌群的檢出率有密切關(guān)系，只挑取一個(gè)菌落，由于機(jī)率問(wèn)題，尤其當(dāng)菌落不典型時(shí)，很難避免假陰性的出現(xiàn)。所以挑菌落一定要挑取典型菌落，如無(wú)典型菌落則應(yīng)多挑幾個(gè)，以免出現(xiàn)假陰性。 5抑菌劑 大腸菌群檢驗(yàn)中常用的抑菌劑有膽鹽、十二烷基硫酸鈉、洗衣粉、煌

35、綠、龍膽紫、孔雀綠等。抑菌劑的主要作用是抑制其它雜菌，特別是革蘭氏陽(yáng)性菌的生長(zhǎng)。 抑菌劑雖可抑制樣品中的一些雜菌，而有利于大腸菌群細(xì)菌的生長(zhǎng)和挑選，但對(duì)大腸菌群中的某些菌株有時(shí)也產(chǎn)生一些抑制作用。有些抑菌劑用量甚微，稱量時(shí)稍有誤差，即可對(duì)抑菌作用產(chǎn)生影響，因此抑菌劑的添加應(yīng)嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。 在膽鹽用量上，實(shí)驗(yàn)表明l、0.5和0.25三個(gè)劑量間無(wú)何差異，所以本方法采用的膽鹽劑量（0.5）是適宜的，在稱量時(shí)稍有誤差，亦不致影響大腸菌群的檢出。第五十五張，PPT共七十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月食品衛(wèi)生細(xì)菌的檢測(cè)技術(shù) 二、LTSE快速檢驗(yàn)法 （一）原理 大腸菌群能分解乳糖，由于具有甲酸解氫酶作用

36、于甲酸，產(chǎn)生氫和二氧化碳?xì)怏w，因此氣體的產(chǎn)生是在產(chǎn)酸的同時(shí)進(jìn)一步分解酸而形成的。根據(jù)這個(gè)原理，將樣品接種到LTSE培養(yǎng)基肉湯內(nèi)15h?？唇Y(jié)果有無(wú)產(chǎn)氣現(xiàn)象，然后加氧化酶試驗(yàn)和涂片革蘭氏染色鏡檢結(jié)果綜合判斷是否有大腸菌群的存在。 （二）設(shè)備與材料 高壓蒸汽滅菌鍋、干熱滅菌箱、恒溫箱培養(yǎng)箱、天平、均質(zhì)器、顯微鏡、冰箱、接種環(huán)、載玻片、試管、童漢氏小管、刻度吸管等。第五十六張，PPT共七十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月食品衛(wèi)生細(xì)菌的檢測(cè)技術(shù)（三）培養(yǎng)基和試劑 1LTSE培養(yǎng)基肉湯（1號(hào)）成分：乳糖 5g胰蛋白胨 20gSDS（十二烷基硫酸鈉） 0.5g氯化鈉 5g磷酸氫二鈉（無(wú)水） 5.74g磷酸二氫鉀（

37、無(wú)水） 1g微量元素溶液 0.5mL蒸餾水 1000mLpH 7.01第五十七張，PPT共七十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月食品衛(wèi)生細(xì)菌的檢測(cè)技術(shù) 制法：將上述各固體成分加到蒸餾水中，加熱溶解，調(diào)節(jié)pH為7.01，冷卻后再加微量元素溶液05mL，邊加邊搖勻，分裝入有童漢氏小管的試管各5mL。雙料成分均加倍，即將上述LTSE肉湯濃縮2倍配制，分裝入內(nèi)有童漢氏小管的試管各10mL（僅分裝30mL的供醬油及醬類檢驗(yàn)用），置高壓蒸汽滅菌器中以115滅菌2030min，貯存于4冰箱或陰涼處備用。 2氧化酶試劑（1鹽酸二甲基對(duì)苯二胺） 配制：稱取鹽酸二甲基對(duì)苯二胺01g，溶于蒸餾水10mL，于冰箱內(nèi)避光保存。

38、 3革蘭氏染液 見(jiàn)本章本節(jié)一。第五十八張，PPT共七十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月食品衛(wèi)生細(xì)菌的檢測(cè)技術(shù) （四）檢驗(yàn)程序 大腸菌群LTSE快速檢驗(yàn)法檢驗(yàn)程序見(jiàn)圖7-4。 （五）操作步驟 1檢樣稀釋 （1）以無(wú)菌操作將檢樣25mL（或25g）放于含有225mL滅菌生理鹽水的無(wú)菌瓶?jī)?nèi)，經(jīng)研磨或充分振搖溶解成為110的均勻稀釋液。 固體檢樣最好用均質(zhì)器，以800010000r/min的速度處理1min做成110的均勻稀釋液。 （2）用lmL滅菌吸管吸取110稀釋液lmL，注入含有9mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內(nèi)，振搖試管混勻，做成1100的稀釋液。 （3）另取lmL滅菌吸管，按上項(xiàng)操作依次10倍

39、遞增稀釋液，每遞增稀釋一次，換用1支lmL滅菌吸管。 （4）根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)z樣污染情況的估計(jì)，選擇3個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種3管。第五十九張，PPT共七十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 圖7-4 大腸菌群LTSE快速檢驗(yàn)法檢驗(yàn)程序 第六十張，PPT共七十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月食品衛(wèi)生細(xì)菌的檢測(cè)技術(shù) 2預(yù)測(cè)試驗(yàn) 將待檢樣品接種于LTSE發(fā)酵管內(nèi)，接種在10mL或10mL以上者，用雙料LTSE發(fā)酵管，lmL及l(fā)mL以下者，用單料LTSE發(fā)酵管。預(yù)測(cè)試驗(yàn)采用9管法，每一稀釋度接種3管，置371溫箱內(nèi)，培養(yǎng)15h1h，觀察結(jié)果，如有混濁并產(chǎn)氣者，即表示為陽(yáng)性管。對(duì)陽(yáng)性管繼續(xù)做證實(shí)試驗(yàn)。 3證

40、實(shí)試驗(yàn) （1）菌液涂片 用直徑34mm的接種環(huán)挑取菌液23環(huán)進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢。有革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌，而雜菌無(wú)或者很少。 （2）氧化酶試驗(yàn) 吸取產(chǎn)氣管中的培養(yǎng)物約0.5lmL，滴加氧化酶試劑23滴，搖勻，顯粉紅色或深紅色示為氧化酶陽(yáng)性，不變色或呈試劑的本色為陰性反應(yīng)。第六十一張，PPT共七十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月食品衛(wèi)生細(xì)菌的檢測(cè)技術(shù) （六）結(jié)果判斷和報(bào)告 如有產(chǎn)氣，氧化酶陰性、革蘭氏陰性的無(wú)芽孢桿菌存在，表示大腸菌群陽(yáng)性，然后查MPN檢查表（見(jiàn)表7-2），計(jì)算MPN值。 （七）正確使用LTSE檢驗(yàn)方法的說(shuō)明 1方法的研制與樣品考核結(jié)果 （1）LTSE法的敏感性與特異性。大腸菌群4個(gè)屬

41、菌株在LTSE培養(yǎng)基上經(jīng)37，15h出現(xiàn)結(jié)果，采用多種常見(jiàn)的非大腸菌群的菌株檢測(cè)不酵解乳糖產(chǎn)氣，經(jīng)試驗(yàn)證明本法靈敏度高，特異性強(qiáng)，比常規(guī)法節(jié)約經(jīng)費(fèi)8258%以上。第六十二張，PPT共七十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月食品衛(wèi)生細(xì)菌的檢測(cè)技術(shù) （2）LTSE培養(yǎng)基的各種成分都是經(jīng)過(guò)了很多試驗(yàn)反復(fù)摸索研制成功的，其營(yíng)養(yǎng)豐富，抑制雜菌效果強(qiáng)，具有加快目的菌生長(zhǎng)發(fā)育和促進(jìn)發(fā)酵緩慢的大腸菌群產(chǎn)酸產(chǎn)氣的效果。在證實(shí)試驗(yàn)中增加了氧化酶試驗(yàn)反應(yīng)，具有排除非腸道桿菌對(duì)乳糖發(fā)酵產(chǎn)氣的特殊功能。本方法不必加入指示劑，便于做證實(shí)試驗(yàn)。 （3）本方法研制成功后，經(jīng)不同的衛(wèi)生監(jiān)測(cè)單位實(shí)驗(yàn)考核各類食品樣品共計(jì)703件，結(jié)果與常規(guī)

42、法總符合率為99.3；而與美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)（ANSl）A-1快速法比較,其特異性與敏感性為優(yōu)。第六十三張，PPT共七十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月食品衛(wèi)生細(xì)菌的檢測(cè)技術(shù) 2革蘭氏染色的涂片檢查說(shuō)明 本方法加有涂片檢查，主要是進(jìn)一步證實(shí)大腸菌群的形態(tài)，因本方法的LTSE培養(yǎng)基SDS加的量大，SDS抑制革蘭氏陽(yáng)性菌的效果好且不影響大腸菌群的生長(zhǎng)，如果檢驗(yàn)人員沒(méi)有時(shí)間，可以省去涂片和鏡檢這兩步，結(jié)果其可靠性仍在99以上。 3操作注意事項(xiàng)及經(jīng)驗(yàn)介紹 （1）檢樣要嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，避免技術(shù)操作的差錯(cuò)。由于大腸菌群是呈分裂繁殖生長(zhǎng)，在水中往往具有聚集性及分布不均勻的現(xiàn)象，因此檢樣前固體和液體樣品如同常規(guī)法一樣，要經(jīng)

43、過(guò)前處理。 第六十四張，PPT共七十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月食品衛(wèi)生細(xì)菌的檢測(cè)技術(shù) （2）培養(yǎng)基滅菌后，童漢氏小管（小倒管）中應(yīng)無(wú)氣泡方能使用；做氧化酶試驗(yàn)的小試管要清潔干凈。 （3）本方法靈敏度高，3715h培養(yǎng)與常規(guī)法符合率基本一致（即99100），超過(guò)15h可提高檢出率。 （4）初次觀察試管法氧化酶試驗(yàn)難以辨別真假陽(yáng)性結(jié)果，可采用氧化酶陽(yáng)性結(jié)果的非腸桿菌科菌株做陽(yáng)性對(duì)照，如綠膿桿菌、腦膜炎雙球菌、弧菌科菌株等等。第六十五張，PPT共七十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月食品衛(wèi)生細(xì)菌的檢測(cè)技術(shù) 三、TTC（氯化三苯四氮唑）顯色快速法 （一）培養(yǎng)基 1 TTC乳糖培養(yǎng)基 （1）2乳糖發(fā)酵管 成分：

44、 乳糖20g、蛋白胨20g、蒸餾水1000mL、pH7.4。 制法： 將乳糖、蛋白胨溶解于蒸餾水，調(diào)節(jié)pH為7.4，分裝于含有小倒管的試管中，每管2.5mL，110經(jīng)15min高壓滅菌后備用。 （2）TTC培養(yǎng)液 成分： 蛋白胨20g、氯化鈉10g、磷酸鈉（Na2HPO412H2O）10g、十二烷基硫酸鈉4g、蒸餾水1000mL、pH7.4。第六十六張，PPT共七十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月食品衛(wèi)生細(xì)菌的檢測(cè)技術(shù) 制法： 將以上成分加熱溶解，調(diào)pH7.4，分裝于三角瓶，于121經(jīng)15min滅菌后，冷至室溫，備用；臨用前加入無(wú)菌100g/L的無(wú)菌TTC水溶液8mL，輕輕搖勻。 （3）分裝 以無(wú)菌

45、操作，把TTC培養(yǎng)液分裝2乳糖管中，每管加2.5mL，培養(yǎng)后無(wú)污染者可使用。 2三料TTC乳糖培養(yǎng)基 除蒸餾水外，其他成分按TTC乳糖培養(yǎng)基3倍，TTC 2倍，制法同上（加入TTC后培養(yǎng)液稍有云霧狀混濁，是正?，F(xiàn)象，不影響培養(yǎng)結(jié)果）。 （二）檢驗(yàn)方法 1接種 每份樣品以無(wú)菌操作接種1mL、0.1mL及0.01mL各3管于TTC乳糖培養(yǎng)基中，如接種量為10mL，則用三料TTC乳糖培養(yǎng)基。 2培養(yǎng) 接種后，置3537溫箱培養(yǎng)1824h。第六十七張，PPT共七十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月食品衛(wèi)生細(xì)菌的檢測(cè)技術(shù) （三）結(jié)果判斷 觀察TTC乳糖培養(yǎng)液有無(wú)產(chǎn)紅色及產(chǎn)氣，結(jié)果判定如表7-3。表7-3 顯色法

46、大腸菌群結(jié)果判斷第六十八張，PPT共七十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月食品衛(wèi)生細(xì)菌的檢測(cè)技術(shù)（四）結(jié)果報(bào)告根據(jù)陽(yáng)性管數(shù)，查表7-2“大腸菌群最可能數(shù)MPN檢索表”。 四、DC（去氧膽酸鈉）半固體試管快速法（一）培養(yǎng)基1成分蛋白胨 1.5g氯化鈉 0.5g乳糖 lgK2HPO43H20 0.3g檸檬酸鐵銨 0.2g10去氧膽酸鈉水溶液 lmL0.4BTB 1.6mL安氏指示劑 2mL瓊脂粉（或瓊脂條0.8g） 0.7g 蒸餾水 lOOmLpH 7.2第六十九張，PPT共七十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月食品衛(wèi)生細(xì)菌的檢測(cè)技術(shù) 2制法 將以上固體成分加熱溶解于水，調(diào)整pH7.2，隨即加入二組指示劑與10去氧膽酸鈉水溶液，最后煮沸3min備用。 （二）檢驗(yàn)方法 1樣品處理 各類樣品的處理與接種量均按國(guó)