抗黏液蛋白1單抗偶聯(lián)吉西他濱聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒對(duì)胰腺癌模型動(dòng)物抑瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究

1、抗黏液蛋白1單抗偶聯(lián)吉西他濱聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒對(duì)胰腺癌模型動(dòng)物抑瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究胰腺癌是嚴(yán)重威脅國人健康與生命的一種惡性腫瘤，近年來發(fā)病率及死亡率呈快速上升的趨勢(shì)。胰腺癌早期無明顯癥狀，難以發(fā)現(xiàn)，確診時(shí)大多為進(jìn)展期，又缺乏有效的治療手段，故預(yù)后極差。因此針對(duì)晚期胰腺癌有效而不良反應(yīng)低的治療方法是目前研究的熱點(diǎn)。本課題組先期研究以抗表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)作為靶點(diǎn)，將抗EGFR抗體偶聯(lián)到載吉西他濱聚氰基丙烯酸正丁酯納米微球(EGFR-GEM-PBCA-NP)，用于治療胰腺癌移植瘤，結(jié)果顯示有一定的靶向性和抑瘤作用，但效

2、果不甚理想。近年來黏液蛋白1（mucin 1，MUC1）作為新的靶點(diǎn)進(jìn)入了研究者的視野。因MUC1在胰腺癌組織的表達(dá)率高達(dá)80%， 故本課題組將抗MUC1單克隆抗體偶聯(lián)到GEM-PBCA-NP，通過胰腺癌PANC1細(xì)胞株的體外實(shí)驗(yàn)，顯示MUC1-GEM-PBCA-NP能抑制癌細(xì)胞的增殖。本研究進(jìn)一步行MUC1-GEM-PBCA-NP治療胰腺癌的動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。一、材料與方法1MUC1-GEM-PBCA-NP制備：MUC1單抗購自Abnova公司。GEM-PBCA-NP的制備參考李春梅等方法。將GEM-PBCA-NP與抗MUC1單克隆抗體完全混合溶于pH7.4的SBF溶液, 低速磁力攪拌下按一定比

3、例加入碳二亞胺溶液, 混均后離心取沉淀。超聲分散沉淀物后，用去離子水洗滌4遍，冷凍干燥獲取抗MUC1單抗與GEM-PBCA-NP的交聯(lián)物（MUC1-GEM-PBCA-NP）。應(yīng)用激光散射粒度分析儀（Zeta sizer Nano ZS90型，英國馬爾文公司）觀察微球粒的大小及抗體的分布，計(jì)算包封率及載藥率。包封率=納米微球粒實(shí)際載藥量/總投藥量100%；載藥率=納米微球粒實(shí)際載藥量/稱取的納米微球粒質(zhì)量100%。2體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)：人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC1由北京富眾科技發(fā)展有限公司提供,常規(guī)復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代。BALB/c裸鼠45只，56周齡，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。參考馬琳等及李春梅等方法

4、制備荷瘤裸鼠模型，即取0.2 ml（610 7/ml）PANC1細(xì)胞懸液注射于裸鼠右側(cè)腋部皮下，待瘤體最大徑0.5cm（需710 d）為建模成功。共39只裸鼠成功建模，按數(shù)字表法將其中35只隨機(jī)分為5組，每組7只。MUC1-GEM-PBCA-NP組，經(jīng)尾靜脈注射2.5 mg/kg吉西他濱(gemcita bine,GEM)等藥劑量的MUC1-GEM-PBCA-NP；GEM-PBCA-NP組，經(jīng)尾靜脈注射等藥劑量GEM-PBCA-NP；GEM組：經(jīng)尾靜脈注射GEM 2.5 mg/kg；單純納米顆粒組(PBCA-NP組)，經(jīng)尾靜脈注射等容積PBCA-NP；對(duì)照組，經(jīng)尾靜脈注射等容積生理鹽水。每5

5、d重復(fù)治療1次，每3 d測(cè)量1次腫瘤長(zhǎng)徑(a)和短徑(b)，計(jì)算腫瘤體積（V），V=ab 2/2。實(shí)驗(yàn)開始后第15天及第30天上IVISLumina LT小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)（美國PerkinElmer）行活體生物發(fā)光檢測(cè)成像并記錄，生物發(fā)光實(shí)驗(yàn)參考王劍超等方法。第30天處死裸鼠，剝離瘤體稱重，計(jì)算抑瘤率。抑瘤率=(對(duì)照組瘤重實(shí)驗(yàn)組瘤重)/對(duì)照組瘤重100%。3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以xs表示，組間比較采用單因素方差分析。計(jì)數(shù)資料以百分率表示，組間比較采用2檢驗(yàn)。P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。二、結(jié)果1各組納米粒子電鏡下觀察結(jié)果：MUC1-GEM-PBCA-

6、NP組電鏡下觀察制備的納米顆粒形態(tài)為光滑的球形，藥物GEM細(xì)顆粒均勻地分散在聚合物基質(zhì)中。GEM-PBCA-NP組和MUC1-GEMPBCA-NP組納米粒大小分別為（49.626.17）nm和（58.146.44）nm。GEM-PBCA-NP組和MUC1-GEMPBCA-NP組納米粒中GEM的包封率分別為（44.524.22）%、（47.193.63）%，載藥量分別為（7.240.71）%、（6.850.56）%。表面修飾后納米粒子并無明顯變化，表明MUC1-GEM-PBCA-NP靶向載藥納米粒子制備成功。2MUC1-GEM-PBCA-NP1的裸鼠移植瘤抑瘤效果：治療后30 d，MUC1-GE

7、M-PBCA-NP組、GEM-PBCA-NP組、GEM組裸鼠的抑瘤率顯著高于PBCA-NP組及對(duì)照組，MUC1-GEM-PBCA-NP組抑瘤率又顯著高于GEM-PBCA-NP組、GEM組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均0.05)，而GEM-PBCA-NP組與GEM組抑瘤率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1，表1）。3裸鼠移植腫瘤的光子量變化：MUC1-GEM-PBCA-NP組、GEM-PBCA-NP組、GEM組、PBCA-NP組及對(duì)照組治療前移植瘤基礎(chǔ)光子量均值分別為3.440.56、4.010.59、3.790.61、4.200.62、3.640.56，各組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；治療第15天移植瘤光子量均值

8、分別為7.210.76、14.481.34、13.771.52、27.253.56、29.522.43，其中MUC1-GEM-PBCA-NP組顯著低于其余各組（P值均0.05，圖2），GEM-PBCA-NP組和GEM組又顯著低于PBCA-NP組和對(duì)照組（P值均0.05），其余組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；治療第30天移植瘤光子量均值分別為9.460.89、17.271.89、18.431.98、36.154.98、38.3824.22，其中MUC1-GEM-PBCA-NP組顯著低于其余各組（P值均0.05），GEM-PBCA-NP組和GEM組也顯著低于PBCA-NP組和對(duì)照組（P值均0.05），其余

9、組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。MUC1-GEM-PBCA-NP組給藥第15天和第30天的移植瘤光子抑制率分別為67.27%和74.29%。討論近年來納米載藥系統(tǒng)成為一個(gè)主要的研究方向。國內(nèi)外已經(jīng)有采用納米載藥系統(tǒng)進(jìn)行胰腺癌治療的研究，如金納米粒子、碳納米管、納米二氧化硅和超順磁性、氧化鐵納米粒子等無機(jī)納米粒子以及白蛋白納米粒子、殼聚糖納米粒子等有機(jī)納米粒子在胰腺癌診斷、治療方面已取得一定成績(jī)，但仍有諸多問題需進(jìn)一步解決，其中分子靶點(diǎn)問題是一個(gè)研究熱點(diǎn)。MUC是一類大分子量糖蛋白，在正常生理狀態(tài)下，MUC的表達(dá)具有明確的組織特異性和時(shí)間特異性。在病理狀態(tài)下，MUC表達(dá)異常是許多疾病及腫瘤的特征，尤其在

10、胰腺癌組織中，MUC1異常表達(dá)已被研究證實(shí)。已有研究以MUC1作為引導(dǎo)納米粒子的靶向分子，顯示在胰腺癌中具有良好的導(dǎo)向作用。張重捷等制備了抗MUC1單克隆抗體靶向修飾的探針超順磁納米顆粒，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該納米顆?？梢赃x擇性地積聚在裸鼠移植瘤內(nèi)，可作為磁共振檢查時(shí)特異性顯影劑使用，提示MUC1作為靶點(diǎn)治療胰腺癌的可行性。因此本研究也采用抗MUC1單克隆抗體靶向修飾載GEM納米微粒的類似策略。聚氰基丙烯酸正丁酯納米微粒（PBCA-NP）作為藥物載體具有顆粒大小適中，可避免內(nèi)皮網(wǎng)狀系統(tǒng)吞噬，快速分布于組織，具有優(yōu)良的藥物緩釋作用, 本課題組前期的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)已顯示其良好的載藥及藥物釋放作用。本研究結(jié)果顯示，MUC1-GEM-PBCA-NP對(duì)于裸鼠胰腺癌移植瘤的抑制作用明顯優(yōu)于無抗體偶聯(lián)的GEM-PBCA-NP及GEM直接的藥物作用，而GEM-PBCA-NP與GEM的抑制作用未見明顯差異，提示抗MUC1單抗對(duì)于載GEM納米微粒的動(dòng)物體內(nèi)導(dǎo)向作用較為顯著，與本課題組前期的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。本研究通過腫瘤生長(zhǎng)曲線、腫瘤體重計(jì)算及活體生物發(fā)光顯像等方法評(píng)估MUC1-GEM-PBCA-