端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶在急性壞死性胰腺炎大鼠中性粒細胞凋亡中的作用

1、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶在急性壞死性胰腺炎大鼠中性粒細胞凋亡中的作用SAP是由胰腺局部炎癥所致，累及全身炎癥反應(yīng)綜合征，繼而造成多器官功能障礙綜合征的臨床危重病。“白細胞過度激活學(xué)說”是SAP發(fā)病的重要機制之一。胰腺組織自身消化釋放內(nèi)源性物質(zhì)，激活中性粒細胞，使得其凋亡延遲，繼而釋放大量炎癥因子，引發(fā)“瀑布”效應(yīng)，致使SAP患者出現(xiàn)全身炎癥反應(yīng)綜合征。傳統(tǒng)觀點認為，端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)僅在腫瘤細胞、生殖細胞、造血細胞中表達。2008年Lepreux等首次發(fā)現(xiàn)TERT在中性粒細胞胞質(zhì)中表達。近年有研究報道，冠心病、原發(fā)性卵巢功能不全患

2、者中性粒細胞TERT水平異常表達，中性粒細胞凋亡延遲，但迄今為止，未見SAP時中性粒細胞TERT表達水平的相關(guān)報道。因此，本研究探討TERE對急性壞死性胰腺炎(acute necrotizing pancreatitis，ANP)大鼠中性粒細胞凋亡的影響。材料與方法一、動物與分組24只SPF級Sprague-Dawley雄性大鼠由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，許可證號SCXK(滬)2017-0005。大鼠禁食12 h，自由飲水，按數(shù)字表法隨機分為正常對照組，ANP 3、6 h組和TERT抑制劑BIBR1532干預(yù)組（BIBR1532組），每組6只。ANP組大鼠采用胰膽管逆行注射5%牛磺膽酸鈉

3、(1 ml/kg)造模，分別在造模后3、6 h處死，經(jīng)心臟采血。BIBR1532組大鼠在造模前腹腔注射2 mg/kg TERT抑制劑BIBR1532（美國EMC公司），每周3次，連續(xù)2周，于造模3 h后處死，經(jīng)心臟采血。正常對照組大鼠未經(jīng)任何處理。取各組大鼠胰腺組織，置10%甲醛溶液中固定。二、方法1外周血中性粒細胞分離：采集的大鼠血樣本經(jīng)1%葡聚糖沉淀紅細胞，取上層富含粒細胞的血漿，按11容積加入大鼠淋巴細胞分離液，以1 500r/min離心20 min，離心半徑9 cm。通過低滲溶液溶解紅細胞，Percoll密度梯度離心法分離中性粒細胞，采用臺盼藍、瑞氏染色檢測中性粒細胞存活率和純度。2中

4、性粒細胞TERT mRNA檢測：應(yīng)用熒光定量PCR法檢測中性粒細胞的TERT mRNA表達量。TERT正向引物序列為5-CAGATGCGACCCCTATTC-3，反向引物序列為5-TGTAACCGGAGCAAACTC-3；內(nèi)參GAPDH正向引物序列為5-TATCGGACGCCTGGTTAC-3，反向引物序列為5-CTGTGCCGTTGAACTTGC-3。引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計合成。反應(yīng)條件：95 10 min，95 15 s、60 15 s，40個循環(huán)。通過儀器自帶軟件獲取Ct值，以公式2Ct計算mRNA相對表達量。3中性粒細胞TERT蛋白及凋亡相關(guān)蛋白檢測：采用蛋白質(zhì)免疫印跡

5、法檢測TERT蛋白及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-xL、Bax表達量。抗TERT、Bcl-xL、Bax單克隆抗體購自英國abcam公司，工作濃度均為11 000；辣根過氧化物酶標記的二抗購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，工作濃度為1200。最后ECL發(fā)光，X片曝光、顯影、定影。Image J軟件分析各條帶灰度值，以目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度值比為蛋白相對表達量。4中性粒細胞凋亡檢測：取含2106/ml中性粒細胞的RPMI1640培養(yǎng)液500l，均勻接種于24孔板，常規(guī)培養(yǎng)16 h后，依次加入2.5 l Annexin V-FITC 和5.0l碘化丙啶（PI）溶液，上流式細胞儀檢測中性粒細胞凋亡。5血清TNF

6、-、IL-6檢測：收集與分離大鼠外周血血清，ELISA檢測試劑盒 （美國eBioScience 公司）檢測各組大鼠血清TNF-、IL-6水平，按試劑盒說明書操作。6胰腺組織病理學(xué)檢查：取甲醛溶液固定的胰腺組織標本，常規(guī)石蠟包埋、切片，蘇木精-伊紅染色，光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理改變。三、統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計量資料采用xs表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。P95%（圖1A）；臺盼藍染色顯示極少量細胞呈淡藍色，中性粒細胞存活率97%（圖1B）。正常對照組、ANP 3 h組、ANP 6 h組、BIBR1532組外周血中性粒細胞TERT mRNA表達量分別

7、為1.030.26、3.311.07、5.210.78、1.950.49，TERT蛋白表達量分別0.090.03、0.430.12、0.580.11、0.220.07（圖2），ANP 3、6 h 組TERT mRNA及蛋白表達水平高于正常對照組，而BIBR1532組低于ANP 3 h組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t值分別為5.08、12.52、2.82，6.92、7.69、4.05；P值均0.05）。表明TERT mRNA及蛋白在ANP大鼠外周血中性粒細胞中高表達。二、各組大鼠中性粒細胞Bcl-xL、Bax蛋白的表達正常對照組、ANP 3 h組、ANP 6 h組、BIBR1532組中性粒細胞的Bcl

8、-xL蛋白表達量分別為0.190.05、0.500.07、0.850.04、0.400.11，Bax蛋白表達量分別0.290.08、0.230.03、0.170.02、0.430.12(圖3)。與正常對照組比較，ANP 3、6 h組的Bcl-xL表達量上升（t值分別為7.75、16.30，P值均0.05），而Bax表達量下降（t值分別為4.22、6.74，P值均0.05）；與ANP 3 h組比較，BIBR1532組Bcl-xL表達量下降（t=5.42，P0.05），而Bax表達量上升（t=5.59，P0.05）。表明TERT表達量升高則抑制ANP大鼠外周血中性粒細胞凋亡。三、各組大鼠中性粒細胞

9、凋亡率中性粒細胞體外培養(yǎng)16 h后，正常對照組、ANP 3 h組、ANP 6 h組、BIBR1532組外周血中性粒細胞凋亡率分別為（10.030.74）%、（7.990.27）%、（6.650.36）%、（22.982.86）%。ANP 3、6 h 組中性粒細胞凋亡率低于正常對照組，而BIBR1532組高于ANP 3 h組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t值分別為4.52、7.27、12.63，P值均0.05，圖4）。四、各組大鼠血清TNF-、IL-6水平正常對照組、ANP 3 h組、BIBR1532組血清TNF-水平分別為(96.6727.12)、(382.3046.33)、(206.8836.42)

10、 ng/L，IL-6水平分別為(43.3414.50)、(134.2116.13)、(88.0613.05)ng/L，ANP 3 h組TNF-、IL-6水平均高于正常對照組，BIBR1532組TNF-、IL-6水平均低于ANP 3 h組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t值分別為22.57、12.63,17.77、9.43；P值均0.05）。表明TERT高表達可上調(diào)血清TNF-、IL-6水平。五、各組大鼠胰腺組織的病理改變正常對照組大鼠胰腺組織結(jié)構(gòu)完整，無間質(zhì)充血、出血和腺泡細胞壞死。ANP組大鼠胰腺組織可見大量的炎癥細胞浸潤，小葉間隔增寬、結(jié)構(gòu)破壞，組織壞死。BIBR1532組大鼠胰腺組織病理改變較AN

11、P組明顯改善（圖5）。表明TERT高表達可加重ANP大鼠胰腺組織的炎癥損傷。討 論端粒酶為自身攜帶模板的核蛋白逆轉(zhuǎn)錄酶，由TERT、端粒酶RNA、端粒酶相關(guān)蛋白3個主要的亞單位組成。端粒酶是細胞凋亡延遲的關(guān)鍵信號分子，通過端粒和非端粒保護機制，維持端粒長度和改善線粒體功能，抑制細胞凋亡。TERT是端粒酶活化的限速酶，其表達程度反映端粒酶活性水平。研究發(fā)現(xiàn)，動脈粥樣硬化大鼠在持續(xù)炎癥遞質(zhì)刺激下，其動脈組織的端粒酶活性增加13倍；不穩(wěn)定型心絞痛患者外周血中性粒細胞端粒酶活性較健康者增加2倍，從動脈粥樣硬化患者的硬化斑塊分離出的中性粒細胞中端粒酶活性增加更顯著，其中35%患者的端粒酶活性增加50倍；原發(fā)性卵巢功能不全患者外周血中性粒細胞的端粒酶活性下降3倍，加速細胞衰老過程，進而導(dǎo)致卵巢內(nèi)卵泡的耗竭或功能失常。2011年von Figura等報道端粒酶基因敲除小鼠胰腺外分泌腺的再生能力降低，顯示端粒酶參與急性胰腺炎的發(fā)生和發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，ANP 大鼠外周血中性粒細胞的TERT mRNA及蛋白表達上調(diào)，細胞凋亡的時間