蛋白質(zhì)的分離與純化技術(shù)

1、蛋白質(zhì)的分離與純化技術(shù)2蛋白質(zhì)分離純化的目的蛋白質(zhì)分離純化的依據(jù)（蛋白質(zhì)的特性）蛋白質(zhì)穩(wěn)定存在的影響因素蛋白質(zhì)分離純化的一般程序蛋白質(zhì)的分離純化方法 濃縮、干燥及保存主要內(nèi)容3研究蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)、組成和某些物理化學(xué)性質(zhì)，需要純化的蛋白質(zhì)樣品。研究蛋白質(zhì)的生物功能，需要純品保持它的天然構(gòu)相。制藥工業(yè)中，需要把某種特殊功能的蛋白質(zhì)提純到規(guī)定的要求，特別是要把干擾或拮抗性質(zhì)的成分除去。一、蛋白質(zhì)分離純化的目的4分離和純化蛋白質(zhì)的各種方法主要是利用蛋白質(zhì)之間各種特性的差異，包括1.分子的大小和形狀2.酸堿性質(zhì)（帶電性質(zhì)）3.溶解度4.吸附性質(zhì)5.對(duì)配體分子的特異生物學(xué)親和力5蛋白質(zhì)分子由氨基酸組成，

2、在蛋白質(zhì)分子中保留著游離的末端氨基和羧基以及側(cè)鏈上的各種功能團(tuán)。蛋白質(zhì)也是一類(lèi)兩性電解質(zhì)，能和酸或堿發(fā)生作用?？山怆x基團(tuán)主要來(lái)自側(cè)鏈上的功能團(tuán) 。對(duì)某一種蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，在某一pH，它所帶的正電荷與負(fù)電荷恰好相等，也即凈電荷為零，這一pH稱為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（與蛋白質(zhì)所含氨基酸種類(lèi)有關(guān)）。 蛋白質(zhì)穩(wěn)定存在的影響因素 蛋白質(zhì)在生理?xiàng)l件下較為穩(wěn)定，但純化過(guò)程中的條件比生理環(huán)境要?jiǎng)×?，這就要求采取一些措施來(lái)保護(hù)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。7蛋白質(zhì)穩(wěn)定存在的影響因素溫度緩沖溶液蛋白酶搖動(dòng)剪切高壓層析柜8蛋白質(zhì)分離純化的一般程序9蛋白質(zhì)在組織或細(xì)胞中一般都是以復(fù)雜的混合形式存在，每種類(lèi)型的細(xì)胞都含有上千種不同的蛋白質(zhì)。蛋

3、白質(zhì)的分離(separation，isolation)和純化(purification)工作是生物化學(xué)中一項(xiàng)艱巨而繁重的任務(wù)。蛋白質(zhì)純化的總目標(biāo)是增加制品的純度(purity)或比活(specific activity)，以增加單位蛋白質(zhì)重量中所要蛋白質(zhì)的含量或生物活性(比活常以活力單位數(shù)毫克蛋白質(zhì)表示)。蛋白質(zhì)分離純化總目標(biāo) 10分離純化某一特定蛋白質(zhì)的一般程序前處理粗分級(jí)分離細(xì)分級(jí)分離 分離純化某一特定蛋白質(zhì)的一般程序可以分為前處理、粗分級(jí)分離和細(xì)分級(jí)分離3步。11(1) 前處理 (pretreatment) 分離純化某一蛋白質(zhì)，首先要求把蛋白質(zhì)從原來(lái)的組織或細(xì)胞中以溶解的狀態(tài)釋放出來(lái)，并

4、保持原來(lái)的天然狀態(tài)，不丟失生物活性。i) 材料的選擇ii）細(xì)胞的破碎iii）蛋白質(zhì)的溶解12i) 材料的選擇 微生物、植物和動(dòng)物都可做為制備蛋白質(zhì)的原材料，所選用的材料主要依據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩?lái)確定。對(duì)于微生物，應(yīng)注意它的生長(zhǎng)期，在微生物的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，酶和核酸的含量較高，可以獲得高產(chǎn)量，以微生物為材料時(shí)有兩種情況： 1利用微生物菌體分泌到培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物和胞外酶等； 2利用菌體含有的生化物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、核酸和胞內(nèi)酶等。13動(dòng)物材料應(yīng)先剔除結(jié)締組織和脂肪組織。種子材料應(yīng)先去殼甚至去種皮以免受雜質(zhì)的污染，油料種子最好先用低沸點(diǎn)的有機(jī)溶劑如乙醚等脫脂。然后根據(jù)不同的情況，選擇適當(dāng)?shù)姆椒?，將組織和細(xì)胞破碎。

5、14細(xì)胞破碎方法介紹1、高速組織搗碎：將材料配成稀糊狀液，放置于筒內(nèi)約1/3體積，蓋緊筒蓋，將調(diào)速器先撥至最慢處，開(kāi)動(dòng)開(kāi)關(guān)后，逐步加速至所需速度。此法適用于動(dòng)物內(nèi)臟組織、植物肉質(zhì)種子等。高速組織搗碎機(jī)15細(xì)胞破碎方法介紹2、玻璃勻漿器勻漿：先將剪碎的組織置于管中，再套入研桿來(lái)回研磨，上下移動(dòng)，即可將細(xì)胞研碎，此法細(xì)胞破碎程度比高速組織搗碎機(jī)為高，適用于量少和動(dòng)物臟器組織。玻璃勻漿器16細(xì)胞破碎方法介紹3、超聲波處理法：用一定功率的超聲波處理細(xì)胞懸液，使細(xì)胞急劇震蕩破裂，此法多適用于微生物材料，用大腸桿菌制備各種酶。 缺點(diǎn)：是在處理過(guò)程會(huì)產(chǎn)生大量的熱，應(yīng)采取相應(yīng)降溫措施。對(duì)超聲波敏感的核酸應(yīng)慎用

6、。超聲波處理儀174、反復(fù)凍融法：將細(xì)胞在-20度以下冰凍，室溫融解，反復(fù)幾次，由于細(xì)胞內(nèi)冰粒形成和剩余細(xì)胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎。5、化學(xué)處理法：有些動(dòng)物細(xì)胞，例如腫瘤細(xì)胞可采用十二烷基硫酸鈉（SDS）、去氧膽酸鈉等細(xì)胞膜破壞，細(xì)菌細(xì)胞壁較厚，可采用溶菌酶處理效果更好。細(xì)胞破碎方法介紹18細(xì)胞破碎基本規(guī)律動(dòng)物組織和細(xì)胞可用電動(dòng)搗碎機(jī)或勻漿器破碎或用超聲波處理破碎。植物組織和細(xì)胞，由于具有由纖維素、半纖維素和果膠等物質(zhì)組成的細(xì)胞壁，一般需要用與石英砂或玻璃粉和適當(dāng)?shù)奶崛∫阂黄鹧心サ姆椒ㄆ扑?，液氮破碎或用纖維素酶處理也能達(dá)到目的。細(xì)菌細(xì)胞的破碎的常用方法有超聲波震蕩，與砂研磨、高

7、壓擠壓或溶菌酶處理(以分解肽聚糖)等。19如果所要的蛋白質(zhì)主要集中在某一細(xì)胞組分，如細(xì)胞核、染色體、核糖體或可溶性的細(xì)胞質(zhì)等，則可利用差速離心方法將它們分開(kāi) 如果碰上所要蛋白質(zhì)是與細(xì)胞膜或膜質(zhì)細(xì)胞器結(jié)合的，則必須利用超聲波或去污劑使膜結(jié)構(gòu)解聚，然后用適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)提取。20細(xì)胞破碎方法總結(jié)21iii）蛋白質(zhì)（包括酶）的溶解(提取)大部分蛋白質(zhì)都可溶于水、稀鹽、稀酸或堿溶液，少數(shù)與脂類(lèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)則溶于乙醇、丙酮、丁醇等有機(jī)溶劑中，因此，可采用不同溶劑提取分離和純化蛋白質(zhì)及酶。水溶液提取法有機(jī)溶劑提取法22水溶液提取法稀鹽緩沖系統(tǒng)水溶液對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好、溶解度大、是提取蛋白質(zhì)最常用的溶劑，通常用量是

8、原材料體積的1-5倍，提取時(shí)需要均勻的攪拌，以利于蛋白質(zhì)的溶解。提取的溫度要視有效成份性質(zhì)而定。為了避免蛋白質(zhì)提純過(guò)程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制劑（如二異丙基氟磷酸，碘乙酸等）。下面著重討論提取液的pH值和鹽濃度的選擇。231、pH值蛋白質(zhì)，酶是具有等電點(diǎn)的兩性電解質(zhì)，提取液的pH值應(yīng)選擇在偏離等電點(diǎn)兩側(cè)的pH 范圍內(nèi)。用稀酸或稀堿提取時(shí)，應(yīng)防止過(guò)酸或過(guò)堿而引起蛋白質(zhì)可解離基團(tuán)發(fā)生變化，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象的不可逆變化。一般來(lái)說(shuō)，堿性蛋白質(zhì)用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白質(zhì)用偏堿性的提取液。242、鹽濃度稀濃度可促進(jìn)蛋白質(zhì)的溶解，稱為鹽溶作用。同時(shí)稀鹽溶液因鹽離子與蛋白質(zhì)部分結(jié)合，具有保護(hù)蛋

9、白質(zhì)不易變性的優(yōu)點(diǎn)，因此在提取液中加入少量NaCl等中性鹽，一般以0.15摩爾/升濃度為宜。緩沖液常采用磷酸鹽、Tris-HCl和碳酸鹽等緩沖液。25(2) 粗分級(jí)分離 (rough fractionation) 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)提取液(有時(shí)還雜有核酸、多糖之類(lèi))獲得后，選用一套適當(dāng)?shù)姆椒?，將所要的蛋白質(zhì)與其他雜蛋白分離開(kāi)來(lái)。一般這一步的分級(jí)分離用鹽析、等電點(diǎn)沉淀和有機(jī)溶劑分級(jí)分離等方法。這些方法的特點(diǎn)是簡(jiǎn)便、處理量大，既能除去大量雜質(zhì)(包括脫鹽)，又能濃縮蛋白質(zhì)溶液。有些蛋白質(zhì)提取液體積較大，又不適于用沉淀或鹽析法濃縮，則可采用超過(guò)濾、凝膠過(guò)濾、冷凍真空干燥或其他方法(如聚乙二醇濃縮法)進(jìn)行濃縮。2

10、6蛋白質(zhì)的鹽析中性鹽對(duì)蛋白質(zhì)的溶解度有顯著影響，一般在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高，蛋白質(zhì)的溶解度增加，此稱鹽溶；當(dāng)鹽濃度繼續(xù)升高時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度不同程度下降并先后析出，這種現(xiàn)象稱鹽析。由于各種蛋白質(zhì)分子顆粒大小、親水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不一樣，調(diào)節(jié)混合蛋白質(zhì)溶液中的中性鹽濃度可使各種蛋白質(zhì)分段沉淀。27影響鹽析的因素1）溫度：除對(duì)溫度敏感的蛋白質(zhì)在低溫（4度）操作外，一般可在室溫中進(jìn)行。2）pH值：大多數(shù)蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)在濃鹽溶液中的溶解度最低。3）蛋白質(zhì)濃度：蛋白質(zhì)濃度高時(shí)，欲分離的蛋白質(zhì)常常夾雜著其他蛋白質(zhì)一起沉淀出來(lái)，即共沉淀現(xiàn)象。因此在鹽析前蛋白質(zhì)樣品要加適量緩沖液稀釋，使蛋

11、白質(zhì)含量在適當(dāng)?shù)姆秶?，?.5-3.0%。28蛋白質(zhì)鹽析常用的中性鹽，主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。 硫酸銨沉淀的優(yōu)點(diǎn)：溫度系數(shù)小而溶解度大（25度時(shí)飽和溶液為4.1M，即767克/升；0度時(shí)飽和溶解度為3.9M，即676克/升），在這一溶解度范圍內(nèi)，許多蛋白質(zhì)和酶都可以鹽析出來(lái)；不易引起蛋白質(zhì)變性；蛋白質(zhì)溶液或沉淀穩(wěn)定。除鹽的方法：常用的是透析，此外也可用葡萄糖凝膠G-25或G-50過(guò)柱的辦法除鹽，所用的時(shí)間就比較短。29等電點(diǎn)沉淀法蛋白質(zhì)在靜電狀態(tài)時(shí)顆粒之間的靜電斥力最小，因而溶解度也最小。各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)有差別，可利用調(diào)節(jié)溶液的pH達(dá)到某一蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)使之沉淀，但此

12、法很少單獨(dú)使用，可與鹽析法結(jié)合用。30低溫有機(jī)溶劑沉淀法定義： 用與水可混溶的有機(jī)溶劑，甲醇，乙醇或丙酮，可使多數(shù)蛋白質(zhì)溶解度降低并析出，此法分辨力比鹽析高，但易導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，應(yīng)在低溫下進(jìn)行。31低溫有機(jī)溶劑沉淀法的機(jī)理有機(jī)溶劑引起蛋白質(zhì)沉淀的主要原因之一是改變了介質(zhì)的介電常數(shù)。水是高介電常數(shù)物質(zhì)(20時(shí)，80)，有機(jī)溶劑是低介電常數(shù)物質(zhì)(20時(shí)，甲醇33，乙醇24，丙酮21.4)；因此有機(jī)溶劑的加入使水溶液的介電常數(shù)降低，蛋白質(zhì)分子表面可解離基團(tuán)的離子化程度減弱，水化程度降低，促進(jìn)了蛋白質(zhì)分子的聚集和沉淀。有機(jī)溶劑引起蛋白質(zhì)沉淀的另一重要方式可能與鹽析相似，與蛋白質(zhì)直接爭(zhēng)奪水化水，致使蛋白

13、質(zhì)聚集而沉淀。 32(3) 細(xì)分級(jí)分離 (fine fractionation) 進(jìn)一步純化，一般使用層析法包括凝膠過(guò)濾，離子交換層析，吸附層析以及親和層析等。必要時(shí)還可選擇電泳法，包括區(qū)帶電泳、等電聚焦等作為最后的純化步驟。 用于細(xì)分級(jí)分離的方法一般規(guī)模較小，但分辨率很高。 33蛋白質(zhì)的分離純化方法 一、根據(jù)分子大小不同的純化方法二、利用溶解度差別的純化方法三、根據(jù)電荷不同的純化方法四、根據(jù)配體特異性的分離方法34一、根據(jù)分子大小不同的純化方法 1透析和超過(guò)濾2密度梯度(區(qū)帶)離心3凝膠過(guò)濾層析 (分子排阻 )351透析和超過(guò)濾透析(dialysis)是利用蛋白質(zhì)分子不能通過(guò)半透膜的性質(zhì)，使

14、蛋白質(zhì)和其他小分子物質(zhì)如無(wú)機(jī)鹽、單糖等分開(kāi)。常用的半透膜是玻璃紙和其他改型的纖維素材料。透析也可用于蛋白質(zhì)鹽析后中脫鹽。36超濾是利用壓力或離心力，強(qiáng)行使水和其他小分子溶質(zhì)通過(guò)半透膜，而蛋白質(zhì)被截留在膜上，以達(dá)到濃縮和脫鹽的目的。372密度梯度(區(qū)帶)離心 蛋白質(zhì)顆粒在具有密度梯度的介質(zhì)中離心時(shí)，質(zhì)量和密度大的顆粒比質(zhì)量和密度小的顆粒沉降得快；每種蛋白質(zhì)顆粒沉降到與自身密度相等的介質(zhì)密度梯度時(shí)，即停止不前，最后各種蛋白質(zhì)在離心管中被分離成獨(dú)立的區(qū)帶。 38密度梯度常用的密度梯度有蔗糖梯度，聚蔗糖梯度。蔗糖便宜，純度高，濃溶液(60，WW)密度可達(dá)1.28 gcm3。聚蔗糖是由蔗糖和1氯2，3環(huán)

15、氧丙烷合成的高聚物，Mr約400 000。密度梯度在離心管內(nèi)的分布是管底的密度最大，向上逐漸減小393、凝膠過(guò)濾層析原理：凝膠過(guò)濾層析是根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同而達(dá)到分離效果的；凝膠過(guò)濾填料中含有大量微孔，只允許緩沖液及小分子量的蛋白質(zhì)通過(guò)，而大分子蛋白質(zhì)及一些蛋白質(zhì)復(fù)合物則被阻擋在外；高分子量的蛋白質(zhì)在填料顆粒間流動(dòng)，更早被洗脫出來(lái)。動(dòng)畫(huà)演示 40經(jīng)常使用的凝膠種類(lèi)：1）葡聚糖凝膠，是由線形的1，6葡聚糖與1氯2，3葡聚糖環(huán)氧丙烷反應(yīng)而成的化合物，它的商品名稱為Sephadex。2）聚丙烯酰胺凝膠 (商品名稱為Bio-gel P)是一種人工合成的凝膠，它是由單體丙烯酰胺(acrylamide)

16、和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺(N，N，methylenebisacrylamide)共聚而成的。3）瓊脂糖凝膠，商品名稱為Sepharose或Bio-Gel A，瓊脂糖是從瓊脂中分離制得的，這種凝膠的優(yōu)點(diǎn)是孔徑大，排阻極限高。 41凝膠過(guò)濾層析應(yīng)用： 1、分子量測(cè)定 2、去除低分子量的雜質(zhì) 3、分離目的蛋白 4、更換蛋白質(zhì)的緩沖液42二、利用溶解度差別的純化方法 影響蛋白質(zhì)溶解度的外部因素很多，其中主要有：溶液的pH，離子強(qiáng)度，介電常數(shù)，溫度。自身因素：在同一的外部條件下，不同蛋白質(zhì)具有不同的溶解度，這是因?yàn)槿芙舛葰w根結(jié)底取決于它們本身的分子結(jié)構(gòu)，如分子所帶電荷的性質(zhì)和數(shù)量、親水基團(tuán)與疏水基團(tuán)的比例

17、，它們?cè)诘鞍踪|(zhì)分子表面的排列以及由此而產(chǎn)生的偶極矩等。 431. pH控制蛋白質(zhì)的沉淀2. 鹽溶和鹽析3有機(jī)溶劑分級(jí)分離法二、利用溶解度差別的純化方法 44三、根據(jù)電荷不同的純化方法 根據(jù)蛋白質(zhì)的電荷不同即酸堿性質(zhì)不同分離蛋白質(zhì)混合物的方法有電泳和離子交換層析兩類(lèi)。 1. 電泳(electrophoresis)在外電場(chǎng)的作用下，帶電顆粒，向著與其電性相反的電極移動(dòng)，這種現(xiàn)象稱為電泳。 蛋白質(zhì)電泳分離原理：分子大小不同的蛋白質(zhì)所帶電種類(lèi)不同，凈電荷密度不同，遷移率不同，因此，在電泳時(shí)可以分開(kāi)。45電泳的類(lèi)型 目前電泳的類(lèi)型很多， 最常見(jiàn)的是區(qū)帶電泳，由于在支持物上電泳時(shí)蛋白質(zhì)混合物被分離成若干區(qū)

18、帶而得名。46區(qū)帶電泳按其支持物的物理性狀不同可以分成4類(lèi)： 濾紙電泳和薄膜電泳(如醋酸纖維薄膜電泳和聚酰胺薄膜電泳)； 粉末電泳，支持介質(zhì)是淀粉、纖維素粉或硅膠粉等，粉末與適當(dāng)?shù)娜軇┱{(diào)和，鋪設(shè)成平板；47 細(xì)絲電泳，如尼龍絲和其他人造絲電泳，這是一類(lèi)微量電泳； 凝膠電泳，最常用的支持介質(zhì)有聚丙烯酰胺和瓊脂糖凝膠，前者適于分離蛋白質(zhì)和多核苷酸，后者適于分離核酸，這兩種凝膠電泳的分辨率都很高。-+ 4849常見(jiàn)的電泳方法介紹SDS電泳PAGE電泳等電聚焦凝膠電泳雙向電泳毛細(xì)管電泳50十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）原理:聚丙烯酰胺凝膠 ( polyacrylamide gel elec

19、trophoresis, PAGE) =丙烯酰胺+N,N-甲叉雙丙烯酰胺十二烷基硫酸鈉（簡(jiǎn)稱SDS）是陰離子表面活性劑，蛋白質(zhì)或多肽與SDS結(jié)合，經(jīng)熱變性和二硫鍵的還原，形成所帶負(fù)電荷相對(duì)一致的非折疊衍生物，其泳動(dòng)速度主要由分子量決定。SDSPAGE51凝膠的制備 凝膠由分離膠和濃縮膠組成：上層為濃縮膠，凝膠孔徑較大，沒(méi)有分子篩效應(yīng)，其pH為6.8，由于快慢離子所形成的高電壓梯度，使得變性蛋白質(zhì)分子在泳動(dòng)中被壓縮為很薄的一層，大大提高了分辨率。下層為分離膠，凝膠孔徑較小，有分子篩效應(yīng)，pH為8.8，變性蛋白質(zhì)分子所帶負(fù)電荷基本一致，泳動(dòng)速度主要決定于分子量。52SDSPAGE膠的制備53圖 蛋

20、白質(zhì)微型電泳系統(tǒng)蛋白質(zhì)微型電泳系統(tǒng)54簡(jiǎn)單操作步驟制備堆積膠和分離膠電泳染色(考馬斯亮蘭和銀染)5556樣品制備： 蛋白質(zhì)樣品需變性并結(jié)合SDS，形成所帶負(fù)電荷相對(duì)一致的非折疊衍生物。57應(yīng)用范圍 蛋白質(zhì)純度分析 蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定 蛋白質(zhì)修飾的鑒定 免疫印跡染色靈敏 考馬斯亮蘭：0.11ug 銀染色法：210ng58如何進(jìn)行蛋白質(zhì)分子的分子量測(cè)定？原理：由于蛋白質(zhì)分子的遷移率與分子量成正比。方法：根據(jù)蛋白質(zhì)的遷移率，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知蛋白就可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線中找出。 所謂遷移距離是指分離膠的起始位置到蛋白質(zhì)條帶的前沿。簡(jiǎn)便方法：根據(jù)蛋白質(zhì)Marker直接讀出大致的分子量59如何對(duì)

21、蛋白質(zhì)分子進(jìn)行定量？通過(guò)染色后凝膠的蛋白質(zhì)條帶在分光光度計(jì)上進(jìn)行掃描，然后對(duì)峰面積積分，可得到一種不是很準(zhǔn)確的定量方法 主要因?yàn)槿旧珓?duì)蛋白質(zhì)的染色效果不一致，而且必須在一定的范圍內(nèi) 60PAGE(非變性凝膠電泳)原理：分離主要受蛋白質(zhì)所帶電荷及其分子大小。按丙稀酰胺凝膠孔徑大小去篩分不同尺寸的蛋白質(zhì)，同時(shí)在分離膠中酸性條件下，高電荷的蛋白質(zhì)泳動(dòng)更快。注意：通常在4 條件下電泳方法步驟大致同SDS電泳可用于電泳后蛋白質(zhì)的酶活測(cè)定61蛋白質(zhì)等電聚焦電泳的基本原理 等電聚焦電泳技術(shù)就是在電泳支持介質(zhì)中加入載體兩性電解質(zhì)，通以直流電后在正負(fù)極之間形成穩(wěn)定、連續(xù)和線性的pH梯度，蛋白質(zhì)在pH梯度凝膠中

22、受電場(chǎng)力作用而泳動(dòng)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子一旦到達(dá)它的等電點(diǎn)位置，分子所帶凈電荷為0，就不能再遷移。因此蛋白質(zhì)在與其本身pI相等的pH位置被聚焦成窄而穩(wěn)定的區(qū)帶。這種效應(yīng)稱之為“聚焦效應(yīng)”，保證了蛋白質(zhì)分離的高分辨率 ，是等電聚焦最為突出的優(yōu)點(diǎn)。62Isoelectri focusing gel electrophoresis,IEF(等電聚焦凝膠電泳)632等電聚焦中pH梯度的形成： pH梯度的形成依靠有緩沖作用的兩性載體電解質(zhì) 載體電解質(zhì)是一系列多氨基多羧基的混合物，其pI分布在2.5到10之間，載體兩性電解質(zhì)溶液的pH大約是該溶液pH范圍的平均值。在沒(méi)有電流時(shí)，所有載體兩性分子都帶電荷，所帶總的凈

23、電荷為0。 第一步：未通電時(shí)，帶電分子無(wú)序排列64第二步：通電后最先在正極和負(fù)極形成pH梯度第三步：穩(wěn)定的pH梯度形成65根據(jù)兩性電解質(zhì)的性質(zhì)，在泳動(dòng)過(guò)程中不斷地與溶液交換質(zhì)子，當(dāng)達(dá)到平衡時(shí)，即兩性電解質(zhì)得失質(zhì)子相等，不再出現(xiàn)質(zhì)子交換，載體兩性電解質(zhì)至達(dá)等電點(diǎn)并停留在自己的pI區(qū)域 ，pI即是此處的pH值，于是載體電解質(zhì)分離為連續(xù)pH不同的條帶，從而形成連續(xù)的多個(gè)pH緩沖區(qū)。由于凝膠的防對(duì)流作用，可使pH梯度保持穩(wěn)定不變。66 3蛋白質(zhì)分子分離了如果把蛋白質(zhì)溶液與載體兩性電解質(zhì)混合；隨著pH梯度的形成，蛋白質(zhì)也將在自己的pI處沉淀下來(lái)。67等電點(diǎn)聚焦的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)：1.分辨率高2.很稀的樣

24、品都可分離，且重現(xiàn)性好3.可用于測(cè)定蛋白質(zhì)或多肽的等電點(diǎn)缺點(diǎn)：1.要求使用無(wú)鹽溶液，而某些蛋白質(zhì)在無(wú)鹽溶液中溶解度低，可能產(chǎn)生沉淀；2.樣品中各組分都聚焦到其等電點(diǎn)，對(duì)一些在等電點(diǎn)不溶解或發(fā)生變性的蛋白質(zhì)不適用。68 目前雙向電泳大都指第一向?yàn)榈入娋劢?載體兩性電解質(zhì)pH梯度或固相pH梯度)，第二向?yàn)樘荻鹊腟DS電泳雙向電泳(two-dimensionalelectrophoresis)69凝膠的圖像處理分析典型流程凝膠圖像的掃描：圖像加工：斑點(diǎn)檢測(cè)和定量：凝膠配比：數(shù)據(jù)分析：數(shù)據(jù)呈遞和解釋：2-DE數(shù)據(jù)庫(kù)的建立：70毛細(xì)管電泳 (capillary electrophoresis) 毛細(xì)管電

25、泳高效分離、快速分析和微量進(jìn)樣的優(yōu)勢(shì)，使其在化學(xué)、生命科學(xué)、藥物學(xué)、法醫(yī)學(xué)、環(huán)境科學(xué)、農(nóng)學(xué)及食品科學(xué)等領(lǐng)域有著十分廣泛的應(yīng)用，適合于從無(wú)機(jī)離子到生物大分子，從荷電粒子到中性分子的分離分析。HPCE最大的優(yōu)點(diǎn)之一就是應(yīng)用范圍廣泛，可用于分析氨基酸、手性藥物、維生素、殺蟲(chóng)劑、無(wú)機(jī)離子、有機(jī)酸、染料、表面活性劑、肽和蛋白質(zhì)、糖類(lèi)、低聚核苷酸和DNA限制性內(nèi)切片段，甚至整個(gè)細(xì)胞和病毒顆粒。 71毛細(xì)管電泳（CE）定義毛細(xì)管電泳（CE）又稱高效毛細(xì)管電泳（HPCE）或毛細(xì)管分離法（CESM），是一類(lèi)以毛細(xì)管為分離通道、以高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力的新型液相分離分析技術(shù)。它迅速發(fā)展于80年代后期，毛細(xì)管電泳技術(shù)

26、實(shí)際上包含電泳技術(shù)和色譜技術(shù)及其交叉內(nèi)容，是分析科學(xué)中繼高效液相色譜之后的又一重大進(jìn)展，它使分析科學(xué)得以從微升水平進(jìn)入納升水平。毛細(xì)管電泳是以彈性石英毛細(xì)管為分離通道，以高壓電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，依據(jù)樣品中各組分之間帶電性和分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)的電泳分離分析方法 72毛細(xì)管電泳的原理電泳遷移引起溶液中荷電分子向相反電荷的電極移動(dòng)。正、負(fù)樣品分子以不同的速度移動(dòng)。然而由于電滲作用，其電滲速度一般比樣品的電泳速度大，使它們都向負(fù)極移動(dòng)。對(duì)荷正電的分子來(lái)說(shuō)，電泳遷移和電滲流效果是一致的，因而移動(dòng)最快，最先達(dá)到負(fù)極。隨著被分離的分子接近負(fù)極，它們都將通過(guò)紫外檢測(cè)器并把信號(hào)傳遞給記錄儀。所得結(jié)果是被分離組分的

27、紫外吸收對(duì)時(shí)間的峰譜。 73典型毛細(xì)管電泳實(shí)驗(yàn)的步驟：1）將運(yùn)行緩沖液充滿毛細(xì)管柱；2）移去進(jìn)樣端緩沖液池，用樣品代替；3）用電動(dòng)或壓力進(jìn)樣方式進(jìn)樣；4）將進(jìn)樣端緩沖液放回；5）毛細(xì)管兩端加操作電壓進(jìn)行電泳分離；6）分離樣品遷移至檢測(cè)窗口檢測(cè)，數(shù)據(jù)記錄和處理。 742、離子交換層析法原理：等電點(diǎn)。同等電聚焦電泳一樣，離子交換層析利用不同蛋白質(zhì)表面電荷性質(zhì)的不同達(dá)到分離、純化蛋白質(zhì)的目的。離子交換劑有陽(yáng)離子交換劑（如：羧甲基纖維素；CM-纖維素）和陰離子交換劑（二乙氨基乙基纖維素；DEAE纖維素）在pH值中性的溶液中，暴露的精氨酸、組氨酸、賴氨酸殘基帶正電荷，天冬氨酸和谷氨酸殘基帶負(fù)電荷最佳溶液

28、pH值一般與蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)相差一個(gè)單位。此時(shí)蛋白質(zhì)帶有的電荷既利于蛋白質(zhì)與離子交換柱結(jié)合，又利于洗脫，不至于用離子強(qiáng)度太大的洗脫液洗脫。75離子交換層析當(dāng)被分離的蛋白質(zhì)溶液流經(jīng)離子交換層析柱時(shí)，帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質(zhì)被吸附在離子交換劑上，隨后用改變pH或離子強(qiáng)度辦法將吸附的蛋白質(zhì)洗脫下來(lái)。動(dòng)畫(huà)演示 76四、根據(jù)配體特異性的分離方法親和層析法（aflinity chromatography）是分離蛋白質(zhì)的一種極為有效的方法，它經(jīng)常只需經(jīng)過(guò)一步處理即可使某種待提純的蛋白質(zhì)從很復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物中分離出來(lái)，而且純度很高。這種方法是根據(jù)某些蛋白質(zhì)與另一種稱為配體的分子能特異而非共價(jià)地結(jié)合。蛋

29、白質(zhì)在組織或細(xì)胞中是以復(fù)雜的混合物形式存在，每種類(lèi)型的細(xì)胞都含有上千種不同的蛋白質(zhì)，因此蛋白質(zhì)的分離，提純和鑒定是生物化學(xué)中的重要的一部分，至今還沒(méi)的單獨(dú)或一套現(xiàn)成的方法能夠把任何一種蛋白質(zhì)從復(fù)雜的混合蛋白質(zhì)中提取出來(lái)，因此往往采取幾種方法聯(lián)合使用。77親和層析原理：利用蛋白質(zhì)與結(jié)合在介質(zhì)上的配基間的特異親和力，純化蛋白質(zhì)。特點(diǎn)：選擇性強(qiáng)，純化效率高。配基種類(lèi)，如：肽、抗體、底物、核酸、凝集素、燃料等。動(dòng)畫(huà)演示78蛋白質(zhì)的膠內(nèi)酶切 包括感興趣蛋白點(diǎn)的挖取、含蛋白質(zhì)凝膠的脫色、膠內(nèi)蛋白質(zhì)的酶切等過(guò)程79濃縮、干燥及保存80一、樣品的濃縮生物大分子在制備過(guò)程中由于過(guò)柱純化而樣品變得很稀，為了保存和

30、鑒定的目的，往往需要進(jìn)行濃縮。常用的濃縮方法的：1、減壓加溫蒸發(fā)濃縮2、空氣流動(dòng)蒸發(fā)濃縮3、冰凍法4、吸收法5、超濾法6、纖維過(guò)濾透析法811、減壓加溫蒸發(fā)濃縮通過(guò)降低液面壓力使液體沸點(diǎn)降低，減壓的真空度愈高，液體沸點(diǎn)降得愈低，蒸發(fā)愈快，此法適用于一些不耐熱的生物大分子的濃縮。822、空氣流動(dòng)蒸發(fā)濃縮空氣的流動(dòng)可使液體加速蒸發(fā),鋪成薄層的溶液，表面不斷通過(guò)空氣流；或?qū)⑸锎蠓肿尤芤貉b入透析袋內(nèi)置于冷室，用電扇對(duì)準(zhǔn)吹風(fēng)，使透過(guò)膜外的溶劑不斷蒸發(fā)，而達(dá)到濃縮目的，此法濃縮速度慢，不適于大量溶液的濃縮。833、冰凍法生物大分子在低溫結(jié)成冰，鹽類(lèi)及生物大分子不進(jìn)入冰內(nèi)而留在液相中。操作時(shí)先將待濃縮的溶

31、液冷卻使之變成固體，然后緩慢地融解，利用溶劑與溶質(zhì)融點(diǎn)介點(diǎn)的差別而達(dá)到除去大部分溶劑的目的。如蛋白質(zhì)和酶的鹽溶液用此法濃縮時(shí)，不含蛋白質(zhì)和酶的純冰結(jié)晶浮于液面，蛋白質(zhì)和酶則集中于下層溶液中，移去上層冰塊，可得蛋白質(zhì)和酶的濃縮液。844、吸收法通過(guò)吸收劑直接收除去溶液中溶液分子使之濃縮。所用的吸收劑必需與溶液不起化學(xué)反應(yīng)，對(duì)生物大分子不吸附，易與溶液分開(kāi)。常用的吸收劑有聚乙二醇，聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝膠等，使用聚乙二醇吸收劑時(shí)，先將生物大分子溶液裝入半透膜的袋里，外加聚乙二醇復(fù)蓋置于4度下，袋內(nèi)溶劑滲出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被水飽和后要更換新的直至達(dá)到所需要的體積。855、超濾法超濾法是使用一種特別的薄膜對(duì)溶液中各種溶質(zhì)分子進(jìn)行選擇性過(guò)濾的方法，液體在一定壓力下（氮?dú)鈮夯蛘婵毡脡海┩ㄟ^(guò)膜時(shí)，溶劑和小分子透過(guò)，大分子受阻保留。該法是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的新方法，最適于生物大分子尤其是蛋白質(zhì)和酶的濃縮或脫鹽，并具有成本低，操作方便，條件溫和，能較好地保持生物大分子的活性，回收率高等優(yōu)點(diǎn)。應(yīng)用超濾法關(guān)鍵在于膜的選擇，不同類(lèi)型和