生物樣品前處置市公開課金獎(jiǎng)市賽課一等獎(jiǎng)?wù)n件

1、生物樣品前處理制作人：葉超第1頁(yè)研究背景 1 234生物樣品種類目錄生物樣品儲(chǔ)存生物樣品預(yù)處理克服基質(zhì)效應(yīng)方法第2頁(yè)第3頁(yè)DistributionMetabolismAbsorptionExcretion生物樣品中藥品分析測(cè)定是定量描述藥品體內(nèi)過程、取得藥代參數(shù)主要伎倆之一第4頁(yè)藥品濃度低（血液中藥品濃度、普通處于ng-pg級(jí)水平）干擾組分多（血液成份及其復(fù)雜，包含基質(zhì)，內(nèi)源性物質(zhì)及其代謝產(chǎn)物，含有數(shù)百乃至幾千種化合物）藥品在體內(nèi)除原型還有代謝產(chǎn)物以及和內(nèi)源性物質(zhì)結(jié)合各種形式存在體內(nèi)生物樣品分析特點(diǎn)體內(nèi)生物樣品分析特點(diǎn)第5頁(yè)生物樣品種類生物樣品種類選取標(biāo)準(zhǔn)能夠反應(yīng)出藥品濃度與藥品效應(yīng)之間關(guān)系易

2、于獲取便于處理、適合分析依據(jù)不一樣目標(biāo)要求進(jìn)行選取均勻生物樣品生物樣品種類血液（全血、血漿、血清）尿液、唾液、膽汁、乳汁、腦脊液、淋巴液、汗液等非均勻生物樣品心、肝、腎、脾、肺、腦、胃、腸、子宮、肌肉、皮膚等組織、器官第6頁(yè)全血全血全血包含液體成份血漿和分散懸浮于其中血細(xì)胞全血不易保留，且血細(xì)胞中含有很多干擾物質(zhì)，影響測(cè)定，故較少用全血測(cè)定藥品濃度。僅用于血漿藥品濃度太低或者血漿藥品濃度波動(dòng)較大，且難以控制藥品，如環(huán)抱霉素A。第7頁(yè)血漿血漿將采取血液置含有抗凝劑（如肝素、EDTA)試管中，混合后，3000-4000r/min離心，分離紅細(xì)胞，上清液即為血漿。測(cè)定血中藥品濃度通常是指測(cè)定血漿或血

3、清中藥品濃度，而不是指含有血細(xì)胞全血中 藥品濃度。第8頁(yè)血清血清血清是采血后不加任何抗凝劑，于室溫下靜置15-30min，待其自然凝結(jié)后，離心，分離出上清液。血清較血漿顏色更淺，較血漿少了大部分纖維蛋白，更易進(jìn)行處理，且血漿及血清中藥品濃度測(cè)定值通常是相同。第9頁(yè)選擇血漿or 血清選擇血漿理由：1)普通血漿中藥品濃度高于血清中藥品濃度2)血清形成過程中，血塊凝固時(shí)，往往易造成吸附損失3)血清需要采血放置一段時(shí)間才可制得，對(duì)不穩(wěn)定化合物影響較大4)血漿則可經(jīng)采血后立刻離心，分離血漿低溫保留選擇血清理由：1)血漿中蛋白稍微多，可能會(huì)在SPE中產(chǎn)生堵塞柱子情況2)血漿中含有抗凝物質(zhì)（肝素或EDTA)

4、可能會(huì)干擾化合物檢測(cè)第10頁(yè)生物樣品儲(chǔ)存一、冷藏或冷凍采樣后除了馬上分析外，為預(yù)防藥品發(fā)生改變，應(yīng)：短期保留，可4冷藏長(zhǎng)久保留，可-20冷凍，不要重復(fù)凍融（大部分藥品）-80，阿莫西林等抗生素二、有時(shí)，還應(yīng)考慮加入穩(wěn)定劑酶抑制劑：一些酯類藥品，如普魯卡因、阿糖胞苷，易受血漿酯酶作用而發(fā)生水解，而應(yīng)在采樣后馬上加入酶抑制劑如氟化鈉?？寡趸瘎阂恍┮籽趸镔|(zhì)，可加入VC或其它氧化劑。如血漿中兒茶酚類藥品常規(guī)保留僅4周，若加入適量VC，則能保留10周。第11頁(yè)鹽酸班布特羅（前藥）體內(nèi)膽堿酯酶作用下遲緩代謝阻斷水解毒扁豆堿(膽堿酯酶抑制劑）特布他林（代謝產(chǎn)物）生物樣品儲(chǔ)存和預(yù)處理(添加酶抑制劑)第12

5、頁(yè)生物樣品儲(chǔ)存和預(yù)處理(避光）第13頁(yè)生物樣品儲(chǔ)存和預(yù)處理(PH值和溫度）第14頁(yè)生物樣品預(yù)處理目123將藥品從綴合物（尿）或結(jié)合物中釋放出來，以測(cè)定藥品濃度將微量藥品從復(fù)雜介質(zhì)中純化、富集起來預(yù)防分析儀器污染，提升測(cè)定靈敏度和選擇性第15頁(yè)生物樣品慣用處理方法一二三沉淀蛋白(PPT)液液萃取(LLE)固相萃取(SPE)主要考慮生物樣品種類、被測(cè)藥品性質(zhì)和測(cè)定方法三個(gè)方面問題：第16頁(yè)沉淀蛋白經(jīng)過沉淀蛋白質(zhì)能夠使結(jié)合藥品釋放出來，到達(dá)對(duì)待測(cè)組分提純和純化有機(jī)溶劑沉淀法加入中性鹽有機(jī)酸加入鋅鹽或銅鹽沉淀劑酶解法第17頁(yè)有機(jī)溶劑沉淀法原理加入水溶性有機(jī)溶劑，可使蛋白質(zhì)分子內(nèi)及分子間氫鍵發(fā)生改變慣用

6、有機(jī)溶劑種類乙腈、甲醇、丙酮、乙醇、四氫呋喃等操作實(shí)例50l 血漿+150l甲醇 渦旋1min 3500rpm離心10min 取上清液進(jìn)樣分析第18頁(yè)有機(jī)溶劑沉淀法實(shí)例奧氮平第19頁(yè)有機(jī)溶劑沉淀法血漿或血清與有機(jī)溶劑體積比為1:13，就能夠?qū)?0%以上蛋白質(zhì)除去，采取低溫低速3500r/min離心10min便可將析出蛋白質(zhì)完全沉淀。經(jīng)驗(yàn)總結(jié)優(yōu)點(diǎn)操作簡(jiǎn)單，快速，精密度好，為方法開發(fā)中優(yōu)先考慮使用，尤其在LC-MS方法中幾乎使用于全部小分子化合物，不論其極性大小化合物回收率靠近100%，幾乎全部小分子化合物都被提取，尤其適合用于代謝產(chǎn)物判定缺點(diǎn)只適合用于樣品中濃度較高藥品測(cè)定；樣品處理后依然存在很

7、多干擾物質(zhì)，對(duì)結(jié)果產(chǎn)生干擾；殘余雜質(zhì)會(huì)堵塞色譜柱，污染儀器第20頁(yè)加入強(qiáng)酸原理當(dāng)PH低于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)以陽(yáng)離子形式存在，加入強(qiáng)酸，可與蛋白質(zhì)陽(yáng)離子形成不溶性鹽沉淀。慣用有機(jī)溶劑種類10%三氯醋酸， 10%高氯酸等經(jīng)驗(yàn)總結(jié)血清與強(qiáng)酸百分比為1:0.6混合，高速離心，就可除去蛋白質(zhì)在酸性條件下分解藥品不宜本法除蛋白第21頁(yè)頭孢地尼內(nèi)標(biāo) 頭孢克洛加入強(qiáng)酸實(shí)例第22頁(yè)酶解法原理在測(cè)定酸不穩(wěn)定及蛋白結(jié)合牢靠藥品，需用酶解法，最慣用酶是蛋白水解酶枯草菌溶素，優(yōu)點(diǎn)可防止一些藥品在酸、及高溫條件下降解：對(duì)與蛋白質(zhì)結(jié)合牢靠藥品（保泰松、苯妥英鈉)，可顯著改進(jìn)回收率第23頁(yè)加入中性鹽原理加入中性鹽，使溶液

8、粒子強(qiáng)度發(fā)生改變。中性鹽能將與蛋白質(zhì)水合水置換出來，從而使蛋白質(zhì)脫水而沉淀。慣用中性鹽種類飽和硫酸銨、硫酸鈉、鎂鹽、磷酸鹽、枸櫞酸鹽操作實(shí)例血清和飽和硫酸銨百分比為1:2，混合，離心10000r/min 1-2min，即可除去90%以上蛋白質(zhì)第24頁(yè)生物樣品慣用處理方法一二三沉淀蛋白(PPT)液液萃取(LLE)固相萃取(SPE)主要考慮生物樣品種類、被測(cè)藥品性質(zhì)和測(cè)定方法三個(gè)方面問題：第25頁(yè)液-液提取方法（LLE）原理藥品在體內(nèi)吸收，需經(jīng)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，所以多數(shù)藥品含有一定脂溶性生物樣品中大多數(shù)內(nèi)源性雜質(zhì)是強(qiáng)極性水溶性物質(zhì)能夠依據(jù)藥品分子與基質(zhì)之間極性差異，使用適當(dāng)有機(jī)溶劑提取藥品，可一次性除去大

9、部分雜質(zhì)第26頁(yè)LLE方法需是考慮問題一、溶劑選擇標(biāo)準(zhǔn)相同相溶原理進(jìn)行選取沸點(diǎn)低、易于揮散和濃集無毒、不易乳化含有較高化學(xué)穩(wěn)定性和惰性和水不相溶慣用液-液萃取溶劑正己烷叔丁基甲醚乙醚乙酸乙酯正丁醇極性增加二、有機(jī)溶劑和水相體積比有機(jī)溶劑相和水相體積比1:1或2:1，由實(shí)際情況決定，文件中有10:1以上三、水相PH值對(duì)于堿性藥品，最正確PH要高于藥品PKa1-2單位，對(duì)于酸性藥品，最正確PH要低于PKa1-2單位，使藥品分子以非電離形式存在，從而更易溶于有機(jī)溶劑中第27頁(yè)操作實(shí)例LLE方法操作實(shí)例萃取劑第28頁(yè)LLE方法操作實(shí)例待測(cè)藥品：氯雷他定內(nèi)標(biāo)：地西泮第29頁(yè)LLE方法總結(jié)優(yōu)點(diǎn)選擇性高，可

10、除去大部分雜質(zhì)對(duì)有機(jī)溶劑蒸發(fā)后復(fù)溶，能夠?qū)悠愤M(jìn)行濃縮樣品較潔凈，對(duì)儀器污染小不一樣PH體系中與不一樣萃取劑組合，可控制回收率，并降低基質(zhì)效應(yīng)缺點(diǎn)操作繁瑣，不能自動(dòng)化易乳化普通提取回收率較低不適合用于極性大或者易揮發(fā)化合物提取因?yàn)樾枰獡]發(fā)有機(jī)溶劑，對(duì)于熱不穩(wěn)定化合物也不太適合，容器吸附化合物也有一定困難對(duì)于極性相差較大化合物同時(shí)提取困難第30頁(yè)生物樣品慣用處理方法一二三沉淀蛋白(PPT)液液萃取(LLE)固相萃取(SPE)主要考慮生物樣品種類、被測(cè)藥品性質(zhì)和測(cè)定方法三個(gè)方面問題：第31頁(yè)固相萃取技術(shù)(SPE)固相萃取(Solid Phase Extraction，簡(jiǎn)稱SPE)是從八十年代中期開

11、始發(fā)展起來一項(xiàng)樣品前處理技術(shù)。由液固萃取和液相色譜技術(shù)相結(jié)合發(fā)展而來。主要經(jīng)過固相填料對(duì)樣品組分選擇性吸咐及解吸過程，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品分離，純化和富集。主要目標(biāo)在于降低樣品基質(zhì)干擾，提升檢測(cè)靈敏度第32頁(yè)固相萃取技術(shù)基本原理和方法基本原理采取選擇性吸附、選擇性洗脫方式對(duì)樣品進(jìn)行富集、分離、純化，是一個(gè)包含液相和固相物理萃取過程；也能夠?qū)⑵浣频乜醋饕粋€(gè)簡(jiǎn)單色譜過程較慣用方法是使液體樣品經(jīng)過一吸附劑，保留其中被測(cè)物質(zhì)，再選取適當(dāng)強(qiáng)度溶劑沖去雜質(zhì)，然后用少許良溶劑洗脫被測(cè)物質(zhì)，從而到達(dá)快速分離凈化與濃縮目標(biāo)也可選擇性吸附干擾雜質(zhì)，而讓被測(cè)物質(zhì)流出基本方法第33頁(yè)固相萃取分離類型反相固相萃取硅膠上鍵合C1

12、8，C8，C2，苯基，腈基流動(dòng)相極性大于固定相，適合分離中小極性化合物萃取疏水性相互作用正相固相萃取無鍵合硅膠、或硅膠上鍵合氰基、NH2、二醇基流動(dòng)相極性小于固定相，適合于極性化合物萃取親水性相互作用離子交換萃取硅膠基質(zhì)離子交換官能團(tuán)，季胺，氨基、二氨基、苯磺酸基、羧基帶有電荷化合物靠靜電吸引到帶有電荷吸附劑表面吸附型萃取采取極性較強(qiáng)硅膠、硅藻土和氧化鋁等吸附劑第34頁(yè)固相萃取和HPLC相比特點(diǎn) SPE也是一個(gè)柱色譜分離過程，分離機(jī)理、固定相和溶劑選擇等方面與高效液相色譜（HPLC）有許多相同之處。 不過SPE柱填料粒徑（40m）要比HPLC填料（310m）大。因?yàn)槎讨埠痛罅?，SPE柱效比

13、HPLC色譜柱低得多。 所以，用SPE只能分開保留性質(zhì)有很大差異化合物。與HPLC另一個(gè)差異是SPE柱是一次性使用。 第35頁(yè)固相萃取操作普通有五步：活化甲醇/乙腈 潤(rùn)濕小柱，活化填料；平衡水或適當(dāng)緩沖液沖洗平衡小柱；上樣將樣品轉(zhuǎn)移上柱，抽去廢液；淋洗水或緩沖液最大程度洗去干擾物；洗脫用小體積溶劑將被測(cè)物質(zhì)洗脫下來并搜集。親脂型鍵合硅膠SPE柱試驗(yàn)步驟第36頁(yè)平衡上樣淋洗洗脫基質(zhì)雜質(zhì)目標(biāo)化合物第37頁(yè)常見固相萃取柱普通C18固相萃取固相萃取材料耐受PH范圍窄（2-7.5）硅膠鍵合吸附劑表面存在未鍵合硅羥基，對(duì)堿性化合物保留較強(qiáng)，用硅膠鍵合吸附劑處理堿性化合物，回收率通常較低對(duì)極性化合物保留差H

14、LB(Hydrophilic-lipophilic Balance Copolymer)PH1-14范圍內(nèi)穩(wěn)定無裸露硅醇羥基親水物質(zhì)和親脂物質(zhì)含有均衡保留能力，覆蓋了非極性、弱極性、極性化合物第38頁(yè)Oasis HLB柱（聚合物基質(zhì)）第39頁(yè)親水親脂柱優(yōu)點(diǎn)親水基團(tuán)（吡咯烷酮基團(tuán)）和疏水基團(tuán)（二乙烯基苯）,對(duì)極性化合物和非極性化合物都有很好保留，含有親水親脂平衡特征含有水可潤(rùn)濕性，填料經(jīng)活化后，即使柱床干涸，吸附劑對(duì)目標(biāo)物保留也不會(huì)發(fā)生改變有機(jī)聚合物而非硅膠，在pH 0-14 范圍內(nèi)表現(xiàn)穩(wěn)定有機(jī)聚合物基質(zhì)吸附劑，不存在次級(jí)相互作用，用于堿性化合物能夠得到滿意結(jié)果Oasis HLB柱（聚合物基質(zhì)）

15、第40頁(yè)Oasis HLB柱（聚合物基質(zhì)）第41頁(yè)離子交換與反相模式混合固相萃取強(qiáng)陽(yáng)離子和反相雙重保留基質(zhì)慣用于提取凈化生物基質(zhì)中弱堿性化合物酸性環(huán)境中含氮堿性基團(tuán)與磺酸基結(jié)合酸性藥品呈分子狀態(tài)發(fā)生反相結(jié)合作用反相作用離子交換第42頁(yè)離子交換與反相模式混合固相萃取第43頁(yè)固相萃取法方法總結(jié)SPE優(yōu)點(diǎn)：1、不發(fā)生乳化；2、適應(yīng)極性范圍較廣；3、提取效率高；4、方便快速；5、溶劑用量少；6、易于自動(dòng)化；7、室溫下操作，尤其適于處理?yè)]發(fā)性及對(duì)熱不穩(wěn)定藥品。 當(dāng)前，商品化固相提取小柱（cartridge）應(yīng)用已比較普遍。最大缺點(diǎn)： 貴 20多元/支第44頁(yè)三種方法比較：樣本較潔凈基質(zhì)效應(yīng)低操作快速適合

16、各種性質(zhì)化合物第45頁(yè)第46頁(yè)基質(zhì)效應(yīng)及其影響基質(zhì)效應(yīng)（martix effect）：定義：樣品測(cè)試過程中，因?yàn)榇郎y(cè)物以外其它物質(zhì)存在，直接或間接影響待測(cè)物對(duì)應(yīng)現(xiàn)象如測(cè)定血液中紅霉素濃度為例，除了紅霉素之外蛋白、磷脂、及其它內(nèi)源性物質(zhì)為基質(zhì)共流成份會(huì)改變待測(cè)化合物離子化效率，引發(fā)對(duì)待測(cè)化合物監(jiān)測(cè)信號(hào)抑制或提升第47頁(yè)基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)方法柱后灌注法提取后加入法（相對(duì)基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)）MF：基質(zhì)效應(yīng)因子MF=Set 2/Set 1IS-normalized MF :內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)效應(yīng)因子Set 2: 提取空白生物基質(zhì)，濃縮復(fù)溶形成溶液，將待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)加入此溶液中。Set 1: 將待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)溶于非生物基質(zhì)空白溶液， 如: 用甲醇、 乙腈等溶劑直接配制待測(cè)物或內(nèi)標(biāo)溶液第48頁(yè)基質(zhì)效應(yīng)消除（1）選擇適當(dāng)樣品預(yù)處理方法蛋白沉淀法 處理后樣品不是很潔凈、內(nèi)源性物質(zhì)較多，從而產(chǎn)生較強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)液液提取法和固相萃取法處理后樣品較潔凈，絕大多數(shù)內(nèi)源性物質(zhì)易被去除，但操作復(fù)雜，可能帶來提取回收率低其它問題第49頁(yè)基質(zhì)效應(yīng)消除（2）改變被測(cè)物色譜分離條件優(yōu)化色譜條件使得待測(cè)物與內(nèi)源性雜質(zhì)分離內(nèi)源性雜質(zhì)普通極性大，反相液相中保留時(shí)間短適當(dāng)