氨基酸的分離鑒定-紙層析法

1、氨基酸的分離鑒定紙層析法化學與生物工程學院生物工程系生物化學實驗報告課程名稱：生物化學實驗項目：氨基酸的分離鑒定紙層析法實驗室名：生物化學實驗室實驗時間：2012-11-15任課老師：楊艷專業(yè)班級：生物工程1142學生姓名：髙曄學 號：201121030219組別：第五組【實驗器材】器材層析缸、毛細管、小燒杯 、量筒、培養(yǎng)皿 、分液漏斗、層析濾紙 (新華一號 )、噴霧器（或白瓷盤），烘箱（或吹風機）、鉛筆、直尺試劑1)、擴展劑40mL將 20 mL 水飽和的正丁醇和 5 mL 醋酸以體積比4：1 在分液漏斗中進行混合。然后與15mL 蒸餾水混合，充分振蕩，靜置后分層，放出下層水層。取漏斗內的擴

2、展劑約 5mL 置于小燒杯中做平衡溶劑，其余的倒人培養(yǎng)皿中備用。2)、氨基酸溶液 05的賴氨酸、 脯氨酸、亮氨酸溶液及它們的混合液 (各組份濃度均為 05 )各配置 5mL 。3)、顯色劑 50100mL 01水合茚三酮正丁醇溶液?！緦嶒灢襟E】1）檢查培養(yǎng)皿是否干燥、 潔凈；若否，將其洗凈并置于干燥箱內 120烘干。2）平衡：剪一大塊塑料薄膜鋪在桌面上，將層析缸或大燒杯到置于塑料薄膜上，再把盛有約 5mL 展層溶液的小燒杯置于倒置的層析缸或大燒杯中，用塑料薄膜密封起來，平衡 20min 。3）規(guī)劃：帶上手套，取寬約 10cm、高約 15cm 的層析濾紙一張。在紙的下端距邊緣 23 cm處輕輕用

3、鉛筆劃一條平行于底邊的直線 A ，在直線上做 4 個記號，記號之間間隔 2cm，這就是原點的位置。另在距左邊緣 1cm 處畫一條平行于左邊緣的直線 B，在 B 線上以 A、B 兩線的交點為原點標明刻度（以厘米為單位） ，參見下圖。圖 2 實驗裝置示意圖4） 點樣：用毛細管分別取 10mL 左右的氨基酸樣品點在四個位置上。干后重復點樣，同一位置上需點 23 次， 23mL/ 次，保證每點在紙上擴散的直徑最大不超過 3mm 。其中 3 個是已知樣， 1 個是待測樣品。5） 層析：用針、線將濾紙縫成筒狀，紙的兩側邊緣不能接觸且要保持平行，參見圖 1-1。向培養(yǎng)皿中加入擴展劑，使其液面高度達到1cm

4、左右，將點好樣的濾紙筒直立于培養(yǎng)皿中（點樣的一端在下，擴展劑的液面在 A 線下約1cm），罩上大燒杯，仍用塑料薄膜密封。當擴展劑上升到 A 線時開始計時，每隔一定時間測定一下擴展劑上升的高度，填入表 1 中。當上升到 15 18cm，取出濾紙，剪斷連線，立即用鉛筆描出溶劑前沿線，自然風干或用電吹風熱風吹干。6） 顯色：用噴霧器在通風廚中向濾紙上均勻噴上 0.1% 茚三酮正丁醇溶液， 然后置烘箱中烘烤 5 分鐘 (100)或用熱風吹干即可顯出各層析斑點。7） 計算各種氨基酸的 Rf 值，并判斷混合樣品中都有哪些氨基酸，各人將自己的實驗結果貼在實驗報告上，見表2。8） 以層析時間為橫坐標，擴展劑上

5、升高度為縱坐標畫圖，求出擴展劑上升到 15cm 時所需要的時間?！緦嶒灲Y果與數(shù)據處理】X表 1擴展劑前沿上升速度0510 15 20 30 40 6090 （min）Y0.1.2.3.4.5.7.8.1（cm08515 75 859988. 5）表 2 各種氨基酸的 Rf 值賴氨 脯氨亮氨 待測酸酸酸氨基0.10.430.7酸原點到層析斑點中100.44心的距離0.80.880.80.88原點到溶劑前沿的88距離0.10.480.70.50Rf29判斷待測氨基酸賴氨酸、脯氨酸、亮氨酸【實驗結論】通過實驗可以知道每種氨基酸的在擴展劑中的移動速率是不相同的，利用每種氨基酸在紙上的位置不同可以計算出

6、氨基酸的Rf 值。和標準的 Rf 值對比，得出氨基酸種類。據此由上表 2 可知，混合氨基酸是由賴氨酸、脯氨酸、亮氨酸組成?！咀⒁馐马?】.點樣時要避免手指或唾液等污染濾紙有效面 (即展層時樣品可能達到的部分 )。.點樣斑點不能太大，防止層析后氨基酸斑點過度擴散和重疊，且點樣后吹風溫度不宜過高，以免樣品變性 (斑點發(fā)黃 )。.展層開始時切勿使樣品點浸入溶劑中。.展層劑要臨用前配制，以免發(fā)生酯化，影響層析結果。.如果樣品中溶質種類較多，且某些溶質在某一溶劑系統(tǒng)中的 Rf 值十分接近時， 單向層析分離效果不佳，則可采用雙向層析，即將樣品點在一方形濾紙的角上，先用一種溶劑系統(tǒng)展層。濾紙取出干燥后，再將濾紙轉 90 度角，用另一溶劑系統(tǒng)展層。所得圖譜分別與這兩種溶劑系統(tǒng)中作的標準物質層析圖譜