大腸細(xì)菌的基因芯片鑒定

1、大腸細(xì)菌的基因芯片鑒定第1頁，共37頁，2022年，5月20日，23點45分，星期二 基因芯片： 是指將特定的DNA或寡聚核苷酸片段通過物理化學(xué)方法固定于玻璃、尼龍甚至塑料片上,使多基因分析可同時進(jìn)行的一種裝置。 基因芯片上可固定不同物種特定基因的探針，將從樣品中提取并經(jīng)PCR擴(kuò)增和熒光標(biāo)記的特異基因片段與基因芯片上的探針雜交，利用專門的光學(xué)儀器，能夠檢測到這些雜交信號（帶有熒光標(biāo)記的雙鏈核酸），雜交信號出現(xiàn)在某物種的探針位點上，說明樣品來自于該物種。第2頁，共37頁，2022年，5月20日，23點45分，星期二基因芯片上固定探針的方法 通過化學(xué)修飾可以使玻片成為表面富含氨基的基片。在中性溶液

2、中，基片上的氨基所帶的正電荷與核酸分子上的磷酸所帶的負(fù)電荷相互作用，使核酸吸附在基片表面。加熱和紫外照射可以增強(qiáng)固定效果，但紫外交聯(lián)容易導(dǎo)致DNA斷裂或DNA分子間形成干擾雜交的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，所以一般還是采用加熱固定。 本實驗使用的基因芯片上固定有大腸桿菌HSP70基因和黃單胞菌HTPG基因的特異探針，可用于鑒定這兩種細(xì)菌。 第3頁，共37頁，2022年，5月20日，23點45分，星期二基因芯片制作和檢測的原理第4頁，共37頁，2022年，5月20日，23點45分，星期二實驗方案 本實驗共分為四個部分： 一、大腸桿菌培養(yǎng) 二、提取大腸桿菌基因組DNA 三、PCR擴(kuò)增其HSP70基因，電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)

3、物 四、擴(kuò)增產(chǎn)物與基因芯片雜交并檢測雜交信號第5頁，共37頁，2022年，5月20日，23點45分，星期二第一部分 細(xì)菌培養(yǎng) 配制100ml LB液體培養(yǎng)基，蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，氯化鈉1g，加重蒸水100ml，用NaOH調(diào)pH至7.0，高壓滅菌。 將大腸桿菌單菌落接種于LB培養(yǎng)基中，37恒溫?fù)u床上培養(yǎng)過夜，搖床轉(zhuǎn)速約為280r/min。第6頁，共37頁，2022年，5月20日，23點45分，星期二第二部分提取純化大腸桿菌基因組DNA第7頁，共37頁，2022年，5月20日，23點45分，星期二第二部分 實驗步驟1、取培養(yǎng)的菌液10ml，4000r/min離心10min，除去上清液。

4、2、加入1ml TE，使細(xì)菌沉淀充分懸浮。3、加入0.2ml 10% SDS 溶液，再加入10l 20 mg/ml 蛋白酶K， 37水浴中溫育1h。(SDS溶解細(xì)胞膜上的脂類與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜，并解離細(xì)胞中的核蛋白，SDS 還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與DNA結(jié)合的組蛋白。)4、取出離心管，加入0.2ml 5mol/L NaCl 溶液，混勻后再加入0.2ml CTAB/NaCl 溶液，65水浴中溫育20min。第8頁，共37頁，2022年，5月20日，23點45分，星期二5、加入與菌液等體積（1.6ml）的苯酚/氯仿/異戊醇混合液，用漩渦混合器混勻

5、，4000r/min離心10min。注意吸取混合液前將混合液充分振蕩混勻。6、取上層水相至無菌離心管，再加入等體積的氯仿/異戊醇混合液，用移液器反復(fù)吹打混勻，4000r/min離心10min。7、將上層水相轉(zhuǎn)移到另一個無菌離心管中，加入2l RNase A，37水浴中溫育30min。8、加入等體積的氯仿和異戊醇混合液，充分振蕩，抽提殘留在水相中的苯酚。4000r/min離心10min。9、將上清液移至新的離心管中。第9頁，共37頁，2022年，5月20日，23點45分，星期二10、加入上清液1/10體積的3mol/L NaAc溶液，以及上清液2倍體積的無水乙醇，顛倒混勻以沉淀DNA。室溫下靜置

6、10min，DNA形成白色（或淡黃色）絮狀沉淀。11、用移液器輕輕吸住白色絮狀沉淀，將其轉(zhuǎn)移到裝有適量75%乙醇的1.5ml離心管中。上下顛倒漂洗，洗去雜質(zhì)。7500r/min離心5min。12、去上清液，沉淀干燥后溶解于100l TE中。第10頁，共37頁，2022年，5月20日，23點45分，星期二 取10l提取的基因組DNA溶液加1.99ml水稀釋后測量OD260，蒸餾水作為空白，計算DNA產(chǎn)量（1 OD26050g DNA/ml）。 -20貯存其余基因組DNA，待下一實驗用作PCR反應(yīng)的模板。 DNA產(chǎn)量測定 第11頁，共37頁，2022年，5月20日，23點45分，星期二試 劑1、T

7、E：10mmol/L TrisHCl，1mmol/L EDTA2、CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）/ NaCl：將4.1g NaCl溶解 于80ml水中，緩慢加入10g CTAB，定容至100ml。3、苯酚/氯仿/異戊醇混合液：水飽和酚 : 氯仿 : 異戊醇 = 25 : 24 : 1（體積比）。4、氯仿/異戊醇混合液：氯仿 : 異戊醇 = 24 : 1（體積比）。5、10g/l RNase A 10% SDS 20 mg/ml 蛋白酶K 5mol/L NaCl 3mol/L NaAc 無水乙醇 75%乙醇。第12頁，共37頁，2022年，5月20日，23點45分，星期二第三部分 PCR擴(kuò)增組

8、 分 劑 量（l） 基因組DNA模板10-100ng10Taq Buffer34dNTP（各10mol/L）0.5上游引物（HEX標(biāo)記）1下游引物（HEX標(biāo)記）1Taq DNA聚合酶(2.5U/l)0.5dH2O（隨模板體積變化）總體積30第13頁，共37頁，2022年，5月20日，23點45分，星期二PCR反應(yīng)程序階段溫度時間 起始變性943min 變性9430s循環(huán)30次 退火6030s延伸7245s最后延伸7210min 第14頁，共37頁，2022年，5月20日，23點45分，星期二第四部分基因芯片雜交和檢測第15頁，共37頁，2022年，5月20日，23點45分，星期二每個陣列的探針

9、排布標(biāo)記有HEX的核酸（無標(biāo)記的大腸桿菌HSP70基因擴(kuò)增產(chǎn)物）（無標(biāo)記的黃單胞菌HtpG基因擴(kuò)增產(chǎn)物）50%DMSO第16頁，共37頁，2022年，5月20日，23點45分，星期二器材耗材軟件第17頁，共37頁，2022年，5月20日，23點45分，星期二實驗步驟（1）準(zhǔn)備芯片：去掉雜交圍欄上的膠紙，將雜交圍欄放在雜交模具中心的同樣形狀的凹槽中，膠面朝上，注意要使雜交圍欄與凹槽契合。用手捏著芯片上貼有標(biāo)簽紙的一端，將芯片另一端頂著模具的頂端，然后將芯片正面（貼有標(biāo)簽紙）朝下放入模具。在芯片背面相應(yīng)位置用鑷子輕輕向下按，使雜交圍欄緊貼在芯片上。第18頁，共37頁，2022年，5月20日，23點

10、45分，星期二撕去圍欄上的保護(hù)紙第19頁，共37頁，2022年，5月20日，23點45分，星期二貼 圍 欄第20頁，共37頁，2022年，5月20日，23點45分，星期二第四部分 實驗步驟（2）往雜交盒底部凹槽中均勻加入少量蒸餾水（約200l），以防止雜交過程中雜交液大量揮發(fā)。把芯片有雜交圍欄的一面朝上放入雜交盒中，按芯片擺放方向蓋上蓋片，注意使蓋片上的凸面朝下。蓋片芯片標(biāo)簽端蓋片正面觀第21頁，共37頁，2022年，5月20日，23點45分，星期二往雜交盒底部的凹槽中加水第22頁，共37頁，2022年，5月20日，23點45分，星期二將貼好圍欄的芯片放入雜交盒注意：圍欄朝上第23頁，共37頁

11、，2022年，5月20日，23點45分，星期二蓋上蓋片注意：蓋片的凸起面向下第24頁，共37頁，2022年，5月20日，23點45分，星期二第四部分 實驗步驟（3）雜交：將雜交液用移液器混勻后3000r/min離心30s，95熱變性3min。冰浴驟冷1min。用移液器將雜交液注入蓋片上的小孔。蓋上雜交盒的蓋板，兩側(cè)用兩個卡子扣上，確保雜交盒的密封性。在42水浴中雜交2小時。第25頁，共37頁，2022年，5月20日，23點45分，星期二加雜交液第26頁，共37頁，2022年，5月20日，23點45分，星期二蓋上盒蓋，插上卡子第27頁，共37頁，2022年，5月20日，23點45分，星期二放入恒

12、溫水浴中保溫第28頁，共37頁，2022年，5月20日，23點45分，星期二第四部分 實驗步驟（4）清洗：洗液先預(yù)熱至42。將芯片轉(zhuǎn)移到盛放洗液的清洗盒中，雜交面朝上，放在水平搖床上清洗。依次在洗液、中各清洗4分鐘。然后放在50ml錐形離心管中（標(biāo)簽紙端朝下），1500 r/min離心1分鐘以除去芯片表面的水分。（5）掃描及結(jié)果測定：啟動微陣列芯片掃描儀系統(tǒng)，進(jìn)行芯片掃描，保存檢測結(jié)果。 第29頁，共37頁，2022年，5月20日，23點45分，星期二清洗甩干第30頁，共37頁，2022年，5月20日，23點45分，星期二基因芯片掃描儀微陣列芯片掃描儀EcoScan100第31頁，共37頁，2022年，5月20日，23點45分，星期二基因芯片掃描儀工作原理第32頁，共37頁，2022年，5月20日，23點45分，星期二基因芯片掃描儀工作流程第33頁，共37頁，2022年，5月20日，23點45分，星期二軟件界面按鈕區(qū)狀態(tài)欄圖象顯示區(qū)控制區(qū)第34頁，共37頁，2022年，5月20日，23點45分，星期二大腸桿菌的檢測結(jié)果第35頁，共37頁，2022年，5月20日，23點45分，星期二黃單胞菌的檢測結(jié)果第36頁，共37頁，2022年，5月20日，23點45分，星期二試