實驗四、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草和擬南芥

1、實驗四、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草和擬南芥Arabidopsis thalianaNicotiana tabacum1選擇標(biāo)記基因與報告基因必備條件：編碼一種不存在于正常植物細(xì)胞中的酶基因較小能在轉(zhuǎn)化體中得到充分表達(dá)檢測容易，并且能定量分析選擇標(biāo)記基因與篩選標(biāo)記基因：npt-II 新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（卡那，新霉素，G418），aat（鏈霉素，壯觀霉素），spe（壯觀霉素），strl（鏈霉素），cat（氯霉素），bar（草苷膦）報告基因：report gene（篩選標(biāo)記之一）在轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中通過瞬時及穩(wěn)定表達(dá)檢測來確定轉(zhuǎn)化的DNA順序（基因）是否能在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中得到表達(dá)，起到報告的作用。gus基因（-葡萄糖苷酸

2、酶基因），gfp（綠色熒光蛋白基因）轉(zhuǎn)化目的基因可以省略附加的報告基因，但選擇標(biāo)記基因是不可缺少的。2植物基因轉(zhuǎn)化受體高效穩(wěn)定的再生能力較高的遺傳穩(wěn)定性具有穩(wěn)定的外植體來源對選擇性抗生素敏感對農(nóng)桿菌侵染有敏感性植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)類型：愈傷組織再生系統(tǒng)直接分化再生系統(tǒng)原生質(zhì)體再生系統(tǒng)胚狀體再生系統(tǒng)生殖細(xì)胞受體系統(tǒng)3植物遺傳轉(zhuǎn)化方法植物遺傳轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌介導(dǎo)法基因槍法PEG誘導(dǎo)原生質(zhì)體電穿孔法操作簡單，易造成原生質(zhì)體損傷雙子葉植物無宿主限制，技術(shù)限制原生質(zhì)體培養(yǎng)4轉(zhuǎn)基因方法農(nóng)桿菌侵染法 基因槍法5農(nóng)桿菌侵染法農(nóng)桿菌是一種天然的植物遺傳轉(zhuǎn)化體系對單子葉植物不敏感 根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌中細(xì)胞中分別含有

3、Ti質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒，其上有一段T-DNA，農(nóng)桿菌通過侵染植物傷口進(jìn)入細(xì)胞后，可將T-DNA插入到植物基因組中。6T-DNA整合植物基因組的分子機(jī)理T-DNA在植物染色體中的插入是隨機(jī)的，可插入任何一條染色體。插入位點特點：T-DNA優(yōu)先整合到轉(zhuǎn)錄活躍的植物基因位點T-DNA與植物DNA連接處富含A-T堿基對植物DNA上的插入靶位點與T-DNA邊界序列有一定程度的同源性。但在T-DNA的整合過程中常有植物基因組靶序列的缺失、倒位和重復(fù)等現(xiàn)象，T-DNA的整合一定程度上依賴于植物內(nèi)源重組系統(tǒng)。 總之，T-DNA的整合是通過植物靶DNA和T-DNA間短的同源區(qū)段發(fā)生重組而完成的，在接口附近伴有DNA

4、順序的轉(zhuǎn)換和重復(fù)。7真空浸透法轉(zhuǎn)化擬南芥受體材料擬南芥種子消毒與萌發(fā)，播種后生長出現(xiàn)花蕾后打頂，待側(cè)枝長出花蕾后，侵染前一天去除已開花蕾和果莢接種接種含有表達(dá)載體的農(nóng)桿菌GV3101克隆于5 mL YEP液體培養(yǎng)基(Rif 100 g/mL，Kan 50 g/mL)中，28 C，200 rpm振蕩培養(yǎng)過夜活化將過夜培養(yǎng)的菌液按照1:100的比例轉(zhuǎn)接到50 mL新鮮配制的YEP液體培養(yǎng)基(Rif 100 g/mL，Kan 50 g/mL)中，28 C，200rpm振蕩過夜培養(yǎng)至菌液OD600為1-2誘導(dǎo)收集菌體，重懸于浸染緩沖液(1/2MS，5%蔗糖，0.015% Silwet L-77)，將菌

5、液稀釋至OD600為0.6-0.8轉(zhuǎn)化將擬南芥花蕾倒置于裝有花浸染緩沖液的燒杯中，燒杯放置在真空罐中，0.5Mbar抽真空10 min培養(yǎng)將擬南芥植株平放在拖盤中，蓋上塑料膜，避光培養(yǎng)。12 d后去除塑料膜，培養(yǎng)至種子成熟8農(nóng)桿菌侵染瞬時轉(zhuǎn)化煙草接種接種含有表達(dá)載體的農(nóng)桿菌GV3101克隆于5 mL YEP液體培養(yǎng)基(Rif 100 g/mL，Kan 50 g/mL)中，28 C，200 rpm振蕩培養(yǎng)過夜活化將過夜培養(yǎng)的菌液按照1:100的比例轉(zhuǎn)接到50 mL新鮮配制的YEP液體培養(yǎng)基(Rif 100 g/mL，Kan 50 g/mL)中，28 C，200 rpm振蕩培養(yǎng)至菌液OD600為1

6、-2誘導(dǎo)5000 rpm離心5 min收集菌體，重懸于浸染緩沖液(1/2MS，5%蔗糖，乙酰丁香酮120mol/L)，將菌液稀釋至OD600為0.6-0.8侵染煙草組培苗葉片切成小塊，浸泡在菌液中侵染10min后，用無菌濾紙吸干葉片表面的菌液，置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基（MS+5%蔗糖+乙酰丁香酮120mol/L）上（252）暗培養(yǎng)條件下培養(yǎng)2d。9注射法瞬時轉(zhuǎn)化煙草受體材料種植本生煙(Nicotianabenthamiana)：25 C，16 h光照，約一個月后可用；在注射的前一天將煙草澆水并置于黑暗條件下；接種與活化小量培養(yǎng)農(nóng)桿菌16-24 h；按1:100轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)液(5 mL YEP，100 M

7、乙酰丁香酮(Aldrich)，10 mM MES(pH 5.6)，Rif 100 g/mL，Kan 50 g/mL）中，28 C16-24 h誘導(dǎo)當(dāng)菌搖到OD6001.0時，5 000 rpm 10 min收集菌體，用溶液(5 ml 10 mM MgCl2，7.5 L 100 mM乙酰丁香酮)重懸農(nóng)桿菌至OD6001.0，室溫靜置至少3 h侵染用1 ml注射器注射煙草葉片，避光培養(yǎng)約48 h后，Gus染色觀察10乙酰丁香酮Vir區(qū)基因的活化直接調(diào)控著T-DNA的轉(zhuǎn)移，酚類化合物對Vir區(qū)基因的活化具有重要作用。乙酰丁香酮（Acetosyringone，分子式:HOC6H2(OCH3)2COCH

8、3）AS： 遺傳轉(zhuǎn)化中常用的誘導(dǎo)能力較強(qiáng)的一種酚類化合物，乙酰丁香酮之所以能夠提高外植體的轉(zhuǎn)化頻率，是因為它可誘導(dǎo)農(nóng)桿菌Vir基因活化，從而促進(jìn)外源基因的整合。使用方法：在侵染前4-6h加入液體培養(yǎng)基，使農(nóng)桿菌既處于對數(shù)生長期，又處于vir基因高度活化狀態(tài)，從而提高侵染能力懸浮離心后用植物外植體培養(yǎng)基稀釋成侵染液時加入加在農(nóng)桿菌和外植體共培養(yǎng)的培養(yǎng)基中，一般農(nóng)桿菌附著16h后才能進(jìn)行轉(zhuǎn)化在農(nóng)桿菌液體培養(yǎng)基及共培養(yǎng)基中都加入AS11Silwet L-77 擬南芥、油菜等轉(zhuǎn)化必須試劑之一，原產(chǎn)地為美國GE公司，Silwet-L77高效有機(jī)硅表面活性劑，能夠極大的降低水的表面張力(水的表面張力為72

9、.4mN/m，0.1%的Silwet-L77系列有機(jī)硅溶液的表面張力約為21mN/m),這使Silwet-L77有機(jī)硅溶液可輕易濕潤幾乎所有種類的葉面,相對于傳統(tǒng)助劑,顯著提高了在靶標(biāo)生物的覆蓋面.同時，Silwet-L77有機(jī)硅助劑具有極強(qiáng)的耐水沖刷及滲透能力。Silwet-L77是擬南芥及其它作物常用的轉(zhuǎn)基因用表面活性劑。12植物瞬時表達(dá)系統(tǒng) 當(dāng)外源基因?qū)胫参锛?xì)胞中以后，其表達(dá)方式有瞬時表達(dá)（transientexpression）和穩(wěn)定表達(dá)（stable expression）兩種。 在瞬時表達(dá)狀態(tài)的基因轉(zhuǎn)移中，引入細(xì)胞的外源DNA和宿主細(xì)胞染色體DNA并不發(fā)生整合。這些DNA一般隨載

10、體進(jìn)入細(xì)胞后12小時內(nèi)就可以表達(dá)，并持續(xù)約80小時左右。在穩(wěn)定表達(dá)狀態(tài)的基因轉(zhuǎn)移中，導(dǎo)入宿主細(xì)胞的DNA整合到細(xì)胞染色體DNA上，以永久形式存在，并可傳給后代，形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。 植物瞬時表達(dá)系統(tǒng)在啟動子分析、基因功能分析和生產(chǎn)重組蛋白方面用途廣泛。13Gus基因gus基因來源于E.coli染色體上的uid A位點。編碼-葡萄糖苷酸酶。 -葡萄糖苷酸酶是一個水解酶，以-葡萄糖苷酸酯類物質(zhì)為底物，其反應(yīng)產(chǎn)物可用多種方法檢測出來。由于絕大多數(shù)植物沒有檢測到葡萄糖苷酸酶的背景活性，因此這個基因被廣泛應(yīng)用于基因調(diào)控的研究中。 根據(jù)gus基因檢測所用的底物不同，檢測方法有：組織化學(xué)法、分光光度法和熒光法。14操作要點侵染煙草葉片無菌操作注意事項抗生素