實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)傳代培養(yǎng)細(xì)胞Grb10的表達(dá)

1、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)傳代培養(yǎng)細(xì)胞Grb10的表達(dá)【摘要】目的建立一種可靠的Grb10印跡基因?qū)崟r(shí)熒光定量PR方法，檢測(cè)傳代培養(yǎng)鼠尾成纖維樣細(xì)胞中Grb10表達(dá)的差異。方法通過實(shí)時(shí)熒光PR，選擇適宜的“相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品繪制相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測(cè)傳代培養(yǎng)細(xì)胞中印跡基因Grb10的表達(dá)程度。結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線有較好的線性r=0.999及0.984；實(shí)時(shí)熒光定量PR方法檢測(cè)出隨著細(xì)胞培養(yǎng)代數(shù)的增加印跡基因Grb10表達(dá)程度上升。結(jié)論雙標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量PR法用于檢測(cè)Grb10的表達(dá)準(zhǔn)確可靠；傳代培養(yǎng)可能影響鼠尾成纖維樣細(xì)胞中印跡基因Grb10的表達(dá)程度?！娟P(guān)鍵詞】聚合酶鏈反響；等位基因；基因表達(dá)；蛋白質(zhì)類；

2、細(xì)胞，培養(yǎng)的；Grb10Grb10是母本等位基因特異表達(dá)的印跡基因，通過編碼特殊的銜接蛋白結(jié)合酪氨酸激酶受體，調(diào)節(jié)特定的信號(hào)傳遞過程。印跡基因表達(dá)的一個(gè)特點(diǎn)是依賴等位基因的親本來源，即優(yōu)先表達(dá)來自父本或母本的等位基因1。某一親本等位基因的沉默是通過染色體的表觀遺傳修飾來完成的，染色體的修飾對(duì)基因轉(zhuǎn)錄密不可分，主要包括DNA甲基化和組蛋白修飾。因此，檢測(cè)小鼠印跡基因Grb10在經(jīng)體外培養(yǎng)后表達(dá)程度的差異，是研究培養(yǎng)過程中表觀遺傳修飾影響印跡基因Grb10表達(dá)程度的重要基矗實(shí)時(shí)熒光定量PR是近年來使用的一種核酸檢測(cè)技術(shù)，因高準(zhǔn)確度、高靈敏性、污染少等優(yōu)點(diǎn)已在生物醫(yī)學(xué)、根底科研及醫(yī)學(xué)臨床中得到廣泛應(yīng)

3、用。它是利用每一模板的T值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存著的線性關(guān)系，來定量模板初始拷貝數(shù)，從而實(shí)現(xiàn)極為準(zhǔn)確的核酸定量檢測(cè)。綜合比擬實(shí)時(shí)熒光PR絕對(duì)定量和相對(duì)定量的各種方法，同時(shí)結(jié)合試驗(yàn)?zāi)康模P者采用一種新的實(shí)時(shí)熒光定量PR的方法來檢測(cè)印跡基因Grb10的表達(dá)，即通過適宜的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品、系列稀釋后構(gòu)建相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得與絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線一致的斜率。因?yàn)槎拷Y(jié)果只與曲線的斜率相關(guān)2，因此，可以實(shí)現(xiàn)比傳統(tǒng)的相對(duì)定量法2-T法更為準(zhǔn)確的定量結(jié)果，并且防止了絕對(duì)定量的復(fù)雜度和難度。1材料和方法1.2鼠尾成纖維樣細(xì)胞培養(yǎng)參照文獻(xiàn)3。剪約1鼠尾組織，消毒后用培養(yǎng)液反復(fù)沖洗，轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)皿，剪切至約111組織塊

4、，移入潮濕過的培養(yǎng)瓶，均勻擺布至瓶底，互相間隔 約0.5。輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，瓶底向上，參加1L培養(yǎng)液DE/F12，添加10%FBS和0.10.25%雙抗，輕晃動(dòng)使之分布均勻，置36.5溫箱倒置培養(yǎng)約48h，待其組織塊貼壁，再緩緩把培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)過來，讓培養(yǎng)液漸漸覆蓋已貼附瓶底的組織塊。培養(yǎng)約1周后，可見成纖維樣細(xì)胞從組織塊游離長(zhǎng)出，適當(dāng)添加培養(yǎng)液，獲得原代成纖維樣細(xì)胞。待其長(zhǎng)滿至約80%瓶底，連續(xù)傳代過程中搜集P1及P5細(xì)胞。1.3總RNA的提取與DNA的合成1.3.1總RNA的提取與定量搜集P1及P5細(xì)胞，重懸、計(jì)數(shù)、離心1200r/in，5in，沉淀中參加Trizl，吹打后參加三氯甲烷，離心12

5、00r/in，5in，沉淀參加丙醇；離心1200r/in，5in，乙醇洗滌，得到的RNA用焦碳酸二乙酯DEP水溶解，用紫外分光光度計(jì)定量，-80保存。1.3.2DNA合成選擇完好性良好的RNA樣本，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成DNA。20L體系中含總RNA100ng，5緩沖液4L，dNTPix10l/L2L，抑制劑(10l/L)1L，逆轉(zhuǎn)錄酶1L，lig(dT)1L，最后無RNA酶H2至20L。逆轉(zhuǎn)錄程序?yàn)椋?220in995in45in，DNA放-20待測(cè)。1.4.1相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建取2g待測(cè)樣本RNA逆轉(zhuǎn)錄成DNA，5倍系列稀釋后，得到標(biāo)準(zhǔn)品梯度濃度設(shè)為1，0.2，0.04，0.008，0.00

6、16，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品用于制作雙標(biāo)準(zhǔn)曲線的模板。1.4.2實(shí)時(shí)熒光定量PR使用擴(kuò)增儀，按照試劑盒說明書進(jìn)展，在20L反響體系中含2SYBRPreixExTaq10L內(nèi)含TaKaRaExTaqTHS，dNTPix，g2+和SYBRGreenI，50RXRefereneDye0.4L，上下游引物10l/L各0.2l/L，待測(cè)樣本的DNA或梯度濃度的定量模板。引物大小及其序列53：Grb10315bp上游：AGAAGTTTGGA下游：AGTATAGTATAGATGATGTTGGapdh150bp上游：TGTGTGTGTGGATTGA下游：TTGTGTTGAAGTGAGGAG1.4.3PR反響條件9510s

7、955s6034s，40個(gè)循環(huán)；9515s601in9515s。各待測(cè)樣本及各梯度濃度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品均做2個(gè)平行管，熒光定量分析軟件自動(dòng)繪制擴(kuò)增動(dòng)力曲線溶解曲線。通過溶解曲線分析實(shí)時(shí)熒光定量PR反響產(chǎn)物的純度以判斷實(shí)驗(yàn)的特異性。PR反響完畢后根據(jù)熒光定量分析軟件，算出各待測(cè)樣品的相對(duì)初始拷貝數(shù)。1.4.4驗(yàn)證PR擴(kuò)增產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳法，并于紫外燈下觀察擴(kuò)增片段大小及特異性。1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)以(xs)表示，采用SPSSVer13.0軟件。配對(duì)樣本t檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1電泳鑒定總RNA的完好性RNA電泳可見3條rRNA條帶，分別為28，18，5.8S(5S)，在紫外燈下亮度依次為28S18S

8、5.8S(5S)，且28S的亮度大致是18S的2倍，5.8S條帶弱圖1?？梢哉J(rèn)為所提取的RNA質(zhì)量好，未被降解，可用于實(shí)時(shí)熒光定量PR分析。圖1RNA的電泳結(jié)果略Fig1TheresultsfRNAeletrphresis2.2實(shí)時(shí)熒光定量PR反響1實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線圖2。S型的擴(kuò)增動(dòng)力曲線，有明顯的指數(shù)擴(kuò)增期、有平臺(tái)期，并且曲線起峰約在T值為21，整條曲線走行光滑，顯示擴(kuò)增結(jié)果理想。2溶解曲線圖3。分別顯示目的基因Grb10和內(nèi)參基因GapdhPR擴(kuò)增后的溶解曲線，其熔點(diǎn)峰分別位于88.6和85.9，峰形窄而尖，無雜峰，擴(kuò)增產(chǎn)物特異性良好。3標(biāo)準(zhǔn)曲線圖4。顯示5倍梯度稀釋的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)展PR擴(kuò)增后

9、，各自得到目的基因Grb10和內(nèi)參基因Gapdh標(biāo)準(zhǔn)曲線，直線擬合度良好，斜率(slpe)分別為-3.2062和-3.4673，其直線相關(guān)系數(shù)r分別為0.9838和0.9987，直線相關(guān)性好，可在較寬廣的范圍內(nèi)進(jìn)展定量分析。橫坐標(biāo)為循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度.圖2實(shí)時(shí)熒光定量PR擴(kuò)增曲線略2.3確認(rèn)PR產(chǎn)物于315bp和150bp處可見2條明晰電泳條帶，與理論值大小一致，其分別為目的基因Grb10和內(nèi)參基因Gapdh，此外未見其他雜帶圖5。2.4定量分析結(jié)果通過內(nèi)參基因Gapdh定量結(jié)果對(duì)目的基因Grb10定量值進(jìn)展歸一化處理后，以Grb10/Gapdh比值K表示基因Grb10表達(dá)程度，得到各樣本K值見表2。體外傳代培養(yǎng)過程中的鼠尾成纖維樣細(xì)胞P1和P5，其Grb10表達(dá)程度分別為1.51010.1074和1.73260.0735，二者比擬有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P=0.042。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.a：Grb10；b：Gapdh.橫坐標(biāo)為溫度，縱坐標(biāo)為熒光變化速度圖3目的基因Grb10和內(nèi)參基因Gapdh溶解曲線略Fig3DissiatinurvefrGrb10andGapdha：Grb10;b：Gapdh.橫坐標(biāo)為相對(duì)表達(dá)量對(duì)數(shù)顯示，縱坐標(biāo)為t值.圖4目的基因Grb10和內(nèi)參基因Gapdh標(biāo)