細菌內(nèi)毒素檢查標準操作規(guī)程

1、細菌內(nèi)毒素檢查標準操作規(guī)程1 簡述1.1 本規(guī)范適用于中國藥典2005年版附錄中細菌內(nèi)毒素檢查法一凝膠法和光度測定法。后者包括濁度法和顯色基質(zhì)法。供試品檢測時，可使用其中任何一種方法進行實驗。當測定結(jié)果有爭議時，除另有規(guī)定外，以凝膠法結(jié)果為準。1.2 供試品細菌毒素限值的確定。（一）藥典中有規(guī)定的，按供試品各論中規(guī)定限值；（二）尚無標準規(guī)定的，按以下公式確定供試品內(nèi)毒素限值：L=K/M式中L為供試品的細菌內(nèi)毒素限值，以EU/ml、EU/mg、EU/U表示。K為按規(guī)定的給藥途徑，人用每公斤體重每小時最大可接受的內(nèi)毒素劑量，以EU/kg/h表示。其中注射劑，K=5EU/kg/h；放射性藥品注射劑，

2、K=2.5EU/kg/h；鞘內(nèi)用注射劑，K=0.2EU/kg/h。M為人用每公斤體重每小時的最大供試品劑量，以ml/kg/h、ml/kg/h、U/kg/h表示。藥品人用最大劑量可參閱國家批準的藥品說明書和臨床用藥須知等權(quán)威著作，中國人均體重按60kg計算，注射時間小于1小時的按1小時計。按人用劑量計算限值時，如遇特殊情況，可根據(jù)生產(chǎn)和臨床用實際情況做必要調(diào)整，但需說明理由。1.3 供試品最大有效稀釋倍數(shù)的確定供試品的最大有效稀釋倍數(shù)（MV D）按下式計算：MV D=CL/L為供試品的細菌內(nèi)毒素限值；C為供試品溶液的濃度。當L以EU/ml表示時，C等于1.0ml/ml；當L的單位以EU/mg或E

3、U/U表示時，C為供試品制備成溶液后的濃度，單位為mg/ml或U/ml。如供試品為注射用無菌粉末或原料藥，則MV D取1，可計算供試品的最小有效稀釋濃度C: /L。在凝膠法中為鱟試劑的標示靈敏度，在光度測定法中為所使用的標準曲線中的最低內(nèi)毒素濃度。1.4 在使用新一批號的鱟試劑前，必須進行鱟試劑靈敏度復(fù)核實驗。1.5 藥典中已有規(guī)定的品種或有其他內(nèi)毒素檢驗標準的品種，可直接進行內(nèi)毒素檢查，如在檢驗中出現(xiàn)干擾的情況需再進行干擾實驗的驗證；其他未建立內(nèi)毒素檢查的品種需先進行干擾實驗，確定不干擾濃度后再進行內(nèi)毒素檢查。1.6 細菌內(nèi)毒素檢查過程中的陰性對照、陽性對照和供試品對照必須同時進行，否則實驗

4、結(jié)果無效。2 實驗材料及用具2.1 天平 供試品稱量用，精度為0.1mg以下。2.2 電熱干燥箱 除外源性內(nèi)毒素用，溫度應(yīng)能達到250。2.3 恒溫水浴箱或適宜的恒溫器（371）。2.4 水銀溫度計或酒精度計，精度在1以下。2.5 旋渦混合器。2.6 鱟試劑，應(yīng)具有國家主管部門的批準文號。2.7 細菌內(nèi)毒素國家標準品或細菌內(nèi)毒素工作標準品，除另有規(guī)定外，應(yīng)使用由中國藥典生物制品檢定所統(tǒng)一發(fā)放的標準品。2.8 凝膠法細菌內(nèi)毒素檢查用水系指內(nèi)毒素含量小于0.015EU/ml的滅菌注射用水。光度測定用的檢查用水，其內(nèi)毒素的含量應(yīng)小于0.005EU/ml。2.9 實驗用具 移液管（或刻度吸管、微量加樣

5、器及無熱原吸頭）、凝集管（10mm75mm）、三角瓶、試管試管架、洗耳球、時鐘、75%酒精棉、剪刀、砂輪。所用玻璃器皿須經(jīng)250干烤至少1小時。若使用塑料器械，如微孔板和與微量加樣器配套的吸頭等，應(yīng)選用標明無內(nèi)毒素并且對實驗無干擾的器械。2.10 細菌內(nèi)毒素光度測定儀器3 實驗準備3.1 玻璃器皿的洗滌 竟玻璃器皿放入鉻酸洗液或其他熱原滅活劑或清洗液中充分浸泡，然后取出將洗液空干，用自來水竟殘留洗液徹底洗凈，再用蒸餾水反復(fù)沖洗三遍以上，空干后放入適宜的密閉金屬容器中或用錫箔紙包好后再放入金屬容器內(nèi)，放置入烤箱。3.2 除去玻璃器皿表面可能存在的外源性內(nèi)毒素 玻璃器皿置烤箱后，將烤箱調(diào)至250，

6、待烤箱溫度升至設(shè)定的溫度后開始計時，干烤至少1小時。達到規(guī)定時間后，關(guān)斷電源，待烤箱溫度自然降至室溫。在不打開包裝的情況下，可在兩天內(nèi)使用；如果玻璃器皿用錫箔紙包裝，在不打開包裝的情況下可在兩周內(nèi)使用，否則再次干烤除去可能存在的外源性內(nèi)毒素。4 凝膠法操作方法4.1鱟試劑靈敏度復(fù)核鱟試劑靈敏度復(fù)核的目的不僅是考察鱟試劑的靈敏度是否正確，也是考察檢驗人員操作方法是否正確及實驗條件是否符合規(guī)定。因此要求每個實驗室在使用一批新的鱟試劑或試驗條件發(fā)生了任何可能影響檢驗結(jié)果的改變時，應(yīng)進行鱟試劑靈敏度復(fù)核實驗。4.1.1 實驗操作4.1.1.1 細菌內(nèi)毒素標準溶液的制備取細菌內(nèi)毒素國家標準品或工作標準品

7、一支，輕彈瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂輪在瓶頸上部輕輕劃痕，75%酒精棉球擦拭后啟開，開啟過程中應(yīng)防止玻璃屑落入瓶內(nèi)。按照標準品說明書，加入規(guī)定量的細菌內(nèi)毒素檢查用水溶解其內(nèi)容物，用封口膜將瓶口封嚴，置旋渦混合器上混合15分鐘。然后進行稀釋，制備成4個濃度的細菌內(nèi)毒素標準溶液，即2.0、0.5、0.25（為所復(fù)核的鱟試劑的標示靈敏度），每稀釋一步均應(yīng)在旋渦混合器上混合30秒鐘（詳細過程參見標準品使用說明書）。若使用的為細菌內(nèi)毒素國家標準品，可按其使用說明書中的方法將其稀釋至規(guī)定濃度后分裝、保存。若為細菌內(nèi)毒素工作品，為一次性使用。4.1.1.2 待復(fù)核鱟試劑的準備取0.1ml/支的鱟試劑18

8、支，輕彈瓶壁，使粉末落入瓶底，用砂輪在瓶頸輕輕劃痕，75%酒精棉球擦拭后啟開備用，防止玻璃屑落入瓶內(nèi)。每支加入0.1ml檢查用水溶解，輕輕轉(zhuǎn)動瓶壁，使內(nèi)容物充分溶解，避免產(chǎn)生氣泡。若待復(fù)核鱟試劑的規(guī)格不是0.1ml/支時，取若干支按其標示量加入檢查用水復(fù)溶，充分溶解后將鱟試劑溶液混合在一起，然后每0.1 ml分裝到10mm75mm凝集管中，要求至少分裝18管備用。4.1.1.3 加樣將已充分溶解的待復(fù)核鱟試劑18支（管）放在試管架上，排成5列，其中4列4支（管），1列2支（管）。4支（管）4列每列每支分別加入0.1ml的2、0.5和0.25的內(nèi)毒素標準溶液；另2支（管）加入0.1ml檢查用水。

9、4.1.1.4 加樣結(jié)束后，將鱟試劑用封口膜封口，輕輕振動混勻，避免產(chǎn)生氣泡，連同試管架放入371水浴或適宜恒溫器中，試管架保持水平狀態(tài)，保溫602分鐘。4.1.1.5 觀察并記錄結(jié)果。將試管架從水浴中輕輕取出，避免振動，將每管拿出緩緩倒轉(zhuǎn)180觀察，管內(nèi)形成凝膠，并且凝膠不變形，不從管壁滑脫者為陽性，記錄為（）；未形成凝膠或凝膠不能保持完整并從管壁滑脫者為陰性，記錄為（）。4.1.2 實驗結(jié)果計算如最大濃度2.04管均為陽性，最低濃度0.254管均為陰性，陰性對照為陰性時實驗為有效，按下式計算反應(yīng)終點濃度的幾何平均值即為鱟試劑靈敏度的復(fù)核結(jié)果（C）。C=lg-1(X/4)式中X為反應(yīng)終點濃度

10、的對數(shù)值（1g）。反應(yīng)終點濃度是系列濃度遞減的內(nèi)毒素溶液中最后一個呈陽性結(jié)果的濃度。4.1.3 結(jié)果判斷當C在0.5-2（包括0.5和2）時判定該批鱟試劑靈敏度復(fù)核合格，可用于干擾實驗和供試品細菌內(nèi)毒素檢查，并以（標示靈敏度）為該批鱟試劑的靈敏度。4.1.4 舉例設(shè)待復(fù)核鱟試劑的靈敏度為0.125EU/ml。實驗結(jié)果如下：內(nèi)毒素濃度 （EU/ml） 0.25 0.125 0.0625 0.031 Nc 反應(yīng)終點濃度X重 1復(fù) 2 管 3數(shù) 4 0.125 0.25 0.0625 0.0625C=lg-1(X/4)=lg-1（lg0.125lg0.25lg0.0625lg0.0625）/4 =0

11、.105（EU/ml）在0.5-2范圍內(nèi)，符合規(guī)定。并且使用該批鱟試劑時，其靈敏度為標示靈敏度0.105（EU/ml）。4.2 干擾實驗4.2.1 操作方法干擾試驗的目的是確定供試品在多大的稀釋倍數(shù)或濃度下對內(nèi)毒素和鱟試劑的反應(yīng)不存在干擾作用，為能否使用細菌內(nèi)毒素檢查法提供依據(jù)。并且驗證當供試品的配方和工藝有變化，鱟試劑來源改變或供試品陽性對照結(jié)果呈陰性時供試品是否存在干擾作用。由于干擾實驗檢驗的是在供試品存在的情況下內(nèi)毒素與鱟試劑的反應(yīng)是否正常，與所使用鱟試劑的靈敏度無關(guān)，因此在干擾實驗預(yù)實驗中原則上可使用任一靈敏度的鱟試劑。但建議使用較低靈敏度（如0.5或0.25EU/ml）的鱟試劑，可盡

12、量避免供試品所含的內(nèi)毒素對干擾實驗造成的陽性影響。4.2.2 干擾實驗預(yù)實驗預(yù)實驗的目的是初步確定供試品的最大不干擾濃度（當限值以EU/mg或EU/U活性單位表示）或最小不干擾稀釋倍數(shù)（當限值以EU/ml表示），為正式干擾實驗提供依據(jù)。4.2.2.1 將無可檢測到內(nèi)毒素的供試品進行一系列倍數(shù)的稀釋，但最大的稀釋倍數(shù)不得超過MV D=CL/0.03（0.03EU/ml為現(xiàn)今我國市售鱟試劑的最高靈敏度）。4.2.2.2 使用鱟試劑對每一稀釋倍數(shù)進行檢驗。每一稀釋倍數(shù)下做2支供試品管和2支供試品陽性對照（即用該濃度的供試品稀釋液將內(nèi)毒素標準品制成2濃度）。另取2支加入細菌內(nèi)毒素檢查用水作為陰性對照，

13、2支加入2濃度的內(nèi)毒素標準溶液作為陽性對照。供試品陽性對照制備舉例：制備稀釋倍數(shù)為4的供試品陽性對照液方法，取0.3ml濃度為4EU/ml的內(nèi)毒素標準液0.3ml的稀釋倍數(shù)為2的供試品稀釋液 制得0.6ml含2EU/ml內(nèi)毒素標準的稀釋倍數(shù)為4的供試品稀釋液。保溫602分鐘后，觀察并記錄結(jié)果。4.2.2.3 當陰性對照為陰性，陽性對照為陽性時，實驗為有效。當系列濃度中出現(xiàn)供試品溶液2管為陰性，供試品陽性對照2管為陽性時，認為供試品在該濃度下不干擾實驗，此稀釋倍數(shù)即為最小不干擾稀釋倍數(shù)。即可選擇該稀釋倍數(shù)進行正式干擾實驗。當系列濃度中所有濃度的供試品管都不為陰性，或供試品陽性對照不為陽性時，說明

14、供試品對內(nèi)毒素與鱟試劑的反應(yīng)存在干擾，則應(yīng)對供試品進行更大倍數(shù)稀釋（不得超過MV D=CL/0.03），或通過氣壓適宜的方法（如過濾、中和、透析或加熱處理等）排除干擾。當供試品的內(nèi)毒素限值單位為EU/mg或EU/U活性單位時，應(yīng)將最小不干擾稀釋倍數(shù)換算成最大不干擾濃度（即該稀釋倍數(shù)下溶液的濃度），以mg/ml或活性單位/ml表示。4.2.2.4 舉例例：設(shè)某注射液限值為2.5EU/ml，按MV D=CL/計算出靈敏度為0.03EU/ml下的MV D為80倍，將供試品溶液稀釋一系列檢驗，用靈敏度為0.25EU/ml的鱟試劑進行預(yù)實驗。結(jié)果如下稀釋倍數(shù)原液510204080供試品溶液供試品陽性對照

15、如上結(jié)果可初步確定該樣品的最小不干擾稀釋倍數(shù)為20倍，可在此濃度下進行正式干擾實驗。4.2.3 正式干擾實驗?zāi)康氖菣z驗在某一濃度下的供試品對于鱟試劑與內(nèi)毒素的反應(yīng)有無干擾作用。使用的供試品溶液應(yīng)為未檢驗出內(nèi)毒素且不超過所使用的鱟試劑的最大有效稀釋倍數(shù)的溶液。4.2.3.1 制備內(nèi)毒素標準對照溶液取1支細菌內(nèi)毒素標準品，用細菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋成4個濃度的標準溶液即2.0、0.5、0.25，（方法同4.1.1.1）。4.2.3.2 制備含內(nèi)毒素的供試品溶液4.2.3.2.1 將供試品稀釋至預(yù)實驗中確定的不干擾稀釋倍數(shù)，再用此稀釋液將4.2.3.1中的同支細菌內(nèi)毒素標準品稀釋成4個濃度即2.0、1

16、.0、0.5、0.25的含內(nèi)毒素的供試品溶液。以注射用頭孢哌酮鈉（1g/瓶為例：取10ml檢查用水溶解注射用頭孢哌酮鈉即為100mg/ml，設(shè)需將其稀釋20倍（5mg/ml）后備用。（注：凍干品或無菌粉末用檢查用水溶解后體積有無變化，根據(jù)具體情況定）。取一支細菌內(nèi)毒素標準品，加入1m檢查用水溶解，然后取內(nèi)毒素標準溶液0.3ml制備內(nèi)毒素標準對照溶液；再取內(nèi)毒素標準溶液0.3ml加上2.7ml的5mg/ml頭孢哌酮鈉溶液，即為含10倍內(nèi)毒素稀釋液的供試品溶液，取0.3ml含10倍內(nèi)毒素稀釋液的供試品加上2.7ml的5mg/ml頭孢哌酮鈉溶液，即為含100倍內(nèi)毒素稀釋液的供試品溶液。其余依次類推。

17、4.2.3.2.2 簡化法制備含內(nèi)毒素的供試品溶液：0.5ml濃度為1.0EU/ml的內(nèi)毒素標準溶液0.5ml濃度為10mg/ml的供試品溶液 得到1ml的含0.5EU/ml內(nèi)毒素的濃度為5mg/ml的供試品液。同理分別用0.5ml濃度為0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml的內(nèi)毒素標準溶液制備含0.25 EU/ml 、0.125 EU/ml 和0.0625m EU/ml 內(nèi)毒素的濃度為5g/ml的供試品系列溶液。（其體積的大小視情況而定）。4.2.3.3 鱟試劑的準備取規(guī)格為0.1ml/支的鱟試劑36支，輕彈瓶壁使粉末落入瓶底，用砂輪在瓶頸輕輕劃痕，75%酒精棉球擦拭后啟

18、開備用，防止玻璃屑落入瓶內(nèi)。每支加入0.1ml檢查用水溶解，輕輕轉(zhuǎn)動瓶壁，使內(nèi)容物充分溶解，避免產(chǎn)生氣泡。若待復(fù)核鱟試劑的規(guī)格不是0.1ml/支時，按其標示量加入檢查用水復(fù)溶，將復(fù)溶后的鱟試劑溶液混和在一起，然后每0.1ml分裝到1075mm凝集管中，要求至少分裝36管備用。4.2.3.4 加樣將準備好的鱟試劑18支（管）放在試管架上，排成5列，4列4支（管），1列2支（管）。其中的4支4列每列每支分別加入0.1ml的2.0、1.0、0.5、0.25的內(nèi)毒素標準對照液，另一列2支（管）加入0.1ml檢查用水作為陰性對照。將另外18支（管）鱟試劑放在試管架上，排成5列，4列4支（管），1列2支（

19、管）。其中的4支4列每列每支分別加入0.1ml的2.0、1.0、0.5、0.25的內(nèi)毒素的含供試品溶液；另一列2支（管）加入0.1ml供試品溶液作為樣品陰性對照。加樣結(jié)束后，用封口膜封口，輕輕振動混勻，避免產(chǎn)生氣泡，兩同試管架放入371水浴或適宜恒溫器中，保溫602分鐘后，觀察并記錄結(jié)果。4.2.4 實驗結(jié)果計算如兩組最大濃度2.0均為陽性，最低濃度0.25均為陰性，陰性對照4管均為陰性時，按下式計算用檢查用水制成的內(nèi)毒素標準溶液的反應(yīng)終點濃度的幾何平均值（ES）和用供試品溶液或稀釋液制成的內(nèi)毒素溶液的反應(yīng)終點濃度的幾何平均（Et）。ES=lg-1(XS/4)Et=lg-1(Xt/4)式中 X

20、S ,Xt分別為用檢查用水和供試品溶液或稀釋液制成的內(nèi)毒素溶液的反應(yīng)終點濃度的對數(shù)值（lg）。4.2.3 當ES在0.5-2.0（包括0.5和2.0）時，且Et在0.5 ES52.0 ES（包括0.5 ES和2.0 ES）時，則認為供試品在該濃度下不干擾試驗，可在該濃度下對此供試品進行細菌內(nèi)毒素檢查。當ES不在0.5-2.0（包括0.5和2.0）時，則認為供試品在該濃度下干擾實驗。應(yīng)使用適宜的方法排除干擾，如對供試品進行更大倍數(shù)稀釋，是排除干擾因素的簡單有效方法。建立新品種細菌內(nèi)毒素檢查方法時，每個廠家至少取三個批號（不包括亞批）的供試品，用兩個以上鱟試劑生產(chǎn)廠家的鱟試劑進行干擾實驗。4.2.

21、5 舉例設(shè)供試品為某注射液，預(yù)實驗中初步確定其最小不干擾稀釋倍數(shù)為20倍，使用靈敏度為0.125EU/ml的鱟試劑檢測供試品是否對內(nèi)毒素檢查存在干擾。內(nèi)毒素濃度（EU/ml）0.25 0.125 0.0625 0.03 Nc反應(yīng)終點濃度1 內(nèi)毒素標準濃度234 0.06250.06250.06250.06251 含供試品的2 內(nèi)毒素溶液34 0.1250.1250.1250.125ES=lg-1(XS/4) = lg-1(lg0.0625lg0.125lg0.0625lg0.0625)/4 =0.125（EU/ml）Et=lg-1(Xt/4) = lg-1(lg0.125lg0.125lg0.

22、125lg0.125)/4 =0.125 （EU/ml）Et在0.5 ES2.0 ES范圍內(nèi)，說明該供試品進行20倍稀釋后確已排除干擾作用，在低于或等于此濃度的情況下即可使用細菌內(nèi)毒素檢查法。4.3 供試品細菌內(nèi)毒素檢查凝膠限度試驗在細菌內(nèi)毒素檢查中，每批供試品必須做2支供試品管和2支供試品陽性對照，同時每次實驗必須做2支陽性對照和2支陰性對照。4.3.1 操作方法4.3.1.1 供試品溶液的制備首先計算MV D=CL/、L的意義同1.3。為所使用鱟試劑的標示靈敏度。然后將供試品進行稀釋，其稀釋倍數(shù)不得超過MV D。4.3.1.2 陽性對照溶液的制備用檢查用水將內(nèi)毒素標準品稀釋制成2濃度的內(nèi)毒

23、素標準液。（方法同4.1.1.1）。4.3.1.3 供試品陽性對照溶液的制備用待檢測的供試品溶液或其稀釋液將內(nèi)毒素標準品制成2濃度的內(nèi)毒素溶液。（方法同4.2.1.3.2供試品陽性對照溶液的制備）。4.3.1.4 陰性對照液即細菌內(nèi)毒素檢查用水4.3.1.5 鱟試劑的準備取規(guī)格為0.1ml/支的鱟試劑8支，輕彈瓶壁使粉末落入瓶底，用輪在瓶頸輕輕劃痕，75%棉球擦拭后啟開備用，防止玻璃屑落入瓶內(nèi)。每支加入0.1ml檢查用水溶解、輕輕轉(zhuǎn)動瓶壁，使內(nèi)溶物充分溶解，避免產(chǎn)生氣泡。若使用的鱟試劑的規(guī)格不是0.1ml/支時，取若干支，按其標示量加入檢查用水復(fù)溶，充分溶解后將鱟試劑溶液混和在一起，然后每0.

24、1ml分裝到1075mm凝集管中，要求至少分裝8管備用。4.3.1.6 加樣 取8支（管）溶解好的鱟試劑，其中2支加入0.1ml供試品溶液或其稀釋液（其稀釋液不得超過MV D）作為供試品管，2支加入0.1ml陽性對照溶液作為陽性對照管（PC），2支加入0.1ml檢查用水作為陰性對照管，（NC），2支加入0.1ml供試品陽性對照溶液作為供試品陽性對照管（PPC）。4.3.1.7 將試管中溶液輕輕混勻后，用封口膜封閉管口，垂直放入371水浴或適宜恒溫器中，保溫602分鐘。保溫和取放試管過程應(yīng)避免受到振動造成假陰性結(jié)果。4.3.2結(jié)果判斷當陽性對照都為陽性、供試品陽性對照都為陽性且陰性對照都為陰性時

25、，實驗方為有效。若供試品管2管均為陰性，認為該供試品符合規(guī)定；如供試品2管均為陽性，應(yīng)認為不符合規(guī)定；如2管中1管為陽性，1管為陰性，按上述方法另取4支供試品管復(fù)試，4管中如有1管為陽性，即認為不符合規(guī)定。若第一次實驗時供試品的稀釋倍數(shù)小于MV D而結(jié)果出現(xiàn)2管均為陽性或2管中1管為陽性時，按同樣方法復(fù)試，復(fù)試時要求將其稀釋至MV D。4.3.3 舉例供試品為葡萄糖注射液，其內(nèi)毒素限值為0.5EU/ml，設(shè)所用鱟試劑的靈敏度為0.125EU/ml，MV D=CL/=0.5/0.125=4將樣品進行4倍稀釋，并做4倍稀釋下的供試品陽性對照。供試品供試品陽性對照陽性對照陰性對照結(jié)果是否有效有效結(jié)果

26、判斷該批葡萄糖注射液的內(nèi)毒素含量小于0.5EU/ml，符合規(guī)定4.4 凝膠半定量實驗半定量實驗是使用凝膠法估測供試品中內(nèi)毒素含量的方法。系利用供試品系列與鱟試劑反應(yīng)的終點濃度計算出供試品中內(nèi)毒素的含量。4.4.1 操作方法4.4.1.1 供試品系列的制備用檢查用水將供試品溶液從已確定的不干擾濃度或稀釋倍數(shù)下開始進行對倍稀釋，制備成2、4、8等N個濃度，但最大稀釋倍數(shù)不得超過MV D。N可根據(jù)實驗設(shè)計不同確定。4.4.1.2 內(nèi)毒素標準系列的制備用檢查用水將內(nèi)毒素標準品稀釋成4個濃度的標準溶液即2.0、1、0.5、0.25，（方法同4.1.1.1）。4.4.1.3 供試品陽性對照溶液的制備用已確

27、定不干擾濃度或稀釋倍數(shù)的供試品溶液將內(nèi)毒素標準品制成2濃度的內(nèi)毒素溶液。（方法同4.2.1.3.2供試品陽性對照溶液的制備）。4.4.1.4 陰性對照液即細菌內(nèi)毒素檢查用水。4.4.1.5 鱟試劑的準備取規(guī)格為0.1ml/支或分裝好的鱟試劑122N支，其他準備按正式干擾實驗項下的“鱟試劑準備”。4.4.1.6 將準備好的鱟試劑取其中10支（管）放在試管架上，排成5列，每列2支。其中4列每列每支分別加入0.1ml的2.0、0.5、0.25的內(nèi)毒素標準溶液，另一列2支（管）加入0.1ml檢查用水作為陰性對照。 將另外2N支（管）鱟試劑放在試管架上，排成N列，每列2支（管）。每列每支分別加入0.1m

28、l一個濃度的供試品溶液。另2支（管）加入0.1ml供試品陽性對照溶液作為供試品的陽性對照。4.4.1.7 將試管中溶液輕輕混勻后，用封口膜封閉管口，垂直放入371水浴或適宜恒溫器中，保溫602分鐘。保溫和取放試管過程應(yīng)避免受到振動造成假陰性結(jié)果。4.4.2 實驗結(jié)果計算如內(nèi)毒素標準系列最大濃度2均為陽性，最低濃度0.25均為陰性，陰性對照為陰性恭試品陽性對照為陽性時，按下式計算內(nèi)毒素標準溶液的反應(yīng)終點濃度的幾何平均值（t）和供試品系列溶液反應(yīng)終點濃度的幾何平均值（CE）。t=lg-1(Xt/2)CE=lg-1(X/2)式中 Xt為內(nèi)毒素溶液的反應(yīng)終點濃度的對數(shù)值（lg）。 X為供試品溶液的反應(yīng)

29、終點濃度的對數(shù)值（lg），反應(yīng)終點濃度為供試品溶液每一系列平行管的終點，稀釋倍數(shù)乘以標志靈敏。4.4.3 結(jié)果判斷當t在0.52之間，試驗方為有效。供試品的內(nèi)毒素含量即為CE。如果實驗檢驗的是供試品的稀釋液，則計算原始溶液內(nèi)毒素濃度時要將結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)。如果試驗中供試品溶液的結(jié)果都為陰性，應(yīng)記為內(nèi)毒素濃度小于（如果檢驗的是稀釋過的供試品，則記錄為小于該供試品的最小稀釋倍數(shù)）。如果結(jié)果都為陽性，應(yīng)記為內(nèi)毒素的濃度大于或等于最大的稀釋倍數(shù)乘以。若內(nèi)毒素濃度小于規(guī)定的限值，判供試品符合規(guī)定。若內(nèi)毒素濃度大于或等于規(guī)定的限值，判供試品不符合規(guī)定。4.4.4 舉例設(shè)供試品為某注射液，干擾實驗已確定其最

30、小不干擾稀釋倍數(shù)為20倍，其內(nèi)毒素限值為10EU/ml，現(xiàn)使用靈敏度為0.03EU/ml的鱟試劑檢測供試品中的內(nèi)毒素含量。MV D=CL/=10/0.03320倍將供試品溶液先稀釋至20倍后，再進行對倍稀釋。將20倍稀釋液稀釋2、4、8、16倍，同時制備內(nèi)毒素標準系列。內(nèi)毒素濃度（EU/ml）0.0625 0.03 0.015 0.0075 Nc反應(yīng)終點濃度內(nèi)毒素標準溶液 0.06250.0625供試品稀釋倍數(shù) 1 2 4 8 16 PPC反應(yīng)終點稀釋倍數(shù)供試品系列 84t=lg-1(Xt/2) =lg-1 （lg0.0625lg0.0625）/2 =0.0625（EU/ml）CE=lg-1(

31、X/2) =lg-1 lg（80.03）lg（40.03）/2 =0.170EU/ml供試品20倍稀釋液的內(nèi)毒素含量=0.170EU/ml由于供試品先被稀釋了20倍，因此供試品的內(nèi)毒素含量為0.17020=3.40EU/ml，低于規(guī)定的內(nèi)毒素限值，此批注射液內(nèi)毒素檢查項符合規(guī)定。5 光度測定法操作方法光度測定法分為濁度法和顯色基質(zhì)法。濁度法系利用檢測鱟試劑與被毒素反應(yīng)過程中的濁度變化而測定內(nèi)毒素含量的方法。根據(jù)檢測原理，可分為終點濁度法和動態(tài)濁度法。終點濁度法是依據(jù)反應(yīng)混合物中的內(nèi)毒素濃度和其在孵育終止時的濁度（吸光度或透光率）之間存在著量化關(guān)系來測定內(nèi)毒素含量的方法。動態(tài)濁度法是檢測反應(yīng)混合

32、物的濁度到達某一預(yù)先設(shè)定的吸光度所需要的反應(yīng)時間，或是檢測濁度增加速度的方法。 顯色基質(zhì)法系列用檢測鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)過程中產(chǎn)生的凝固酶使特殊底物顯色釋放出的有色團的多少而測定內(nèi)毒素含量的方法。根據(jù)檢測原理，分為終點顯色法和動態(tài)顯色法。終點顯色法是依據(jù)反應(yīng)混合物中的內(nèi)毒素濃度和其在孵育終止時釋放出的有色團的量之間存在的量化關(guān)系來測定內(nèi)毒素含量的方法。動態(tài)顯色法是檢測反應(yīng)混合物的色度到達某一預(yù)先設(shè)定的吸光度所需要的反應(yīng)時間，或是檢測色度增長速度的方法。5.1 儀器的設(shè)置濁度法分為終點濁度法和動態(tài)濁度法，顯色基質(zhì)法也分為終點顯色法和動態(tài)顯色法。針對不同的方法，在配置相應(yīng)的測定儀器。在實驗來勢前，應(yīng)

33、根據(jù)儀器的說明和實驗的設(shè)計設(shè)定反應(yīng)時間，反應(yīng)溫度（一般為371），檢測波長等相關(guān)系數(shù)。供試品和鱟試劑的分裝加樣量、供試品和鱟試劑的比例以及保溫時間等，需參照所用儀器和試劑的有關(guān)說明進行。5.2 標準曲線的可靠性試驗當使用新批號的鱟試劑或試驗條件發(fā)生了任何可能會影響檢驗結(jié)果的改變時，需進行標準曲線的可靠性試驗。5.2.1 實驗操作5.2.1.1 細菌內(nèi)毒素標準溶液的制備用檢查用水將一支內(nèi)毒素標準品溶解稀釋，并制成至少3個濃度的稀釋液（相鄰濃度間稀釋倍數(shù)不得大于10），如10、1、0.1EU/ml或0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03EU/ml，但最低濃度不得低于所用鱟試劑的標示檢

34、測限。稀釋操作方法同凝膠法。5.2.1.2 鱟試劑的準備要求內(nèi)毒素標準系列中每一濃度至少做3支平行管，并要求同時做2支陰性對照。根據(jù)所制備的標準曲線中濃度的個數(shù)來計算所需要的鱟試劑體積。由于凝膠法鱟試劑和光度測定法鱟試劑在工藝上有所不同，因此在進行光度法檢測時需使用專用鱟試劑而不能用凝膠法鱟試劑代替。光度法鱟試劑都為0.5ml以上裝量，在溶解后需將所有鱟試劑混合在一起，備用。5.2.1.3 加樣將標準內(nèi)毒素溶液和陰性對照按儀器要求的體積分裝到儀器配置的反應(yīng)容器中，如小試管或微孔板。再加入要求體積的鱟試劑，輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡，然后將反應(yīng)容器放入光度測定儀中進行反應(yīng)。5.2.2 結(jié)果判斷當陰性

35、對照的反應(yīng)時間大于標準曲線最低濃度的反應(yīng)時間，將全部數(shù)據(jù)進行線性回歸分析。根據(jù)線性回歸分析，標準曲線的相關(guān)系數(shù)（r）的絕對值應(yīng)大于或等于0.980，試驗方為有效。否則須重新試驗。5.3 干擾實驗干擾實驗的目的同凝膠法干擾實驗。當鱟試劑、供試品的來源、配方、生產(chǎn)工藝改變或試驗環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗結(jié)果的變化時，須重新進行干擾實驗。5.3.1 實驗操作5.3.1.1 標準曲線的制備操作同5.2.1.1。5.3.1.2 將供試品進行一系列的稀釋，但不得超過MV D。選擇標準曲線中點或一和靠近中點的一和內(nèi)毒素濃度，設(shè)為m，作為添加到供試品中的標準內(nèi)毒素濃度?？砂慈缦路椒ㄖ苽涔┰嚻访恳幌♂尡稊?shù)下的樣品陽性對照：如使用的標準曲線為50、5、0.5、0.05EU/ml的標準系列，選擇0.5EU/ml濃度作為m。現(xiàn)需制備稀釋倍數(shù)為4的供試品陽性對照液?？扇?.3ml濃度為1.0EU/ml的內(nèi)毒素標準液0.3ml稀釋倍數(shù)為2的供試品稀釋液 制得0.6ml含0.5EU/ml內(nèi)毒素標準的稀釋倍數(shù)為4的供試品稀釋液。也可按儀器或試劑廠商提供的其他方法配制。5.3.1.3 鱟試劑的準備同5.2.1.25.3.1.4 加樣標準曲線每個濃度不小于2支平行管，供試品每個濃度不少于2支平行管，同時供試品每個濃度的樣品陽性對照也不少于2支平行管。并用檢查