細(xì)胞免疫熒光技術(shù)課件

1、細(xì)胞免疫熒光技術(shù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆彰庖邿晒饧夹g(shù)的基本原理熟悉細(xì)胞免疫熒光技術(shù)的方法了解在免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)中如何獲得好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)原理原位檢測抗原抗體特異反應(yīng)間接法 間接熒光抗體染色法示意圖抗原抗體熒光素標(biāo)記的抗抗體激發(fā)光顯示熒光Hela細(xì)胞Vinculin實(shí)驗(yàn)用品試劑：固定液：4%PFA細(xì)胞通透：0.2%TritonX封閉試劑：10%正常山羊血清一抗：小鼠源抗Vinculin單克隆抗體二抗:Alexa Fluor555標(biāo)記的山羊抗小鼠IgGDAPI（4,6-二脒基-2-苯基吲哚）PBS洗滌緩沖液：PH7.4材料：Hela細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)皿儀器：熒光顯微鏡實(shí)驗(yàn)步驟 一，細(xì)胞制備和細(xì)胞固定將細(xì)胞鋪在24孔

2、板中將細(xì)胞培養(yǎng)至所需密度加入4%PFA固定10min染色或保存PBS洗滌PBS洗滌實(shí)驗(yàn)結(jié)果三，觀察human HeLa cells 實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意的問題 細(xì)胞不要鋪的過密:60-70% 防止細(xì)胞污染 固定時(shí)間不要太長,一般10-30min TrionX處理時(shí)間不宜過長，膜蛋白可不必處理 選擇合適的封閉液 二抗孵育后,一定要洗干凈 必要時(shí)用恒溫?fù)u床搖洗免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)注意事項(xiàng) 選擇合適的方法 材料要留好 選擇抗體 選擇標(biāo)記酶 封閉液的選擇 設(shè)定對照實(shí)驗(yàn)思考題檢測Hela細(xì)胞中蛋白A定位情況，思考應(yīng)選擇什么方法，用什么儀器觀察？A疑難解答一，缺乏染色 可能的原因 無抗原 抗體失效 固定不充分 過度固

3、定 抗原修復(fù)無效 不兼容的二抗和一抗 漏用試劑或未按正確的順序 加入試劑相應(yīng)的措施 用原位雜交方法檢測蛋白表達(dá) 按說明書儲存抗體;分裝抗體;避免反復(fù)凍融 增加固定時(shí)間或改用不同的固定劑 減少固定時(shí)間;抗原修復(fù) 增加修復(fù)時(shí)間或更換修復(fù)液 使用可以與一抗結(jié)合的二抗 重復(fù)染色并確定使用的試劑和加入的順序 可能的原因 一抗或二抗的濃度過高 一抗和/或二抗與組織的 非特異性結(jié)合 組織過于干燥 試劑粘附在舊的 或未制備好的玻片上相應(yīng)的措施預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索最佳濃度一抗孵育前封閉 (最好是二抗來源的血清)在染色過程中避免組織干燥用新鮮制備或購買的玻片進(jìn)行實(shí)驗(yàn)三，細(xì)胞/組織的形態(tài)被破壞四，染色不正確 可能的原因 固定方法對于抗原不合適 抗原修復(fù)方法不合適 沒有及時(shí)固定引起抗原的擴(kuò)散 相應(yīng)的措施 嘗試不同的固