微生物大腸菌群檢測(cè)課件

1、衛(wèi)生細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)第五章 大腸菌群的測(cè)定衛(wèi)生細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)第五章 大腸菌群的測(cè)定 一、定義及范圍 大腸菌群（coliform group或coliform bacteria）: 在37度能發(fā)酵乳糖，在24小時(shí)內(nèi)產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧或兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌。包括大腸埃希菌屬、腸桿菌屬、檸檬酸桿菌屬、克雷伯菌屬的一部分及沙門菌屬的亞屬（發(fā)酵乳糖）組成。通常大腸埃希菌對(duì)靛基質(zhì)、甲基紅、V-P、枸椽酸鹽利用四個(gè)生化反應(yīng)分別為“+-”，稱為典型大腸桿菌，其它類的稱為非典型大腸桿菌。第一節(jié) 大腸菌群測(cè)定的衛(wèi)生學(xué)意義 一、定義及范圍 第一節(jié) 大腸菌群測(cè)定的衛(wèi)生學(xué)意義二、測(cè)定的意義1892年，沙爾丁格提出將大腸菌群

2、作為水質(zhì)糞便污染的指示菌（indicative bacteria）成人糞便中大腸桿菌有108-109個(gè)/g。二、測(cè)定的意義1892年，沙爾丁格提出將大腸菌群作為水質(zhì)糞便 適用于各種類型水的分析；是存在于腸道中的特有菌；當(dāng)腸道病原體存在的同時(shí)大腸菌群也存在；大腸菌群比最難對(duì)付的腸道病原體存活時(shí)間更長(zhǎng)，對(duì)外環(huán)境的抵抗力大于等于致病菌；進(jìn)入水中不再繁殖；檢驗(yàn)方法具有很強(qiáng)的特異性和高度敏感性檢驗(yàn)方法簡(jiǎn)便，易于操作、檢出和計(jì)數(shù)對(duì)人類無(wú)害指示菌的水平與被糞便污染程度有某些直接的聯(lián)系1.大腸菌群作為指示菌的特性 1.大腸菌群作為指示菌的特性 國(guó)際上如瑞士、瑞典等國(guó)以大腸菌群作為藥品、食品、飲水等的衛(wèi)生指示菌

3、。 以100mL水檢樣內(nèi)允許含有的大腸菌群的實(shí)際數(shù)值，以最大機(jī)率數(shù)（most probable number,MPN）來(lái)表示。其它糞便污染指示菌分支桿菌、擬桿菌、乳酸菌、梭狀芽孢桿菌、糞鏈球菌克雷伯菌、變形桿菌、副大腸桿菌 國(guó)際上如瑞士、瑞典等國(guó)以大腸菌群作為藥品、食品、飲水等的2. 不足之處飲用水在含有較少量大腸菌群的情況下，有時(shí)仍能引起腸道傳染病的流行；在一定條件下能在水中繁殖；在外界環(huán)境中，有的沙門菌比大腸菌群更有耐受力。2. 不足之處飲用水在含有較少量大腸菌群的情況下，有時(shí)仍能引3. 意義控制腸道傳染病的發(fā)生和流行反映檢樣受糞便污染的程度反映在生產(chǎn)各環(huán)節(jié)的衛(wèi)生狀況具有廣泛的衛(wèi)生學(xué)意義3

4、. 意義控制腸道傳染病的發(fā)生和流行檢樣稀釋乳糖膽鹽發(fā)酵管不產(chǎn)氣陰性報(bào)告產(chǎn)氣EMB、遠(yuǎn)騰氏等革蘭氏染色陰性報(bào)告革蘭氏陽(yáng)性革蘭氏陰性無(wú)芽孢乳糖發(fā)酵管不產(chǎn)氣產(chǎn)氣陽(yáng)性報(bào)告陰性報(bào)告膽鹽、或去氧膽酸鈉1、測(cè)定程序第二節(jié) 測(cè)定方法檢樣稀釋乳糖膽鹽發(fā)酵管不產(chǎn)氣陰性報(bào)告產(chǎn)氣EMB、遠(yuǎn)騰氏等革蘭2.多管發(fā)酵法測(cè)定方法發(fā)酵試驗(yàn)：在2個(gè)裝有50mL的3倍濃縮（三料）乳糖膽鹽蛋白胨培養(yǎng)液（含溴鉀酚紫指示劑）的大試管或燒瓶中，無(wú)菌操作加水樣100mL.在10支裝有5mL的三料乳糖膽鹽發(fā)酵管中（內(nèi)有倒置小管），以無(wú)菌操作各加水樣10mL,搖勻后，37度培養(yǎng)24小時(shí)。平板分離：將產(chǎn)酸產(chǎn)氣及只產(chǎn)酸的發(fā)酵管，接種于伊紅美藍(lán)（紫黑

5、色有金屬光澤）或遠(yuǎn)滕氏（淡粉紅色）、麥康凱（玫瑰紅色）瓊脂平板上，35-37度培養(yǎng)24小時(shí)。證實(shí)試驗(yàn)：將革蘭氏染色陰性無(wú)芽孢桿菌菌落接種于單料乳糖發(fā)酵管中， 35-37度培養(yǎng)24小時(shí)，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，即證實(shí)有大腸菌群存在。2.多管發(fā)酵法測(cè)定方法微生物大腸菌群檢測(cè)ppt微生物大腸菌群檢測(cè)ppt微生物大腸菌群檢測(cè)ppt水源水嚴(yán)重污染水：1，0.1,0.01,0.001mL中度污染水：10，1，0.1,0.01mL輕度污染水：100，10，1，0.1mL大腸菌群變異不大的水源水：10mL10份 接種量1mL及1mL以內(nèi)用單料乳糖膽鹽發(fā)酵管，接種量在1mL以上者，應(yīng)保證接種后發(fā)酵管中的總液體為單料培養(yǎng)液。水

6、源水大腸菌群檢索表（飲用水）陽(yáng)性管數(shù)每升水樣中大腸菌群數(shù)備注012接種水樣總量300mL(100mL 2 份，10mL 10份)03411138182713273111838414245251830706223692727431208315116193660230104069230大腸菌群檢索表（飲用水）陽(yáng)性管數(shù)每升水樣中大腸菌群數(shù)備注013.注意事項(xiàng)乳糖發(fā)酵試驗(yàn)分離培養(yǎng)證實(shí)試驗(yàn)三步中，初發(fā)酵與證實(shí)試驗(yàn)可能相差較大。抑菌劑如膽鹽等對(duì)大腸菌群中的某些菌株會(huì)有抑制作用。豬、牛、羊的膽鹽效果較好，去氧膽酸鈉對(duì)結(jié)果影響較大，膽鹽劑量以0.5%較適宜。挑選菌落時(shí)，EMB平板上，紫色菌落檢出率較高，紅色、

7、粉色較低；無(wú)典型菌落時(shí)，宜多挑選。有些在初發(fā)酵時(shí)產(chǎn)酸無(wú)氣的，復(fù)發(fā)酵時(shí)卻為陽(yáng)性，用手輕拍管壁，觀察有無(wú)氣泡上浮。3.注意事項(xiàng)乳糖發(fā)酵試驗(yàn)分離培養(yǎng)證實(shí)試驗(yàn)三步中，初發(fā)酵與1. 薄膜集菌法 薄膜集菌：取供試液333mL，以無(wú)菌薄膜過(guò)濾，將細(xì)菌截留在薄膜上。 培養(yǎng)檢查：將上述集菌的薄膜面向上平貼在品紅亞硫酸鈉瓊脂平板上，35-37培養(yǎng)24h，如有紅色發(fā)酵乳糖的革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌的菌落，再做乳糖發(fā)酵試驗(yàn)。 發(fā)酵試驗(yàn)：接種于乳糖蛋白胨半固體培養(yǎng)基上，37 6h-8h，產(chǎn)氣者為陽(yáng)性。第三節(jié) 快速檢測(cè)方法1. 薄膜集菌法第三節(jié) 快速檢測(cè)方法濾膜技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：重復(fù)性好，經(jīng)?？赡苤恍鑶我徊襟E，可在不同培養(yǎng)基

8、之間進(jìn)行轉(zhuǎn)移，可處理大量水樣，增加了分析的靈敏度，節(jié)省時(shí)間，較MPN法成本低。缺點(diǎn)：高混濁度的水限制了取樣的體積，背景細(xì)菌量較多，導(dǎo)致過(guò)度生長(zhǎng)，金屬和酚能夠吸附到濾膜上，抑制了微生物生長(zhǎng)。濾膜技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：重復(fù)性好，經(jīng)?？赡苤恍鑶我徊襟E，可在不2. Coli ID檢測(cè)法含有兩種顯色物質(zhì)，可以直接識(shí)別大腸菌（coliforms）群和鑒定大腸桿菌（Escherichia coli）,而不需附加任何試劑。抑制了革蘭氏陽(yáng)性菌和酵母菌，菌落顏色變化的敏感性完全適合食品微生物檢驗(yàn)。紅色菌落為大腸桿菌。藍(lán)色菌落為其它大腸菌群。 2. Coli ID檢測(cè)法含有兩種顯色物質(zhì)，可以直接識(shí)別大腸3.TTC（氯化

9、三苯四氮唑）顯色快速法（1）TTC乳糖培養(yǎng)基制備2%乳糖發(fā)酵管：乳糖、蛋白胨、水TTC培養(yǎng)液：蛋白胨、氯化鈉、磷酸氫二鈉、十二烷基磺酸鈉、水以無(wú)菌操作進(jìn)行分裝。（2）三料TTC乳糖培養(yǎng)基接種：接種1、0.1、0.01mL各三管于中，若接種量為10mL，則用三料TTC乳糖培養(yǎng)基。培養(yǎng)：35-3718-24h。結(jié)果判定：觀察有無(wú)紅色及產(chǎn)氣。3.TTC（氯化三苯四氮唑）顯色快速法（1）TTC乳糖培養(yǎng)基（3）注意事項(xiàng)產(chǎn)氣觀察要全面，小管是否堵塞，可輕拍有顏色的檢樣稀釋10倍后再接種蛋白胨的質(zhì)量要好十二烷基磺酸鈉可用洗衣粉替代（3）注意事項(xiàng)產(chǎn)氣觀察要全面，小管是否堵塞，可輕拍4 DC（去氧膽酸鈉）半固體

10、試管快速法制備DC培養(yǎng)基（綠色）：將配方中各固體成分加熱溶于水后，調(diào)pH7.2，加入指示劑和DC溶液，煮沸3min備用。接種：先加樣品，后注入培養(yǎng)基，充分混勻后，凝固后，3718-24h。結(jié)果判定：桔紅色，有氣泡產(chǎn)生或瓊脂裂，為陽(yáng)性，綠色則為陰性。4 DC（去氧膽酸鈉）半固體試管快速法5.紙片快速法制備培養(yǎng)基：營(yíng)養(yǎng)成分溶解并調(diào)完酸堿度后，加入指示劑溴甲酚紫，滅菌后加入TTC溶液。將新中華定性濾紙切成規(guī)定大小，滅菌后備用。將制好的培養(yǎng)基浸漬紙片，40烘干，備用。接種：取各稀釋度涂布于紙片上，3715h后觀察結(jié)果。結(jié)果判定：紙片上出現(xiàn)紫紅色菌落，周圍有黃圈者為陽(yáng)性。5.紙片快速法制備培養(yǎng)基：營(yíng)養(yǎng)成

11、分溶解并調(diào)完酸堿度后，加入指第四節(jié) 耐熱大腸菌群的測(cè)定1 耐熱大腸菌群的定義大腸菌群的細(xì)菌在自然環(huán)境中存在時(shí)，逐漸適應(yīng)25 ，在37培養(yǎng)仍可生長(zhǎng)，但將溫度升至44.5時(shí)，則不再生長(zhǎng)。而直接來(lái)自人、畜糞便中的大腸菌群，不僅在37正常生長(zhǎng)，在44.5也可繼續(xù)生長(zhǎng)，稱為糞大腸菌群（faecal coliform）；最近主張采用“耐熱大腸菌群”（thermotolerant coliform bacteria）。定義：在44-45能發(fā)酵乳糖的革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌，包括大腸埃希菌屬、腸桿菌屬、枸櫞酸菌屬、克雷伯菌屬。第四節(jié) 耐熱大腸菌群的測(cè)定1 耐熱大腸菌群的定義耐熱大腸菌群在衛(wèi)生學(xué)上具有更大的意義，它在人糞中占大腸菌群數(shù)的96.4%。耐熱大腸菌群在自然界中不生長(zhǎng)，除非在具有豐富營(yíng)養(yǎng)、溫度在13以上，無(wú)余氯的水中生長(zhǎng)，也可在工業(yè)污水、腐爛植物及土壤中發(fā)現(xiàn)。如果大腸菌群和耐熱大腸菌群均高，多為近期污染；如果大腸菌群數(shù)高，而耐熱大腸菌群低，則多為遠(yuǎn)期污染。2. 檢測(cè)的意義耐熱大腸菌群在衛(wèi)生學(xué)上具有更大的意義，它在人糞中占大腸菌群數(shù)乳糖發(fā)酵試驗(yàn)：